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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll konzentriert sich auf Quantitative Analyse der neuronalen dendritischen Arborization Komplexität (NDAC) in Drosophila, die für Studien der dendritischen Morphogenese verwendet werden können.

Zusammenfassung

Dendriten sind die verzweigten Projektionen eines Neurons und dendritischen Morphologie spiegelt synaptischen Organisation während der Entwicklung des Nervensystems. Drosophila Larven neuronalen dendritischen Arborization (da) ist ein ideales Modell für das Studium Morphogenese der neuronalen Dendriten und Genfunktion in der Entwicklung des Nervensystems. Es gibt vier Klassen von da Neuronen. Klasse IV ist das komplexeste mit einem verzweigten Muster, die fast den gesamten Bereich der Larven Körperwand abdeckt. Wir haben bisher die Wirkung der Stummschaltung der Drosophila Ortholog der SOX5 Klasse IV neuronalen dendritischen Arborization Komplexität (NDAC) mit vier Parametern charakterisiert: die Länge der Dendriten, die Fläche der Dendrit-Abdeckung, die Gesamtzahl der Filialen und der Verzweigungsstruktur. Dieses Protokoll stellt den Workflow der NDAC Quantitative Analyse, bestehend aus Larven Dissektion, konfokale Mikroskopie und Bild Analyseverfahren mit ImageJ-Software. Weitere Einblicke in da neuronale Entwicklung und ihre zugrunde liegenden Mechanismen verbessert das Verständnis der neuronalen Funktion und Aufschluss über die grundlegenden Ursachen der neurologischen und Entwicklungsstörungen des.

Einleitung

Dendriten, die die verzweigten Projektionen eines Neurons sind, umfassen das Gebiet, das das Neuron sensorischen und synaptischen Eingänge von anderen Neuronen1,2umfasst. Dendriten sind ein wichtiger Bestandteil der Synapse Bildung und spielen eine kritische Rolle bei der Integration der synaptischen Eingänge, sowie die Vermehrung der elektrochemischen Stimulation in einem Neuron. Dendritische Arborization (da) ist ein Prozess, der durch den Neuronen neue dendritischen Bäume und Äste zum Erstellen neuer Synapsen bilden. Die Entwicklung und Morphologie der da, wie dichte Verzweigung und Gruppierung Muster ergeben sich aus mehrstufigen biologischen Prozessen und sind stark korreliert zu neuronalen Funktion. Ziel dieses Protokolls ist es, ein Verfahren zur quantitativen Analyse der neuronalen Dendritric Arborization Komplexität in Drosophila.

Die Komplexität der Dendriten bestimmt die synaptischen Typen, Konnektivität und Eingänge von Partner-Neuronen. Verzweigung Muster und die Dichte der Dendriten engagieren sich bei der Verarbeitung der Signale, die auf die dendritischen Feld3,4konvergieren. Dendriten haben die Flexibilität zur Anpassung in der Entwicklung. Zum Beispiel wirkt sich synaptische Signalisierung auf Dendrit Organisation im somatosensorischen Neuronen in der Entwicklungsphase und in den Reifen Nervensystem-5. Die Einrichtung der neuronalen Vernetzung stützt sich auf die Morphogenese und Reifung von Dendriten. Fehlbildung der Dendriten ist Beeinträchtigung der neuronalen Funktion zugeordnet. Studien haben gezeigt, dass die Anomalie der da Neuron Morphogenese der Ätiologie von mehreren Neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD) und Gehrig Krankheit beitragen kann / Amyotrophe Lateralsklerose (ALS)6,7,8. Synaptische Veränderungen erscheinen in der frühen Phase der AD, im Konzert mit den Niedergang und die Beeinträchtigung der Neuron Funktion7,8. Die Besonderheiten wie Dendrit Pathologie, Pathogenese in diese neurodegenerativen Erkrankungen beiträgt bleibt jedoch schwer.

Die Entwicklung der Dendriten wird durch Gene reguliert, die ein komplexes Netzwerk von Regulierungsbehörden wie der Wnt-Familie von Proteinen9,10, Transkriptionsfaktoren und Liganden auf Zelle Oberfläche Rezeptoren11,12 kodieren . Drosophila da Neuronen bestehen aus vier Klassen (Klasse I, II, III, IV), von welcher, die Klasse IV da Neuronen haben die komplexesten Verzweigung Muster und als ein leistungsfähiges experimentelle System für besseres Verständnis Morphogenese13eingesetzt, 14. Während der frühen Morphogenese führen Überexpression und/oder RNAi-Stummschaltung von Genen in Klasse IV da Neuronen Änderungen in verzweigten Mustern und Dendrit Rebschnitt13. Es ist wichtig, eine praktische Methode zur quantitativen Analyse der neuronalen dendritischen Arborization zu entwickeln.

