Eine Blut-basierte Test zum Nachweis von ROS1 und RET Fusion Transkripte von zirkulierenden Ribonukleinsäure mit digitalen Polymerase-Kettenreaktion

Zusammenfassung

Nachweis von zirkulierenden Ribonukleinsäure (cRNA) aus Blut besteht ein ungedeckter Bedarf in der klinischen Diagnostik. Hier beschreiben wir Methoden, die cRNA von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs-Patienten mit empfindlichen und spezifischen digitalen Polymerase-Kettenreaktion zu charakterisieren. Die Tests treffen Entwurfsanforderungen zu Fusion Varianten innerhalb von 72 Stunden zu erkennen.

Zusammenfassung

Wir haben neue Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von Tumor-abgeleitete zirkulierenden Ribonukleinsäure (cRNA) für Blut-basierten flüssigen Biopsie entwickelt. Robuste Erkennung von cRNA erholte sich von Blut stellt eine Lösung für ein kritischer ungedeckter Bedarf in der klinischen Diagnostik. Der Test beginnt mit der Sammlung von Vollblut in Blutentnahmeröhrchen, enthält Konservierungsstoffe, die cRNA stabilisieren. Zellfreie, Exosomal und Thrombozyten-assoziierter RNA ist in diesem Testsystem aus dem Plasma isoliert. Die cRNA ist umgekehrt zu komplementären DNA (cDNA) transkribiert und verstärkt mit digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR). Proben werden für die Ziel-Biomarker sowie ein Steuerelement gen ausgewertet. Testvalidierung enthalten maximal Erkennung, Genauigkeit und Robustheitsstudien mit analytischen Proben. Als Ergebnis dieser Studien reproduzierbar entwickelte Methode erkennen mehrere Fusion Varianten für ROS1 (C-Ros protoonkogenproduktes 1; 8 Varianten) und RET (neu geordnet, während Transfektion protoonkogenproduktes; 8 Varianten). Die Beispiel-Verarbeitung-Workflow wurde optimiert, damit Testergebnisse konsequent innerhalb von 72 Stunden nach Probeneingang generiert werden können.

Einleitung

Bis zu 25 % der nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) können Patienten nicht ausreichend Gewebe für den Test zum Zeitpunkt der Diagnose haben. Selbst in Fällen, in denen Gewebe verfügbar ist, kann es nicht genügend Quantität oder Qualität durchführen molekularbiologische Tests^1,2empfohlen werden. In Fällen wo es genügend Gewebe aus einer Biopsie für die molekulare Profilierung, Patienten müssen mehrere Wochen oder länger auf Ergebnisse warten, oder beginnen Sie die Behandlung ohne Molekulare Ergebnisse^3,4. Allerdings ist es wichtig, dass informative molekulargenetische Diagnostik zur Verfügung gegeben das Aufkommen von mehrere gezielte Behandlungsmöglichkeiten für Patienten mit NSCLC. Testen der zirkulierenden zellfreie DNA (Blut) aus flüssigen Biopsie ist eine Lösung für die Herausforderungen der traditionellen Gewebe testen^4,5,6. Aktuelle Testoptionen für umsetzbare Mutationen in NSCLC mit Blut und eine ähnliche dPCR-basierten Workflow für schnelles Ergebnis Generation gehören die epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) Sensibilisierung der Mutationen ΔE746-A750 und L858R, EGFR Widerstand Mutation T790M , KRAS protoonkogenproduktes (KRAS) Varianten und B-Raf protoonkogenproduktes (BRAF) Variante V600E. Obwohl nicht so weit vom Feld verabschiedet, bieten im Umlauf Tumor-abgeleitete Boten-RNA (mRNA) isoliert aus flüssigen Biopsie auch wichtige klinische Informationen^7,8,9. Wir haben zuvor entwickelt und berichtete über Multiplex Nachweismethoden der Echinodermen Mikrotubuli Associated Protein wie 4-anaplastische Lymphom-Rezeptor-Tyrosin-Kinase (EML4-ALK) Fusion Varianten von Blutplasma¹⁰. In dieser Studie haben wir diese Methoden, um höherer Ordnung gemultiplexten RNA ROS1 und RET, für acht Fusion Varianten innerhalb jedes Assay gehören erweitert. Ziel war es, eine schnelle, sensitive, spezifische und reproduzierbare Technik zum Nachweis dieser Fusion-Varianten aus dem Plasma von zuvor diagnostizierten Patienten mit NSCLC zu entwickeln.

Der Test wird in einer Arztpraxis mit RNA stabilisiert Blut Sammlung Röhren¹¹eingeleitet. Diese Rohre enthalten eine Zelle Konservierungsmittel sowie RNase-Hemmer. Proben sind gelieferte Priorität über Nacht auf die zentralisierte College der amerikanischen Pathologen CAP akkreditiert/klinische Labor Verbesserung Änderungsanträge (CLIA)-zertifizierten Labor (Clinical Laboratory) für die Verarbeitung durch kompetentes Personal. Sobald das klinische Labor erhalten, wird jeder Schritt der Verarbeitung unter zugelassenen Standard Operating Procedures (SOP) durchgeführt. Vollblut wird zentrifugiert, um Plasma, zu erholen, die dann verwendet wird, zu isolieren, zirkulierenden RNA, die entweder frei im Blut oder in Kapseln Moieties, z. B. exosomen und Blutplättchen^7,8,9. Zur Isolierung von RNA aus diesen Fächern wählten wir das System für die RNA-Wiederherstellung basiert auf dem Vergleich der verschiedenen Extraktionsmethoden. Die isolierte RNA ist konzentriert und umgekehrt in cDNA umgeschrieben. Verschiedene Enzyme Reverse Transkriptase und gen-spezifische Primer wurden bei der Optimierung der cDNA Synthese Methode, um zu maximieren ROS1 und RET Ziel Transkript Konvertierung¹⁰bewertet. Dies ist wichtig für niedrige Fülle Protokolle, wie z. B. Tumor-abgeleitete Fusion Varianten im Umlauf. Zu guter Letzt haben wir optimiert dPCR Primer und Sonde Konzentrationen für Multiplex Erkennung von RET oder ROS1 Fusion-Varianten und das Steuerelement gen, Glucuronidase-β (GUSB) ermöglichen. Vor der Durchführung der analytische Validierungsstudien in diesem Bericht beschriebenen wird dann die besten Bedingungen von jedem der Optimierungsstudien zu gesperrten Schlussprotokolls zusammengefasst. Dieses Protokoll und diese Ergebnisse bilden die Grundlage für eine rasche und sensible Workflow für den routinemäßigen Nachweis von seltenen Fusion Varianten im Umlauf.

Protokoll

Den Anweisungen des Herstellers Folgen für die unten aufgeführten, Reagenzien, sofern nicht anders beschrieben. Die PCR-Assays sind im Handel erhältliche Produkte entwickelt, um ROS1 und RET Fusionen zu erkennen.

