Untersuchung der RNS-Synthese mit 5-Bromouridine Kennzeichnung und Immunopräzipitation

Zusammenfassung

Diese Methode kann verwendet werden, um RNS-Synthese zu messen. 5-Bromouridine Zellen hinzugefügt und synthetisierte RNA eingebaut. RNA-Synthese wird durch RNA-Extraktion unmittelbar nach der Kennzeichnung, gemessen, gefolgt von 5-Bromouridine-gezielte Immunopräzipitation gekennzeichneten RNA und Analyse durch reverse Transkription und quantitative Polymerase-Kettenreaktion.

Zusammenfassung

Wenn Steady-State RNA-Ebene zwischen zwei Bedingungen verglichen werden, ist es nicht möglich zu unterscheiden, ob Änderungen durch Veränderungen in der Produktion oder Abbau der RNA entstehen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Messung der RNA-Produktion, mit 5-Bromouridine Kennzeichnung von RNA, gefolgt von Immunopräzipitation, die Untersuchung der RNA synthetisiert innerhalb eines kurzen Zeitraums (z.B. 1 h) ermöglicht. Der Vorteil von 5-Bromouridine-Kennzeichnung und Immunopräzipitation über die Verwendung von giftigen transcriptional Hemmer wie α-Amanitin und Actinomycin D ist, dass es keine oder sehr geringe Auswirkungen auf die Zellviabilität bei kurzfristigen Einsatz. Da 5-Bromouridine-Immunopräzipitation nur RNA produziert innerhalb der kurzen Kennzeichnung Zeit erfasst, langsam erzeugt sowie schneller abgebaut kann RNA jedoch schwierig, mit dieser Methode zu messen sein. Die 5-Bromouridine-gekennzeichnete RNA durch 5-Bromouridine-Immunopräzipitation erfasst kann durch reverse Transkription, quantitative Polymerase-Kettenreaktion und Sequenzierung der nächsten Generation analysiert werden. Alle Arten von RNA untersucht werden können, und die Methode beschränkt sich nicht auf mRNA zu messen, wie in diesem Beispiel dargestellt wird.

Einleitung

5-Bromouridine (BrU) Immunopräzipitation (IP) ermöglicht die Untersuchung der RNA-Produktion in Zellen ohne oder sehr begrenzte Auswirkungen auf die Zelle Physiologie während der kurzen Periode^1,2Kennzeichnung. Die Methode basiert auf Einbeziehung der synthetischen Uridin Ableitung BrU in neu synthetisierte RNA gefolgt von IP-Adresse des gekennzeichneten RNA mit Anti-BrU-Antikörpern (Abbildung 1).

Es ist bekannt für Jahrzehnte die Proteinsynthese transcriptionally geregelt werden kann, und die Existenz von Transkriptionsfaktoren wurde vor mehr als 50 Jahren die Hypothese³. Heute ist bekannt, dass verschiedene Krankheiten durch Dysregulation der Transkription und der Stabilität der RNA entstehen (ergänzende Abbildung S1 in Referenz⁴), und die Fähigkeit, Veränderungen in der Produktion von RNA zu messen ist von großer Bedeutung im Verständnis der Krankheit Entwicklung.

Auf der anderen Seite bieten Werkzeuge, RNA-Produktion zu regulieren neue Möglichkeiten für die Behandlung von Krankheiten, die durch zu wenig oder zu viel Protein-Expression oder Protein Akkumulation wie z. B. bei Morbus Parkinson (PD). Das vorherrschende Protein akkumulieren als unlösliche Aggregate in PD ist α-Synuclein und das Niveau der α-Synuclein knüpft direkt an die Krankheit, wie gen-Multiplikation des α-Synuclein Gens familiäre PD⁵verursacht. Darüber hinaus sammelt α-Synuclein in gewissem Sinne Konzentration abhängig. Herabregulation von α-Synuclein-mRNA-Niveaus ist daher eine interessante therapeutische Strategie, die erfolgreich erreicht worden ist, mit RNA-Interferenz, um neuronaler Zellverlust im PD Nager-Modelle^6,7zu verringern.