1. Arbeiten mit RNA in Vorbereitung auf Reverse Transkription (RT)-dPCR: beste Laborpraxis

1. Erstellen Sie eine RNase-freie Umgebung, beim Arbeiten mit RNA.
   1. Verwenden Sie handelsübliche Sprays kontaminierenden RNases inaktivieren sollen.
   2. Verwendung zertifizierter RNase-freie Reagenzien, Tipps und Röhren. Verwenden Sie Barriere Tipps für Nadeln, um Einführung von RNases oder Kreuz-Kontamination der Proben zu verhindern.
2. Tragen Sie immer einen Laborkittel verhindern, dass Partikel von Kleidung in Ihrer Probe fallen. Benennen Sie eine Labor Mantel spezifische mit RNA-Verarbeitung verwenden.
3. Tragen Sie Handschuhe um Probe Verunreinigungen von RNases in der Haut zu verhindern. Ändern Sie häufig Handschuhe.
   Hinweis: Davon ausgehen Sie, dass Labor Oberflächen mit RNase verschmutzt sind, da sie die Umwelt ausgesetzt sind. Handschuhe, die Berührung der Haut, Haare, Türklinken, Gefrierschrank Griffe, Stifte/Marker, etc. werden als nicht mehr RNase-freie angesehen.
4. Nadeln, Arbeitsplatte, Zentrifugen und andere Arbeitsflächen mit einem RNase Inaktivierung Spray vor dem Gebrauch zu dekontaminieren.
5. Wenn möglich, pflegen Sie eine Reihe von Geräten für den Einsatz mit RNA nur.
6. Minimieren Sie Unterbrechung des Luftstroms in den Bereichen Labor, beim Arbeiten mit RNA-Proben, Partikel fallen in Proben oder Verunreinigung des Arbeitsbereichs zu verhindern.
7. Store gereinigt RNA bei-80 ° c.
8. Vermeiden Sie mehrere Einfrieren-Taut der RNA-Proben, da dies Verschlechterung führen kann.

2. Generation der analytischen RNA-Material für die Positivkontrollen

1. Entwerfen Sie synthetischen DNA veröffentlichten mRNA-Sequenzen für Fusion Varianten von Interesse¹⁰verwenden.
   1. Wählen Sie für einen gegebenen Fusion-Variante eine mRNA-Fusion-Sequenz, die die Fusion Website plus ausreichend lang auf jeder Seite zur Deckung der PCR-Amplifikate flankierende enthält.
   2. Wählen Sie Nukleotidsequenzen zwischen 50-250 nt, die Größe des zirkulierenden RNA mit Thrombozyten angereichertem Plasma erfasst zu imitieren.
   3. Hinzufügen eine T7-Promotor-Sequenz (5'-CAGAGATGCATAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 "), 5'-Ende der Zielsequenz.
2. Bestellen Sie synthetische Sequenzen, wie doppelte gestrandete Desoxyribonukleinsäure (DNA) Fragmente.
3. Bereiten Sie synthetischen DNA in Tris-EDTA (TE)-Puffer auf eine Endkonzentration von 10 ng/µL.
4. Konvertieren Sie 60 ng synthetische DNA in RNA mit in-vitro- Transkription.
5. RNA-Transkripte mit Phenol/Guanidin-basierte Reagenz¹²zu reinigen.
   1. Enthalten DNase I, RNase-freie, restliche Vorlage DNA zu entfernen.
6. Konzentration des gereinigten in Vitro RNA mit einem handelsüblichen Fluorometer mit RNA-spezifische Farbstoffe und Standards zu messen. Sicherstellen Sie, dass die RNA innerhalb des Bereichs für den gewählten Standards akzeptabel ist. Verdünnung kann erforderlich sein.
7. Bestätigen Sie erfolgreiche Transkription durch Gelelektrophorese mit ein 2 % Agarose-Gel gemischt mit RNA Gel Fleck und eine hohe Reichweite RNA Leiter einschließlich 50-250 nt Größenbereich.
   1. Belastung 500 ng des einzelnen in-vitro- RNA auf ein Gel.
   2. Führen Sie das Gel mit 5 V/cm.
   3. Visualisieren Sie einzelne Bands mit Beleuchtung zu und dokumentieren Sie die Ergebnisse.
   4. Bestätigen Sie die erwartete Transkript Größe für jede der Fusion-Varianten (basierend auf Design im Schritt 2.1.2).
8. Erkennung von jedes in-vitro- RNA durch RT-dPCR mit aufeinander abgestimmten Variante-spezifische PCR Assay zu bestätigen (siehe Schritte 5 bis 8 des Protokolls).
9. Optional: Bereiten Sie eine äquimolaren Mischung aus in-vitro- RNA, die jeweils von der Fusion-Varianten und die Kontrolle gen GUSB enthält.
10. Wenn Schritt 2,9 durchgeführt wird: Erkennung von jeder der Fusion Varianten enthalten in der Steuerelement-Mischung von dPCR mit Variante-spezifische PCR-Assays (siehe Schritte 5 bis 8 dieses Protokolls) zu bestätigen.
11. Ermitteln Sie gewünschte Eingabe Konzentration für analytische Positivkontrollen durch Konzentrationen von 0,25 bis 2,5 fg¹⁰Tests. Wählen Sie anhand der gewünschten Nummer Ausgabe Konzentration.
12. Bereiten Sie nach der Bestätigung 10 µL Einweg-Aliquote analytische RNA für die Verwendung in der Positivkontrolle (Schritt 4.4) und bei-80 ° c vor.

(3) Spender Exemplare

1. Sammeln Sie 10 mL menschlichen Vollblut-Proben in 10 mL Blutentnahmeröhrchen (BCT) mit Konservierungsstoff zellfreie RNA.
   Hinweis: Alle menschliche Spendern werden Einwilligung zur Nutzung zu erforschen und keine Spender-spezifischen identifizierenden Informationen werden gesammelt oder verwendet während des Tests.
2. Vollblut-Proben vom BCT Hersteller angegebenen Zeitrahmen zu verarbeiten.
3. Gepoolte normales Humanplasma kann eine kommerzielle Quelle für die Verwendung innerhalb der analytischen Positivkontrolle erhältlich. Bereiten Sie Einweg-, 1 mL Aliquots der gepoolten normales Humanplasma und bei-80 ° c für den Einsatz mit der Positivkontrolle (Schritt 4.4).

4. Wiederherstellung des zirkulierenden RNA aus Plasma

Hinweis: Es ist wichtig, schnell zu arbeiten, während dieses Vorgangs.

1. Zentrifugieren Sie Vollblut-Rohre bei 200 X g für 20 min.
2. Sammeln Sie bis zu 4 mL Plasma aus zentrifugiert Blut Sammelrohr mit einer serologischen Pipette. Achten Sie darauf, nicht zu stören oder zu Aspirieren die buffy Coat-Schicht.
3. Isolieren Sie zirkulierende RNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit, die exosomen, Thrombozyten und zellfreie RNA aus Plasma erfassen können. Isolieren Sie RNA von positive Kontrollprobe neben jeder Charge.
4. Bereiten Sie die positiv-Kontrolle für jede Charge von klinischen Proben wie folgt:
   1. Tauen Sie 1 mL gebündelt normales Humanplasma aliquoten (Schritt 3.3).
   2. Tauen Sie 10 µL analytische RNA aliquoten (Schritt 2,12).
   3. Bereiten Sie positive Kontrolle durch Zugabe von 10 µL analytische RNA in die normalen menschlichen Plasma-Probe, sobald das Plasma lysate Äthanol hinzugefügt worden.
5. Eluieren Sie Proben mit 100 µL Nuklease-freies Wasser. Gehen Sie sofort Aufräumen mit RNA und Konzentration.
   1. Proben können auf nassem Eis gespeichert und für bis zu eine Stunde abgedeckt werden.
6. RNA mit Spalte basierend Methode zu konzentrieren und eluieren in 9 µL RNase-freies Wasser.
   1. Gehen Sie sofort zu Schritt 5, oder halten Sie Proben auf nassem Eis bis zu einer Stunde.