Es ist wichtig, um Änderungen in der RNA Produktion verursacht durch Krankheit oder therapeutische Interventionen zu messen können. Modernste Methoden verändert für Steady-State Messhöhen RNA, wie reverse Transkription, gefolgt von quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR), nicht in der Lage sind, die Unterscheidung zwischen Änderungen durch transcriptional Regelung oder RNA-Stabilität. Eine weit verbreitete Methode zur Untersuchung der RNA Zerfall Sätze blockiert der transkriptionellen Maschinen mit Verbindungen wie α-Amanitin oder Actinomycin D gefolgt von Messungen der verfallenden RNAs. Allerdings gibt es einige Probleme im Zusammenhang mit einer allgemeinen Blockade der Transkription in Zellen, wie Induktion der Apoptose^8,9. Neben der zytotoxischen Effekte präsentieren transcriptional Hemmer auch mehrere technische Probleme wie langsame zelluläre Aufnahme von α-Amanitin und mangelnde Spezifität von Actinomycin D (rezensiert in Referenz¹⁰).

Um die allgemeine Blockierung der Transkription zu vermeiden, wurden Nukleotidanaloga verwendet, z. B. 5-Ethynyl Uridin (5-EU) und 4-Thiouridine (4-TU) BrU. Diese sind leicht von Säugerzellen aufgegriffen und integriert neu synthetisierte RNA ermöglichen, Puls-Kennzeichnung von RNA innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens. BrU ist weniger toxisch als EU-5- und 4-TU, so dass es die bevorzugte Analogon zur Wahl^11,12.

BrU-IP kann verwendet werden, zu untersuchen, die bei RNA-Synthese und Stabilität, und somit zu unterscheiden zwischen den zugrunde liegenden Ursachen der Veränderungen im Gesamt-RNS. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Messung der RNA-Synthese und bezieht sich auf² für Details zur Untersuchung der Stabilität der RNA um zu verweisen. Um RNA-Synthese zu untersuchen, werden Zellen kurz mit BrU z.B. für 1 h, gefolgt von BrU-IP-¹ (Abbildung 1) gekennzeichnet. Dies ermöglicht Messungen der RNA synthetisiert innerhalb der kurzen Zeit der Kennzeichnung und beobachtete Veränderungen geben eine bessere Schätzung der Vorschriften in der RNA-Synthese als durch die Messung von Veränderungen im gesamten RNA durch RT-qPCR. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass obwohl die Kennzeichnung, z. B. nur 1 h dauert Abbau noch einen Einfluss auf die RNA-Ebenen beobachtet haben kann.

RNS von BrU-IP-Experimente eignen sich für nachgelagerte Analyse von RT-qPCR¹ oder nächste Generation Sequenzierung^2,13. Andere standard RNA Nachweisverfahren, wie Nordbeflecken oder Ribonuklease-Protection-Assay können auch für bestimmte RNAs gelten.

Protokoll

Hinweis: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben und halten Sie Puffer auf Eis oder in den Kühlschrank stellen (mit Ausnahme von der Elution buffer mit SDS). Das Protokoll ist in 5 Abschnitte unterteilt: Vorbereitung der RNA-Proben; Vorbereitung der Perlen für IP; Bindung von BrU gekennzeichnet RNA zu Perlen; Elutions- und Reinigung des gebundenen BrU gekennzeichnet RNA durch 3 Stufen Phenol-Phenol/Chloroform-Chloroform Extraktion; Analyse der RNA (in diesem Beispiel mit RT-qPCR)