(5) reverse Transkription von RNA in cDNA

1. Konvertieren Sie konzentrierten zirkulierenden RNS-Probe in cDNA mit einem handelsüblichen reversen Transkription Reaktion Kit, einschließlich zufällige Primer (siehe Tabelle 1 für Komponenten).
   Hinweis: Gen-spezifische Primer sind optional und können für Testvarianten ausgelegt werden. Primer sind anhand der Ziel-RNA-Sequenz ausgelegt. Verwenden Sie Fusion Variante Sequenzen aus Schritt 2.1.
   1. Enthalten keine Reverse-Transkriptase-Kontrollprobe und keine RNA-Kontrollprobe (siehe Tabelle 1).
2. CDNA aus reverse Transkription Reaktion unter Verwendung einer handelsüblichen DNA-Konzentrator Spin Spalte zu isolieren.
   Hinweis: Dieser Schritt erleichtert die Entfernung von Enzymen, Primer und kostenlose Deoxynucleotide Triphosphate (dNTPs).
3. CDNA in PCR-Reaktionen sofort verwenden oder bei-80 ° c lagern.

6. digitale PCR

Hinweis: Diese PCR ist spezifisch für Tröpfchen digitale PCR (siehe Tabelle der Materialien).

1. PCR Mischung Vorsichtsmaßnahmen.
   1. Tragen Sie ein Einweg-Labor Mantel und Nitril-Handschuhe.
   2. Verwendung PCR mix Reagenzien in einem dedizierten Reagenz-Vorbereitungsbereich. Umgehen Sie cDNA in der nur-Reagenz-Vorbereitungsbereich nicht.
   3. Decken Sie Sonden beim Arbeiten, um sie vor Licht zu schützen. Übermäßig viel Licht kann Foto bleichen die fluoreszierenden Farbstoff an der Sonde befestigt.
   4. Mixe, abgedeckt und vor Licht geschützt, in einem separaten Bereich der Vorverstärkung vor cDNA ist hinzugefügt werden.
   5. Fügen Sie cDNA zu prüfenden PCR Mischung in einer PCR cleane Motorhaube in Vorverstärkung Gegend gelegen.
2. Eine abschließende Reaktionsvolumen von 20 µL nach Tabelle 2PCR Mischungen vorbereiten.
3. Verteilen Sie PCR Mischungen + cDNA, PCR-Platten.
   Hinweis: Verwenden der Layoutbreite Platte wie ein Reiseführer empfohlen wird.
4. Decken Sie die Platte mit einer abnehmbaren Platte Versiegelung ab.
5. Zentrifugieren Sie Platten kurz zum Proben an der Unterseite der Brunnen zu sammeln.
6. Mix auf Platte Shaker auf eine niedrige Einstellung für 10 s.
7. Zentrifugieren Sie Platten kurz zur Probe an der Unterseite des Brunnens zu sammeln.
8. Entfernen Sie die Platte Sealer. Durchführen Sie Tröpfchen-Generation für PCR cDNA-Mix mit entweder eine manuelle oder automatisierte Droplet-Generation-System.
   1. Übertragen Sie für manuelle Tröpfchen Generation 20 µL PCR Mischung zum Beispiel Brunnen auf das Droplet Generation Patrone. 70 µL Tröpfchen Generation Öl hinzufügen. Deckel mit Kautschuk Dichtung und Transfer Patrone, manuelle tropfengenerators, Tröpfchen Generation zu initiieren. Übertragen Sie nach Tröpfchen Generation Tröpfchen auf ein frisches PCR-Platte mit Tipps vom Hersteller empfohlenen. Aspirieren und verzichten die Tröpfchen langsam, über 5 bis 6 s jeweils ohne die Öffnung der Spitze an den Tröpfchen Patrone oder Platte.
   2. Für automatisierte Droplet-Generation die Dichtplatte mit folienversiegelung und Übertragung auf das Droplet-Generator. Alle Tipps, Patronen, zu gewährleisten und Platten sind vor Beginn der Tröpfchen-Generation.
9. Folgenden Tröpfchen Erzeugung und Übertragung von Tröpfchen mit einer frischen PCR Platte Siegel mit Folie Platte Siegler und thermischen Zyklus Platten mit den Einstellungen in Tabelle 3.
10. Nach der Thermocycler läuft komplett, die Platte mit einem Tröpfchen-Reader zu lesen. Erstellen Sie eine Platte Layout für Reader-Software, die die Position der Steuerelemente, Proben, etc., identifiziert und Last in Software zu lesen beginnen.

7. Daten Analyse und Überprüfung und Generierung von Ergebnissen

1. Analysieren Sie Platte lesen Ergebnisse mit im Handel erhältlichen Software.
2. Navigieren Sie zum Menü "Analyze" zweidimensionale (2D) Amplitude Grundstücke anzeigen.
3. Bewerten Sie die Qualität der Daten anhand der Tröpfchen-Daten.
   1. Werten Sie die Daten für insgesamt akzeptierten Ereignis-IDs über Menü "Veranstaltungen". Wenn es weniger als 10.000 Ereignisse pro Bohrloch, prüfen Sie sorgfältig die Daten für zusätzliche Probleme.
   2. Überprüfen Sie Daten für aberrante Fluoreszenz Amplituden. Bedeutende Amplitude und Konzentrationsunterschiede zwischen replizieren Proben zeigen schlechte Verarbeitung oder Vermischung der Proben.
   3. Machen Sie sich Notizen von Tröpfchen Clustern mit Spritzbilder auf einer 45-Grad-Achse, was bezeichnend für schlechte Qualität Tröpfchen oder problematische Proben.
   4. Untersuchen Sie zunächst Positivkontrolle, No Reverse Transkriptase (No RT) und No-RNA-Kontrolle (NRC) Daten. Wählen Sie alle Kontrollproben und untersuchen Sie Cluster Qualität von 2D Grundstück. Für richtige Schnittstellenüberwachung sollte eine klare Trennung zwischen den Clustern Tröpfchen ersichtlich sein.
4. Für jede Probe setzen Variante, Sie den Schwellenwert basierend auf Kontroll-Vertiefungen.
   1. Festgelegten Schwellenwerte auf 2D Plots mit dem Fadenkreuz-Werkzeug, um die doppelte Verneinung Tröpfchen Bevölkerung aus der Kontrollgruppe gen (beschriftet mit 5'-Hexachloro-Fluorescein-CE phosphoramidit-Sonde), y-Achse und variant gen Bevölkerung zu trennen wenn präsentieren) beschriftet mit Fluorescein Amidite OR 6-Carboxyfluorescein Sonde), x-Achse.
   2. Summe aus jedes Replicate gut für ein einzelnes Sample kopiert.
   3. Express-Testergebnisse als die Anzahl der Varianten Kopien erkannt.
      Hinweis: Den analytischen cutoff Wert für den Aufruf einer positiven oder negativen Probe bestimmen ein normales laufen gesunden Spenders Probe (mindestens 10 Einzelproben) über das abgeschlossene Verfahren festgelegt und etablieren die Cutoff über nachweisbaren Hintergrundsignal für die Mutation von Interesse. Darüber hinaus legen Sie die Anzahl der Kontrolle gen Kopien benötigt, um ein positives oder negatives Ergebnis nennen. Kontrolle gen Grenzwertes fungiert als eine interne Qualitätskontrolle (QC) zu bewerten, die Quantität und Qualität jeder einzelnen RNA-Probe, die verarbeitet wird.