1. Vorbereitung des RNA-Proben

1. Graf HEK293T Zellen unter Verwendung einer automatisierten Zelle entgegenzuwirken und Saatgut 3.500.000 Zellen in einer 10 cm Petrischale in 10 mL Wachstumsmedien (Dulbeccos geändert Eagle Medium ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum und 50 µg/mL Penicillin/Streptomycin) um insgesamt zu erhalten > 40 µg RNA bei der Extraktion 48 h später. Zellen bei 37 ° C und 5 % CO₂zu erhalten.
2. 48 h nach der Aussaat, Aspirieren Wachstumsmedien 8 mL und 2 mL auf die Zellen Austrocknen vermeiden hinterlassen. Fügen Sie 2 mM BrU und jede Behandlung auf die 8 mL aspiriert Wachstumsmedien, und entfernen Sie die restlichen 2 mL aus den Zellen vor erneuten 8 mL enthaltende Wachstumsmedien BrU. Vermeiden Sie den Einsatz von frischen Medien auf Antrag von der BrU an den Zellen, da diese Änderungen in der Genexpression zu induzieren.
3. Inkubieren Sie die Zellen 1 h mit BrU und Behandlung. Waschen Sie die Zellen in 5 mL Hank Puffer und trypsinize der Zellen unter Verwendung von 2 mL 0,05 % Trypsin. Fügen Sie 8 mL Wachstumsmedien um die Reaktion zu stoppen, die Zellen an eine 15 mL Tube übertragen und spin-down der Zellen für 2 min bei 1.000 x g hinzu.
4. Entfernen den überstand und Gesamt-RNS aus der Zelle Pellet mit RNA Isolierung extrahieren kit (siehe Tabelle der Materialien) oder jede andere Methode bevorzugt, und eluieren in RNase-freie H₂O. Store die RNA bei-80 ° C bis bereit zu gehen.

2. Vorbereitung von Perlen für IP

1. Die Anzahl der Samples zu untersuchenden plus eins extra abzurechnen Verlust beim pipettieren und wirbeln mischen bereiten Sie Perlen in Chargen vor. Aufschwemmen Sie Anti-Maus IgG magnetische Beads gründlich durch das Mischen von Wirbel und nehmen Sie 20 µL Perlen pro Probe in eine RNase-freie 1,5 mL-Tube. Ort der 1,5 mL Tube in einem Magnetstativ und lassen ca. 20 s für die Perlen auf der Seite zu sammeln.
2. Den überstand zu entfernen, nehmen Sie den Schlauch aus der Magnetstativ und Aufschwemmen in 400 µL 1 X BrU-IP-Puffer durch pipettieren. Drehen Sie das Rohr ganz kurz für 2 s in einer Zentrifuge Tischplatte legen Sie sie zurück in die Magnetstativ und den überstand zu entfernen. Wiederholen Sie die Waschschritt einmal.
3. Block unspezifische Bindung an die Perlen mit Heparin. Aufschwemmen der Perlen in 1 mL 1 X BrU-IP + 1 mg/mL Heparin Puffer und drehen für 30 min. waschen die Perlen einmal, wie in Schritt 2.2 verlassen.
   Hinweis: Heparin ist ein negativ geladenes Polymer, das für die Bindung mit RNAs konkurrieren. tRNA oder andere irrelevant RNAs können auch verwendet werden, wenn die nachgeschaltete Anwendung nicht Sequenzieren ist.
4. Aufschwemmen der Perlen in 1 mL 1 x BrU-IP-Puffer und 1,25 µg/Probe Anti-α-Bromodeoxyuridine Antikörper, der erkennt auch BrU hinzufügen. Inkubieren Sie die Perlen für 1 h beim Drehen, oder über Nacht bei Raumtemperatur.
5. Waschen Sie die Perlen dreimal wie in Schritt 2.2. Aufschwemmen der Perlen in 50 µL/Probe 1 X BrU-IP-Puffer mit 1 mM BrU und lassen drehen für 30 min, die Empfindlichkeit der Antikörper gebunden, die Perlen und hiermit zu senken das Risiko der unspezifischen Bindung UZ ergänzt.
6. Waschen Sie die Perlen dreimal wie in Schritt 2.2 und Aufschwemmen in 50 µL/Probe 1xBrU-IP-Puffer.