8. Überprüfung der RT-dPCR Reaktionsbedingungen mit Zelllinien (Optional)

1. Zur Erkennung von Fusion Varianten zu überprüfen, verwenden handelsübliche Zelllinien mit dem Ausdruck der ROS1 oder RET Fusion mRNA von Interesse. Gehen Sie folgendermaßen vor:
   1. Blitz-gefrorenen Zellen in einer Lyse Guanidinium-basierte Lösung direkt aus dem gefrorenen Zustand zu homogenisieren. Sogar kurze Auftauen vor der Homogenisierung kann dazu führen, dass RNA-Abbau und Verlust.
   2. Isolieren Sie RNA mit Silikon-Membran Spin Spalten für RNA konzipiert.
   3. Messen Sie die Konzentration von RNA-Proben mit einem Fluorometer mit RNA-spezifischen Reagenzien und Standards.
   4. Verdünnen Sie isolierten RNA in einen Hintergrund der Wildtyp RNA aus Plasma oder eine andere kommerzielle Quelle.
2. Führen Sie die Schritte aus Reverse Transkription von RNA in cDNA, digitale PCR und Datenanalyse und Überprüfung und Generation der Ergebnisse aufgelistet in diesem Protokoll Erkennung der gewünschten Variante zu bestätigen.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt ein Testsystem zum Nachweis von RNA-Fusion-Varianten für den Einsatz bei der Messung der Fahrer Mutationen innerhalb des Plasmas von NSCLC-Patienten (Abb. 1A) entwickelt. Fusion-mRNA, die Produkte aus dem Ausdruck der häufigsten RET und ROS1 Umstellungen in der NSCLC Bevölkerung wurden identifiziert,^{13,14,15,16,17}. Multiplex PCR-Assays wurden dann entwickelt, um die acht am häufigsten Transkript Varianten für jedes Ziel in NSCLC innerhalb einer einzelnen Reaktion zu erkennen. Die am häufigsten verwendeten Translokationen bei ROS1 Locus generieren Assoziationen an die 5' Teile der CD74, SDC4, SLC34A2, EZR oder TPM3 Gene (Abbildung 1B). Die am häufigsten verwendeten Translokationen bei der RET -Lokus führen zu Gegenüberstellung mit KIF5B, wofür deckt der Test sechs Exon Kreuzungen. Weitere RET -Partner, die behandelt werden sind diejenigen mit CCDC6 und TRIM33 (Abbildung 1C). Insgesamt decken die Assays ca. 88 % der ROS1 und 99 % der RET-Änderungen in der NSCLC Patientenpopulation¹⁷verbreitet.

Die Spezifität des Assays Komponenten war zunächst mit acht einzelnen in-vitro- RNAs, die die mRNA-Sequenz enthalten, für die Fusion Protokolle fallenden ROS1 oder RET Assays gemultiplext ausgewertet. Jede RNA-Spezies wurde gegen jede einzelne Variante Assay getestet, die die gebündelte Version umfasst. Gab es keine Kreuzreaktivität diese Assays, bewiesen damit 100 % analytische Spezifität innerhalb des gestalteten gemultiplext Assays (Daten nicht gezeigt). Um die untere Grenze der Erkennung von Prüfprotokoll zu ermitteln, wurden Gesamt-RNS abgeleitet von Zell-Linien mit dem Ausdruck einer Fusion-Variante in der Probe enthalten in einen Hintergrund des normalen RNA bei 5 %, 1 %, 0,2 % und 0,04 % Konzentrationen gemischt. Die Multiplex RET und ROS1 Variante PCR-Assays weniger als 0,2 % Fusion Variante (Abbildung 2A-B) erkannt. Darüber hinaus eine Vorbereitung von 5 % Ziel Zelllinie abgeleiteten RNA (Ausdruck eine EML4-ALK-Fusion-Transkript) nicht mit der gemultiplexten ROS1 und RET Assays erkannt wurde weiter demonstrieren Spezifität (Abbildung 2A-B).

Präzision des RT-dPCR Prozesses Tests wurden für beide ROS1 und RET Analytic Kontrollmaterial bestehend aus äquimolaren in-vitro- RNAs in drei Konzentrationen (hoch, Mittel und niedrig) durch reverse Transkription und dPCR auf drei verarbeitet wurde verschiedene Anlässe innerhalb des gleichen Tages (Intra-Day), an drei aufeinanderfolgenden Tagen (Inter-Tag) und mit zwei Operatoren (Inter-Operator). Ergebnisse aus Präzision Tests zeigten präzise Erkennung von der Fusion Abschrift von Interesse sowie eine Kontrolle gen, GUSB, die als eine interne QC-Metrik (Abbildung 2-D) enthalten ist.

Neben der internen Steuerung GUSB wurde jede Charge von klinischen Proben mit einem Satz von Steuerelementen Batch ausgeführt. Positivkontrolle wurde aus einer Mischung von analytischen in Vitro RNA, die jede der Fusion-Varianten getestet in RT-dPCR vertreten, sowie analytische in Vitro RNA für entwickelt GUSB. Diese RNA in normalen menschlichen Plasma lysate während der RNA-Extraktion gespickt war und neben der klinischen Proben im gesamten Protokoll verarbeitet wurde. Die keine Reverse Transkriptase (No RT) Kontrolle wurde eine Negativkontrolle zu bestätigen das Fehlen von kontaminierenden Material in der RNA-Extraktion-Workflow und demonstrieren die Spezifität der Primer für RNA. Das No RT-Steuerelement generiert wurde, mit dem gleichen Material wie die positive Kontrolle, aber Enzym innerhalb der cDNA Synthese Reaktion ist nicht enthalten. Der keine RNA-Steuerelement (NRC) ist ein negativ, das Fehlen einer Kontaminierung Transkripte in der reversen Transkription reaktionskomponenten zu bestätigen. Dieses Steuerelement in den Workflow bei der cDNA Synthese Schritt eingeführt wurde, und Wasser war in der Reaktion statt einer RNA-Vorlage hinzugefügt. Nr. RT und NRC Steuerelemente müssen negativ sein, in beiden Kanälen, wenn genaue Ergebnisse geliefert werden sollen. In Tabelle 1 sind die reverse Transkription reaktionskomponenten für jedes Steuerelement. Beispiele für die 2D Grundstücke für jedes dieser Steuerelemente sind für die ROS1 (Abbildung 3 A-C) und RET (Abbildung 3 E-G) Multiplex-Assays. Fusion-Varianten wurden mittels Fluorescein Amidite (FAM) Sonde erkannt und werden entlang der y-Achse dargestellt, während das Steuerelement gen, GUSB, mittels 5'-Hexachloro-Fluorescein-CE phosphoramidit (HEX) Sonde erkannt wurde und ist auf der x-Achse. Diese Batch-Steuerelemente wurden im Laufe der 21 Tage, um festzustellen, Assay Robustheit bewertet. Fusion positive Tröpfchen und GUSB Kontrolle gen Tropfen wurden ROS1 und RET in allen 21 Läufen ausgeführt im Laufe der Studie (Abbildung 3D, H) beobachtet. Alle Negativkontrollen (No RT und NRC) hat negative Ergebnisse ergeben, über die ganzen 21 Tage (Daten nicht gezeigt).