3. verbindliche BrU gekennzeichnet RNA, Perlen

1. RNA-Konzentrationen in der RNA-Auszüge aus Schritt 1.3 Messen mit Ultraviolett-sichtbare Spektrophotometrie, und 40 µg RNA von jeder Probe in RNase-freie H₂O auf ein Gesamtvolumen von 200 µL zu verdünnen.
2. Erwärmen Sie RNA-Proben für 2 min bei 80 ° C zu denaturieren RNA und Spin kurz in einer Tischplatte Zentrifuge. Fügen Sie 200 µL 2 x BrU-IP + BSA/RNAse-Inhibitor.
3. Fügen Sie 50 µL Nukleinsäuretablette und Perlen aus Schritt 2.6 zu jeder Probe vorbereitet und rotierenden 1H waschen die Perlen viermal wie in Schritt 2.2 zu verlassen.

4. Elutions- und Reinigung der RNA durch 3 Stufen Phenol-Phenol/Chloroform-Chloroform Extraktion

1. Eluieren Sie RNA und durchführen Phenol Extraktion
   1. Aufschwemmen der Perlen in 200 µL Elution Puffer zu eluieren RNA, und schnell Danach fügen Sie 200 µL Phenol, pH 6,6 (Vorsicht: giftig, siehe Hinweis unten Schritt 4.1.2), nicht-RNA-Moleküle aus der Probe zu entfernen.
   2. Whirl-Mischung der Probe und Spin 3 min bei 25.000 x g in einer Tischplatte Zentrifuge.
      Hinweis: Phenol ist giftig und sollte in einer Dampfhaube Verschleißschutz Haut behandelt werden. Die leicht saure pH-Wert sorgt dafür, dass nur RNA und nicht DNA extrahiert. Die RNA wird in der oberen wässrigen Phase aufgrund der hydrophilen Gebühren bleiben. Die hydrophobe Kerne von Proteinen werden Phenol zu binden und die untere Bio Phenol-Phase bewegen.
2. Phenol-Chloroform Extraktion durchführen
   1. Aspirieren Sie soviel obere Phase wie möglich (ca. 190 µL 200 µL, je nach Erfahrung im Handling) und verschieben Sie ihn auf ein Rohr mit 200 µL Phenol/Chloroform, pH 6,6 (Vorsicht: giftig, siehe Anmerkung). Achten Sie darauf, die gleiche Menge über Proben Aspirieren.
   2. Whirl Mischen der Probe und Spin für 3 min bei 25.000 x g.
      Hinweis: Chloroform ist giftig und sollte in einer Dampfhaube Verschleißschutz Haut behandelt werden. Chloroform wird hinzugefügt, Phenol, entfernen die nachgelagerte Analyse der RNA durch Hemmung der reversen Transkription¹⁴ und Polymerase-Kettenreaktionen¹⁵beeinflussen können.
3. Chloroform Extraktion durch Absaugen der oberen wässrigen Phase als vor (jetzt rund 180 µL) durchzuführen und zu einem Schlauch mit 200 µL Chloroform übertragen. Whirl mischen die Probe und spin 3 min bei 25.000 x g.
4. Aspirieren der oberen wässrigen Phase als vor (jetzt ca. 170 µL) und überträgt es auf ein Rohr mit 17 µL (1/10-bändige) 3 M CH₃COONa, pH 6.0. Fügen Sie zu neutralisieren und RNA aus der wässrigen Lösung auszufällen, 2 µL Glykogen (20 mg/mL), die Ausscheidungen zusammen mit RNA und RNA-Pellet sichtbarer macht.
5. Fügen Sie 500 µL 96 % Ethanol um Bindung zwischen den Salzionen und RNA und Mischung zu erhöhen durch Umdrehen der Röhre ein paar Mal. Lassen Sie das Röhrchen über Nacht bei-20 ° C oder 15 min auf Trockeneis.
6. Drehen Sie die Probe bei 25.000 x g, 4 ° C für 30 min. verwerfen überstand ohne zu stören das Pellet und waschen Sie das Pellet in 185 µL 75 % Ethanol, Salz zu entfernen. Mit 25.000 x g, 4 ° C für 5 min drehen.
7. Verwerfen Sie überstand vollständig zu, ohne zu stören das Pellet und lassen Sie das Pellet 5-10 min mit einem geöffnetem Deckel trocknen. Aufschwemmen Sie in 10 µL RNase-freie H₂O auf der Seite der Röhre angewendet, um nicht zu stören das Pellet.