Die Fähigkeit zu beheben ist ein wichtiger Bestandteil jeder Test-Protokoll in der klinischen Laborumgebung ausgeführt werden. Hier bieten wir praktische Beispiele von Sub-optimale Ergebnisse mit dem RT-dPCR Protokoll. Die erste ist eine Beispiel-2D-Handlung zeugt von der Bedeutung des keine Reverse-Transkriptase-Steuerelements (Abb. 4A). In diesem Beispiel waren mutierte positive Tröpfchen anwesend, obwohl gab es keine cDNA-Konvertierung aufgrund des Fehlens von Enzym. Dieses Ergebnis war wahrscheinlich wegen dPCR Primer Ziel genomischen DNA verstärken. In diesem Fall wird Design ein Intron-spanning Assay Amplifikation genomischer DNA verhindern. Alternativ ein RNase-freie DNase-Enzym kann verwendet werden, um die kontaminierende DNA zu beseitigen, aber dies wird nicht empfohlen für die Erkennung von seltenen Ziele, wie einige RNA-Abbau während der Inkubation mit dem Enzym auftreten. Das nächste Beispiel 2D Grundstück war ein NRC mit positiven Tröpfchen in beiden Kanälen (Abbildung 4B). Dies Kontamination zu einem bestimmten Zeitpunkt in der RT-dPCR Einrichtung. In diesem Fall empfiehlt es sich, alle potentiell kontaminierten Reagenzien in der Prüfung zu verwerfen, gründlich alle Geräte zu dekontaminieren und Testwiederholungen mit frischen reaktionskomponenten. Das dritte Beispiel 2D Grundstück als ein Spray von Tröpfchen entlang einer 45°-Linie (Abb. 4C) dargestellt. Dies wird oft durch Schneiden und Zusammenfügen von Tröpfchen verursacht. Sorgfältige Handhabung vor Temperaturzyklen Tröpfchen ist wichtig, da Tröpfchen anfällig für Beschädigungen sind. Wir empfehlen die Verwendung von automatisierten Droplet-Generation, wenn verfügbar. Wenn Tröpfchen Übertragung manuell generiert werden, seien Sie sicher, wählen die empfohlene weite Bohrung Tipps und vorsichtig pipettieren Technik zu beschäftigen. Tröpfchen-Übertragung erfordert langsam Aspiration und Dosieren, mit jeder statt mehr als 5-6 Sekunden, und es ist wichtig, dass die Pipette Tipp Öffnung nicht die Tröpfchen-Patrone berühren oder gut. Bei der Abgabe, halten Sie die Pipettenspitze auf den Flüssigkeitsstand und erhöhen Sie es langsam zu, wie Tröpfchen verzichtet (Demo video ansehen). Das endgültige 2D Plot-Beispiel zeigt einen Mangel an Trennung zwischen den positiven und negativen Droplet-Populationen (Abbildung 4). Dies kann mehrere Ursachen haben. Strong PCR-Inhibitoren, wie z. B. Waschmittel in Lyse Puffer und ein Übermaß an stark geschädigter DNA, können der Trennung verloren gehen. In diesem Fall erwägen Sie, einen Bereinigung Schritt zwischen cDNA Synthese und dPCR (wie in Schritt 5 dieses Protokolls beschrieben). Zu guter Letzt kann fehlende Trennung auch sub-optimale Verstärkung bedingt, und Optimierung der PCR Schritt sollten ebenfalls berücksichtigt werden.

Daten in Abbildung 5 sind 984 realen Patienten probieren Sie Turn-around-Zeiten und zeigt die schnelle Natur dieses Test-Workflows. Ergebnisse wurden an den behandelnden Arzt so früh als innerhalb von 48 Stunden (79 % der Fälle) von Probeneingang und in 95 % der Fälle innerhalb von 72 Stunden berichtet. Zusammenfassend kann die Verwendung von bieten stabilisiert zirkulierenden RNA Blutentnahmeröhrchen, optimierte RNA-Extraktionsverfahren aus Blut und RT-dPCR laufen nach ein optimiertes Protokoll mit den entsprechenden internen und Batch-Steuerung, ein Schnelltest-System für die präzise Erkennung von Fusion RNA Varianten bei NSCLC.

Abbildung 1 : Überblick über Blut Verarbeitung Beispielschritte für Fusion Variante Erkennung bei NSCLC spezifisch Assays für die am meisten verbreiteten RET und ROS1 Varianten. (A) Stichproben wird eingeleitet, wenn Vollblut gezogen und ein BCT ist innerhalb der Probe Sammlung Kit im klinischen Labor versandt. Zirkulierenden RNA wird aus mehreren Quellen innerhalb der Thrombozyten angereichertem Plasma gewonnen, Rückseite mit Gen spezifische Priming transkribiert und für den Einsatz in dPCR gereinigt. Proben werden verarbeitet, mit einem im Handel erhältlichen System bestehend aus Tröpfchen Generation (Emulsion), Verstärkung und Tropfen zu zählen. Daten werden unter Verwendung handelsüblichen Software analysiert. Die Testergebnisse sind dann dokumentiert und berichtet an den Arzt Test anfordern. Der Prozess soll innerhalb eines Zeitraums von 72 Stunden nach Probeneingang Ergebnis Version arbeiten. Acht Varianten für ROS1 (B) und (C) RET sind innerhalb der Multiplex-Assays gedeckt. Adaptiert von Biodesix Website mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Analytische Validierung. Zelllinien mit dem Ausdruck (A) SDC4 ROS1 Fusion und (B) CCDC6-RET Fusion wurden in einem Hintergrund der gesamten menschlichen Wildtyp RNA (WT-RNA) verdünnt. Mit jeder Fusion-Variante wurde der Nachweisgrenze bei 0,2 % Variante Frequenz mit vordefinierten Kriterien für jede Variante Assay gegründet. Alle Proben oberhalb dieser Schwelle enthielt auch mindestens 21 Kopien des Gens Kontrolle. 5 % EML4-ALK (ALK) Standard in einem Hintergrund von Wildtyp RNA wurde getestet, um die Spezifität des Assays, unter Beweis zu stellen, die durch ein negatives Ergebnis bestätigt wurde. Analytische gemultiplexten RNA-Standards wurden gemessen am hohen, mittleren und niedrige Konzentrationen für ROS1 (C) und (D) i.r. Präzision wurde über drei Testläufe am selben Tag (Intra-Day), drei Runs an drei aufeinanderfolgenden Tagen (Inter-Tag) und mit ausgewertet zwei unabhängige Marktbeteiligte (Inter-Operator). Die Mittel der Kopienzahl und Standardabweichungen werden angezeigt. Adaptiert von Biodesix Website mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Batch-Verarbeitung Kontrolle Beispiele und Robustheit Daten. 2D Grundstück ROS1 gemultiplext Assay dPCR ergibt sich für positive Kontrolle (A), (B) keine Reverse-Transkriptase-Steuerelement, und (C) keine RNA-Vorlage-Kontrolle. (D) Kontrollen wurden an 21 aufeinanderfolgenden Tagen (außer an Wochenenden und Feiertagen) ausgeführt. Bedeuten Sie Exemplarzahl +/-Standardabweichung für positive Kontrolle wurden 439 + / 141 ROS1. Kein Reverse-Transkriptase und keine Vorlagensteuerelemente wurden auch jeden Tag laufen, und diese waren alle negativ (Daten nicht gezeigt). 2D Grundstück von RET gemultiplext Assay dPCR ergibt sich für Positivkontrolle (E), (F) keine Reverse-Transkriptase-Kontrolle und (G) keine RNA-Vorlage-Kontrolle. (H) Kontrollen wurden an 21 aufeinanderfolgenden Tagen (außer an Wochenenden und Feiertagen) ausgeführt. Bedeuten Sie Kopien + / Standardabweichungen für positive Kontrolle wurden 586 + 182 / RET. Nicht gezeigt werden keine Reverse-Transkriptase und keine Vorlagensteuerelemente, die waren auch jeden Tag laufen und waren alle negativ. Adaptiert von Biodesix Website mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : RT dPCR Fehlerbehebung. 2D plots vertreten suboptimalen dPCR Ergebnisse erzielt, wenn (A) innerhalb der keine reverse-Transkriptase-Kontrolle, (B) Kontamination innerhalb der keine RNA-Kontrolle, (C Kontamination) schneiden und Zusammenfügen von Tröpfchen und (D ) schlecht optimiert PCR-Zustände oder PCR-Hemmung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 : Turnaround-Zeit (TAT). TAT (in Stunden) für Tests anfordern eine RNA-Variante zusammengestellt wurde (n = 984). Daten ausschließt, Wochenenden, Feiertagen und Proben für statt > 24 h aufgrund von unvollständigen klinischen Informationen über Labor Testformen anfordern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1: Vorbereitung der reversen Transkription Reagenzien für Prozess-Steuerungen.

Komponente	Volumen
2 x dPCR Supermix für Sonden (keine 2' Deoxyuridine 5'-Triphosphat)	10 ΜL
20 X Variante Ziel Primer/Sonden eingestellt (450 Nmol/L Primer, 250 Nmol/L FAM Sonde)	1 ΜL
20 x Kontrolle Zielsatz Primer/Sonden (450 Nmol/L Primer, 250 Nmol/L HEX Sonde)	1 ΜL
Nuklease-freies Wasser	1 ΜL
cDNA	7 ΜL

Tabelle 2: Vorbereitung der master-Mix für dPCR.

Radfahren Schritt	Temperatur	Zeit	# Zyklen	Ramp-Rate
Enzym-Aktivierung	95 ° C	10 min	1	~ 2 oC/s
Denaturierung	94 ° C	30 s	40
Glühen/Verlängerung	55 ° C	1 min
Enzym-Deaktivierung	98 ° C	10 min	1
Halten (optional)	4 ° C	unendliche	1	~ 1 oC/s

Tabelle 3: Radsport Thermik.

Diskussion

RET und ROS1 Rearrangements bilden zusammen ~ 3 % der Mutationen innerhalb der NSCLC Bevölkerung¹⁸Fahrer. Obwohl selten, ist die Erkennung dieser genetischen Veränderungen entscheidend. NSCLC-Patienten mit diesen Änderungen können profitieren von zielgerichteten Therapeutika, die speziell die aberrante Kinase-Aktivität hemmen, die ergibt sich aus der Onko-Protein-¹³. Einige solcher Therapien sind bereits zugelassen von der FDA für den Einsatz in ROS1 positiven NSCLC, während andere nachgewiesen wirksam gegen RET in klinischen Studien¹⁹sein.

PCR-Digitaltechnik bietet Sensibilität, die ideal für flüssigbiopsie Anwendungen²⁰ist. Es gab erhebliche Verbreitung dieser Technologie für den Einsatz mit zirkulierenden zellfreie DNA für die Messung von Tumor-Mutationen bei Patienten mit NSCLC^4,6,21,22,23 . Neben Blut entwickelten wir ein Protokoll für robuste Messung der am weitesten verbreitete Fusion Varianten bei Patienten mit NSCLC von zirkulierenden Tumor RNA (Abb. 1A)¹⁰.

Unsere etablierte Protokoll ermöglicht analytischen Grenzen der Erkennung auf 0,2 % (Abbildung 2). Während der RT-dPCR sehr spezifisch und sensitiv ist, beschränken sich die Assays auf das Panel von bekannten Fusion-Varianten, die ausgewählt und gemultiplext zur Erkennung in der PCR-Test. Fusionen in Multiplex-Assays aufgenommen werden müssen so sorgfältig ausgewählt werden, um eine ordnungsgemäße Abdeckung innerhalb der Population von Patienten mit NSCLC gewährleisten. Wir haben erfolgreich Assays für RET und ROS1, die gleichzeitig acht Fusion Varianten Resultante von Umstellungen der RET oder ROS1 Loci zu erkennen und decken 99 % und 88 % der RET und ROS1 positiven Bevölkerung, bzw. entwickelt (Abbildung 1B-C )¹⁷.

Der Abschlusstest Workflow wie in dieser Studie beschrieben umfasst Batch Kontrollen zur Gewährleistung der Konsistenz der Ergebnisse. Diese Steuerelemente umfassen einen positiven analytische Standard sowie zwei negative Kontrollen, die gemeinsam dafür, dass es keine Kontamination oder PCR-Hemmung sorgen, die innerhalb der Charge (Abbildung 3). Um die Robustheit des Tests zu gewährleisten, wurde eine Studie durchgeführt mit der Batch-Steuerung über einen Zeitraum von 21 Tagen (Abbildung 3D, H). Diese Daten zeigen die Konsistenz des RNA-Prozesses, da innerhalb dieses Protokolls eingerichtet.

Gute Laborpraxis und angemessenen Umgang mit RNA sind Schlüsselkomponenten robuste und exakte Ergebnisse zu gewährleisten. Laborfläche und spezielle Ausrüstung mit RNA, Reinigung der Geräte nach jedem Gebrauch, mit RNase-freie Reagenzien und Verbrauchsmaterialien und eine RNase-Inaktivierung-Spray auf der Arbeitsoberfläche, die alle dazu beitragen, kontaminierenden RNases anzuwenden. Gewissenhafter Umgang mit RNA-Proben von Technikern, einschließlich einen dedizierten Laborkittel, häufige Handschuh, schnell durch die RNA-Extraktion-Verfahren arbeiten und halten Proben auf Eis sind von größter Bedeutung für die Erhaltung der Integrität der Probe. Sobald RNA transkribiert, cDNA umgekehrte gewesen ist, wird die Probe in stabiler Form, die weniger anfällig für Abbau. Neben der Praktiken, die Integrität der RNA zu unterstützen, werden PCR-Komponenten und Proben aufrechterhalten in getrennten Bereichen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, die zu falsch positiven Ergebnissen führen könnte. Lager PCR Reagenzien und Vorbereitung der PCR master Mix sollte getrennt von PCR Vorlagen gehalten werden und großer Sorgfalt ergriffen werden aus allen vorverstärkt Materialien einschließlich Reagenzien, RNA und DNA-Proben, verstärkte Vorlage (Post-PCR) zu trennen. Zu guter Letzt ist korrekte Generierung und Abwicklung von emulgierten PCR Mischungen vor Verstärkung von zentraler Bedeutung zur Erhaltung Tröpfchen Integrität und optimale dPCR Bedingungen. Während der Ausführung dieses Protokolls, konsistente und genaue Ergebnisse zu erzielen sind Vorsichtsmaßnahmen wie diese kritisch. Alle Daten sollten sicher sein durch geschultes Personal vor der Veröffentlichung der Ergebnisse untersucht werden, traf alle QC-Metriken. Bei suboptimalen Ergebnissen (Abbildung 4) die Charge überprüft werden, durch technisches Personal und der Laborleiter und erneute Verarbeitung erfordern.