5. Analyse der RNA

1. Bereiten Sie cDNA mit einer cDNA reversen Transkription kit (siehe Tabelle der Materialien) oder jede andere bevorzugte Methode mit 2 µL RNA-Probe und 1 µg Hefe Gesamt-RNS als Träger RNA für die cDNA-Synthese-Reaktion (nicht verwendet, wenn cDNA für die Sequenzierung der nächsten Generation verwendet wird). Verwenden Sie 1 µg RNA ohne Hefe RNA für cDNA Vorbereitung der entsprechenden Eingabe.
2. Verdünnte cDNA 01:25 und Mix 9 µL verdünnt cDNA mit 10 µL qPCR Mischung und 1 µL Fluorogenic Sonde, beherrschen beide angegeben in der Tabelle der Materialien.
   Hinweis: Die cDNA-Verdünnung richtet sich nach der cDNA Vorbereitung und qPCR-Methode verwendet.
3. Führen Sie das folgende qPCR-Programm (z. B. auf einem 7500 schnell Real-Time PCR System oder Äquivalent): 2 min bei 50 ° C, 20 s bei 95 ° C, 40 Zyklen von 3 s bei 95 ° C und 30 s bei 60 ° C.

Ergebnisse

Unsere ersten Tests der BrU-Kennzeichnung Zeit wurden AsPC-1-Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden für 0, 1, 2 und 4,5 h, gefolgt von insgesamt RNA-Extraktion und BrU-IP mit BrU behandelt. GAS5 und GAPDH wurden in BrU-IP-RNA, gemessen, die bewiesen, dass 1 h Kennzeichnung ausreichend, eine ca. 9 - und 44 - fache-Änderung im Vergleich zum Hintergrund (0 h) für GAPDH und GAS5, bzw. zu erreichen war.

BrU-IP und der oben beschr...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz des BrU-IP für Bestimmung der RNA-Produktion durch Kennzeichnung von neu RNA für 1 h mit BrU produzierten, gefolgt von sofortige RNA-Extraktion und Immunopräzipitation BrU gekennzeichnet RNA. Diese Methode ist bisher in Referenz¹⁶beschrieben worden, und dieser Artikel enthält einige zusätzliche Schritte, um IP-Spezifität und RNA Reinheit, von Pre-Behandlung von Perlen mit niedrigen Konzentrationen von BrU sowie eine Phenol-Chloroform Reinigungsstufe zu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ribolock Rnase inhibitor	ThermoFisher	EO0381
Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG	Life Technologies	11202D
α-Bromodeoxyuridine mouse antibody	BD Bioscience	555627
Nanodrop 1000	Thermo Fisher		Ultraviolet-visible spectrophotometry
Water-Saturated Phenol pH 6.6	ThermoFisher	AM9712
Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6	ThermoFisher	AM9732
High Pure RNA isolation Kit	Roche	11828665001
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher	4368814
Taqman Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher	4444557	qPCR Master Mix
Taqman RNA probes	ThermoFisher	SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1	Flurogenic probes
7500 Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystems
HEK293T cell line	ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Lonza	BE12-604F
Fetal calf serum	Biochrom	S0115
Penicillin/Streptomycin	Biochrom	A2213
Hank's buffer			5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved.
DEPC-H2O			0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O
2xBrU-IP Buffer			40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor			2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock
BrU-IP+ 1 mg/mL heparin			2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin
1xBrU-IP			2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock
Elution buffer			0.1% SDS in RNAse-free H2O