RT-dPCR Ergebnisse können bereits 24 Stunden nach Probeneingang und 95 % der Ergebnisse in das Testset in dieser Studie verwendeten hergestellt werden (n = 984) wurde berichtet, der Bestellung Arzt in weniger als 72 Stunden ab dem Zeitpunkt des Eingangs (Abbildung 5). Dieser Turn-around-Zeit bietet Ärzten mit viel benötigt molekularen Informationen in einem Zeitrahmen, die Einleitung einer entsprechenden Therapie ermöglicht. Diese Ergebnisse stehen in der Regel früher als jene, die mit einem herkömmlichen Gewebeentnahme. Weitere Biomarker für NSCLC und anderen Krebsarten mit ähnlichen zirkulierenden RNA-basierten Ansätzen entwickelt werden könnte und würde profitieren von den gleichen schnellen Zeit-zu-Ergebnissen. Messung der programmierten Tod Liganden 1 (PD-L1) mRNA Abschrift mit RT-dPCR konnten beispielsweise Ärzte über Immuntherapie Optionen informieren. Außerdem gibt es ein wachsendes Interesse an den Nutzen des flüssigen Biopsie und dPCR bei der Überwachung der therapeutischen Wirksamkeit. Früheren Angaben von Wiederauftreten des Tumors mit genomischen Tests für bestimmte Varianten könnte Ärzten erlauben, Behandlungsschemata anpassen, bevor Patienten vom Standard der Pflegemaßnahmen wie imaging²⁴symptomatisch sind. Protokolle wie berichtet in dieser Studie sind ideal für Überwachung aufgrund ihrer nicht-Invasivität, Empfindlichkeit, schnelle Turn-around-Zeit und Preis-/Leistungsverhältnis. Die hier beschriebene Test liefert Ergebnisse innerhalb von 72 Stunden nach Probeneingang, mit minimalen falsch-Positive Erkennungsraten, die rasche Behandlungsentscheidungen erleichtert und umgeht einige Einschränkungen mit Gewebe-basierten Test⁴erlebt.

Unser Protokoll und Daten zeigen eine robuste Testsystem zur Identifizierung von niedrigen Fülle RNA Varianten sowie das Potenzial für blutbasierte Mutation Tests in der klinischen Praxis. Für jene Patienten, die nicht über eine nachvollziehbare Fahrer nähert Mutation identifiziert durch schnelle gezielte flüssigbiopsie wie dieser, die Zugabe von umfassender Genom und Proteom aus Gewebe und Blut testen noch breiteren klinische Informationen liefern kann Behandlungsplanung zu unterstützen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultrapure Distilled Water (DNAse, RNAse Free) (500 mL)	Life Technologies	10977-015	1604071
Ultrapure Distilled Water (DNAse, RNAse Free) (500 mL)	Life Technologies	10977-015	1809353
Nuclease-free water (molecular grade)	Ambion	AM9938	1604071
Nuclease-free water (molecular grade)	Ambion	AM9938	1606077
Phosphate Buffered Saline 1X, Sterile	Amresco	K812-500mL	1446C189
Phosphate Buffered Saline 1X, Sterile – 500 mL	Invitrogen	10010023	1916C092
RNase Zap (Life Tech) (250 mL)	Ambion	AM9780	353952
Beta-Mercaptoethanol (BME)  (250 mL)	CalbioChem	6050	W105B
OmniPur Ethyl Alcohol	CalbioChem	4455-4L	56054611
OmniPur Ethyl Alcohol	CalbioChem	4455-4L	56238638
Isopropyl Alcohol	VWR	0918-4L	2116C416
TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit	Thermo Scientific	K0441	403648
TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit	Thermo Scientific	K0441	288461
DNase I	Thermo	K0441	371299
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	54809699
20x TE buffer pH 8.0	Alfa Aesar	J62388	R13C548
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-100	552730
10x TBE buffer	Invitrogen	AM9863	353065
Cell-Free RNA BCT	Streck	218976	60110327
Cell-Free RNA BCT	Streck	218976	61900327
Cell-Free RNA BCT	Streck	218976	61480327
Cell-Free RNA BCT	Streck	218976	62320327
Plasma/Serum Circulating and Exosomal RNA Purification Kit (Slurry Format) 50 preps	Norgen	42800	585849
Plasma/Serum Circulating and Exosomal RNA Purification Kit (Slurry Format) 50 preps	Norgen	42800	588308
Lysis Buffer	Norgen	21205	A5F61E
RNA Cleanup and Concentration Micro-Elute Kit (Norgen) 50 preps	Norgen	61000	585848
RNA Cleanup and Concentration Micro-Elute Kit (Norgen) 50 preps	Norgen	61000	588309
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preps (samples)	Zymo	D4014	ZRC186976
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preps (samples)	Zymo	D4014	ZRC188077
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preps (samples)	Zymo	D4014	ZRC188413
Collection Tubes 500 pack	Zymo	C1001-500	N/A
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples)	Life Technologies	18091200	391657
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples)	Life Technologies	18091200	392504
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples)	Life Technologies	18091200	448001
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Life Technologies	18090200	451702
Qubit HS RNA Assay Kit (500)	Life Technologies	Q32854	1745264
Qubit assay tubes (500)	Life Technologies	Q32856	13416Q311
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023	64031651
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023	64063941
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023	64065740
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023	64065741
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023	64079083
ddPCR Buffer Control for Probes	Bio-Rad	1863052	64025320
ddPCR Buffer Control for Probes	Bio-Rad	1863052	64052358
gBlock KIF5B-RET K15:R12	IDT	151004172	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K16:R12	IDT	151004173	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K22:R12	IDT	151004174	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K23:R12	IDT	151004175	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K24:R11	IDT	151004176	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K24:R8	IDT	151004177	4-Oct-16
gBlock CCDC6-RET C1:R12	IDT	151004178	4-Oct-16
gBlock TRIM33-RET T14:R12	IDT	151004179	4-Oct-16
RET exon 8 RT Gene Specific Primer	IDT	150554385	28-Sep-16
5’-CTCCACTCACACCTG-3’	IDT	150554385	28-Sep-16
RET exon 11 RT Gene Specific Primer	IDT	150554384	28-Sep-16
5’-GCAAACTTGTGGTAGCAG-3’	IDT	150554384	28-Sep-16
RET exon 12 RT Gene Specific Primer	IDT	150554383	28-Sep-16
5’-CTGCCTTTCAGATGGAAG-3’	IDT	150554383	28-Sep-16
gBlock CD74-ROS1 C6:R34	IDT	152324366	15-Nov-16
gBlock CD74-ROS1 C6:R32	IDT	152324367	15-Nov-16
gBlock SDC4-ROS1 S2:R32	IDT	152324368	15-Nov-16
gBlock SDC4-ROS1 S2:R34	IDT	152324369	15-Nov-16
gBlock S13del2046-ROS1 S13del2046:R32	IDT	152324370	15-Nov-16
gBlock S13del2046-ROS1 S13del2046:R34	IDT	152324371	15-Nov-16
gBlock EZR-ROS1 E10:R34	IDT	152324372	15-Nov-16
gBlock TPM3-ROS1 T8:R35	IDT	152324373	15-Nov-16
ROS1 exon 34 RT Gene Specific Primer	IDT	152704983	21-Nov-16
5’-CCTTCCTTGGCACTTT-3’	IDT	152704983	21-Nov-16
ROS1 exon 35 RT Gene Specific Primer	IDT	152704985	21-Nov-16
5’-CTCTTGGGTTGGAAGAGTATG-3’	IDT	152704985	21-Nov-16
ALK Gene Specific Primer	IDT	140035422	26-Aug-16
5’-CAGTAGTTGGGGTTGTAGTCG-3’	IDT	140035422	26-Aug-16
EML4-ALK Cell line pellet	Horizon Discovery	N/A	11-Jun-15
SLC34A2-ROS1 Cell line pellet	Horizon Discovery	N/A	11-Jun-15
CCDC6-RET Cell line pellet	Horizon Discovery	N/A	11-Jun-15
Human Brain Total RNA	Ambion	AM7962	1703548
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K15:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K16:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K22:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K23:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K24:R11	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K24:R8	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: C1:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: T14:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: C6:R34	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: C6:R32	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S2:R32	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S2:R34	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S13del2046:R32	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S13del2046:R34	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: E10:R34	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: T8:R35	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
(version 2)	Bio-Rad	12003909	213939881
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: ROS1 Multiplex (version 3.2)	Bio-Rad	N/A	13-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: ROS1 Multiplex (version 3.2)	Bio-Rad	N/A	20170112v3.2
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	212851151
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	207383915
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	195995635
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	212851152
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	213949301
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: EML4-ALK	Bio-Rad	12003909	20160914
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: EML4-ALK	Bio-Rad	12003909	211383227
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	1065C220
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	64052953
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	64052358
Automated Droplet Generation Oil for Probes (20x96)	Bio-Rad	186-4110	1065C320
Automated Droplet Generation Oil for Probes (20x96)	Bio-Rad	186-4110	64052952
Automated Droplet Generation Oil for Probes (20x96)	Bio-Rad	186-4110	64064127
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	186-4008	C000065883
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	186-4008	C000084276
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	186-4008	C000079928
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	186-4008	C000084395
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	186-4008	C000084634
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad	186-3009	20160627
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad	186-3009	20161107
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad	186-3009	20161206
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad	186-3009	20161216
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad	186-3009	20170125
Pipet Tips for Automated Droplet Generator	Bio-Rad	1864120	PR125340
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator (10-96 well plates)	Bio-Rad	186-4108	206894
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator (10-96 well plates)	Bio-Rad	186-4108	206893
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040	1409850
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040	100402
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040	145851
Microseal 'B' seals	Bio-Rad	MSB1001	BR00428490
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	64039089
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	64049253
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	64049255
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	64081870
DNA Lo Bind Tube 0.5 mL	Eppendorf	22431005	E1629620
DNA Lo Bind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021	F16698K
DNA Lo Bind Tube 2 mL	Eppendorf	22431048	E160610I
50 mL Conicals, Polypropylene (25)	Thermo	339652	G5ZF5W8118
TempAssure PCR 8-Strips, Optical Caps, Natural, polypropylene (120)	USA Scientific	1402-4700	16202
For Rainin LTS Pipettors 0.5-20 µL tips	Pipette.com	LF-20	40155-642C4-642C
For Rainin LTS Pipettors 5-200 µL tips	Pipette.com	LF-250	40154-642C4-642B
Tips LTS 200 ul Filter 960/10 RT-L200F (10 boxes)	Rainin	17002927	1635
Pipet Tips, 10 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile	USA Scientific	1181-3710	F1175551-1108
Pipet Tips, 10 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile	USA Scientific	1181-3710	F118054L-1720
Pipet Tips, 100 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile (10x96)	USA Scientific	1180-1740	0014961Q-2501
Pipet Tips, 200 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile	USA Scientific	1180-8710	E116684P-1540
Pipet Tips, 1000 ul XL TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile (10x96)	USA Scientific	1182-1730	F118815P
5 mL Standard Racked Gilson-fit Reference Tips	Scientific Specialties	4411-00	14312
Combitips advanced, 0.1 mL Biopur	Eppendorf	003 008 9618	F165414H
Combitips advanced, 0.2 mL Biopur	Eppendorf	0030 089.626	F166689J
Combitips advanced, 5 mL Biopur	Eppendorf	0030.089 669	F166054J
Combitips advanced, 50 mL Biopur	Eppendorf	003.008.9693	F166055I
Reagent Reservoir	VWR	89094-680	141500
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear	Eppendorf	951020303	E163697P
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear	Eppendorf	951020303	F165029I
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear	Eppendorf	951020303	F165028G
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear	Eppendorf	951020303	E163697P
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Green	Eppendorf	951020346	F166183K
Equipment Type		Equipment ID
Analytical Balance		EQP0125
Cryogenic Freezer 1, -80oC		EQP0095
Refrigerator 6.1 cu ft GP06W1AREF		EQP0139
-20oC Freezer		EQP0140
Beckman Coulter Microfuge 22R		EQP0025
Beckman Coulter Microfuge 22R		EQP0124
Thermo Scientific Hereaus Megafuge 8		EQP0104
Mini Centrifuge		EQP0131
Mini Centrifuge		EQP0136
Mini Centrifuge		EQP0134
Mini Centrifuge		EQP0235
Mini Centrifuge		EQP0216
Thermo Scientific HeraTherm Incubator		EQP0105
Pipette 0.1 - 2.5 μL		EQP0182
Pipette 0.1 - 2.5 μL		EQP0072
Pipette 0.1 - 2.5 μL		EQP0070
Pipette 0.5-10 μL		EQP0218
Pipette 0.5-10 μL		EQP0075
Pipette 0.5-10 μL		EQP0169
Pipette 0.5-10 μL		EQP0074
Pipette 0.5-10 μL		EQP0147
Pipette 2 - 20 μL		EQP0128
Pipette 2 - 20 μL		EQP0160
Pipette 2 - 20 μL		EQP0018
Pipette 2 - 20 μL		EQP0146
Pipette 10 - 100 μL		EQP0079
Pipette 10 - 100 μL		EQP0181
Pipette 10 - 100 μL		EQP0085
Pipette 10 - 100 μL		EQP0077
Pipette 20 - 200 μL		EQP0088
Pipette 20 - 200 μL		EQP0087
Pipette 20 - 200 μL		EQP0231
Pipette 100 - 1000 μL		EQP0050
Pipette 100 - 1000 μL		EQP0158
Pipette 100 - 1000 μL		EQP0217
Pipette 100 - 1000 μL		EQP0082
Pipette 100 - 1000 μL		EQP0183
Pipette 100 - 1000 μL		EQP0083
Pipette 5 mL		EQP0153
Timer		S/N 140623950
Hamilton SafeAire VAV Fume Hood		EQP0206
Biosafety Cabinet		EQP0205
Biosafety Cabinet		EQP0204
Qubit 3.0		EQP0102
Benchmark Digital Heat Block		EQP0108
Benchmark Digital Heat Block		EQP0231
Polaroid Z2300 Instant Print Digital Gel Camera with WiFi and 16GB SDHC memory card		EQP0111
Electrophoresis Power Unit		EQP0113
Electrophoresis Small Gel Box		EQP0116
Maestro Transilluminator		EQP0118
Microwave		EQP0215
Multichannel 8-well Pipette 2 -  20 μL		EQP0207
Multichannel 8-well Pipette 10 - 100 μL		EQP0090
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL		EQP0094
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL		EQP0161
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL		EQP0162
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL		EQP0163
Vortex Genie 2		EQP0052
Vortex Genie 2		EQP0007
Vortex Genie 2		EQP0132
Vortex Genie 2		EQP0137
Vortex Genie 2		EQP0135
Air Clean PCR Workstation		EQP0203
Air Clean PCR Workstation		EQP0096
Air Clean PCR Workstation		EQP0148
Air Clean PCR Workstation		EQP0097
QX200 Droplet Generator		EQP0202
QX200 Droplet Generator		EQP0121
Automated Droplet Generator		EQP0179
PX1 PCR Plate Sealer		EQP0123
PX1 PCR Plate Sealer		EQP0186
C1000 Touch Cycler w/96W FS RM		EQP0120
S1000 Cycler w/96W FS RM		EQP0174
S1000 Cycler w/96W FS RM		EQP0173
T100 Thermal Cycler		EQP0180
T100 Thermal Cycler		EQP0175
QX200 Droplet Reader		EQP0194
QX200 Droplet Reader		EQP0122