Wir haben bereits gezeigt, dass Schweigen der Drosophila Ortholog des SOX5, Sox102F, zu kürzeren Dendriten da Neuronen und reduzierte Komplexität in der Klasse IV da Neuronen15geführt. Hier präsentieren wir Ihnen das Verfahren der quantitativen Analyse für die neuronale dendritischen Arborization Komplexität (NDAC) in Drosophila. Dieses Protokoll, adaptiert von der vorherigen beschriebenen Methodik bietet eine kurze Methode, um die Entwicklung der sensorischen Neuronen da assay. Die robuste Bild beschriften und da Neurons in Dritte Instar Larven Körperwand16,17,18,19veranschaulicht. Es ist eine wertvolle Protokoll für Forscher, die die NDAC und Entwicklungs Unterschiede in Vivozu untersuchen wollen.

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Protokoll

(1) experimentelle Vorbereitung

  1. Die folgenden Reagenzien vorzubereiten: Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS); Triton x-100; 0,2 % PBST (PBS + 0,2 % Triton x-100); 32 % Paraformaldehyd (PFA), in 4 % vor Gebrauch verdünnt; Silikon-Elastomer-Basis und Härtemittel; Antifade Montage Medium (z. B.verlängern Gold); und Nagellack.
  2. Bereiten Sie die folgende Ausrüstung: Dissektion Mikroskop, zwei scharfe Pinzette und eine Schere für Mikrodissektion, eine Anzahl von Pins für Mikrodissektion, einer Petrischale zur Herstellung der Dissektion Gericht, Objektträger und Deckgläsern, ein confocal Mikroskop und eine Computer mit Fidschi ImageJ-Software installiert.

2. Larven Sammlung

  1. Paaren Sie FH-Sox102F-RNAi fliegen mit UAS-GFP, Ppk-GAL4 oder W1118 Wildtyp fliegen, bzw.. Kultur-fliegen in Standardbedingungen bei 25 ° C.
  2. In ca. 5-6 Tagen sammeln die dritte Instar Larven der FH-Sox102F-RNAi / Ppk-GAL4, UAS-GFP oder UAS-GFP und Ppk-GAL4 / + Kontrolle sorgfältig mit der Pinzette für Dissektion.

(3) Dissektion der Larven

Hinweis: Alle Verfahren in diesem Abschnitt werden unter dem Mikroskop Mikrodissektion betrieben. Die Vergrößerung ist bis zu den Ermittlern. Versuchen Sie, die optimale Sicht-Ansicht anpassen. ~ 4-6 X Vergrößerung wird empfohlen.

  1. Legen Sie eine Larve auf eine Dissektion Gericht aus Silikon-Elastomer Basis und einer Gewebekultur Petrischale.
  2. PIN des Larve Mund Hakens damit die dorsale Seite stellen kann, und dann Heften Sie das Ende der Larve. Ort der dorsalen Seite in der Mitte so weit wie möglich an die Mittellinie, die die öffnen-Marker werden aussetzen.
  3. Die Larve Körperfeuchtigkeit halten fügen Sie 200 µL PBS hinzu.
  4. Machen Sie einen Schnitt mit der Schere entlang der dorsalen Mittellinie zwischen den zwei Tracheas von kaudalen, rostral. Machen Sie einen kleinen Schnitt in jeder der vier Ecken des Körpers Larve.
  5. Legen Sie eine Pin an jeder der vier Ecken des Körpers, damit der Körper flach liegt.
  6. Korrigieren Sie die Larve Körperwand in 4 % PFA für 25 min bei Raumtemperatur.
  7. Für 5 min. wiederholen zweimal mehr in PBST waschen.
  8. Die Pins aus dem Gewebe zu entfernen. Übertragen Sie dann das Gewebe auf einem Objektträger mit antifade Eindeckmittel bedecken und mit einem Deckglas montieren. An der Luft trocknen für 1 h und die Schnittflächen mit Nagellack versiegeln.

4. Bildgebung Verarbeitung

Hinweis: Bilder wurden mit einem invertierten confocal Mikroskop-System. Der Benutzer kann die Probe mit einem 20 X Objektiv (empfohlen) fotografieren.

  1. Z-Serie Bilder aufnehmen. Öffnen Sie das Dialogfeld "Capture Z-Serie" in der konfokalen Mikroskop-Software. Bestimmen Sie den Bereich für die Aufnahmen der Z-Serie.
    1. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Oben und unten". Oben und unten positionieren und die Eingabewerte zu bestimmen "unten:" und "Top:" Boxen. Legen Sie die "Step" im Dialogfeld "Capture Z-Serie" als 0,5 µm. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Jetzt ausführen", um die Z-Serie-Bilder zu erwerben.
  2. Speichern Sie die erhaltenen Bilder als *.tiff oder *.nd2-Dateien.
  3. Speichern Sie die Folien in einer dunklen Halterung bei 4 ° C nach dem Imaging.

(5) Dendrit Bewertung

Hinweis: GFP-Protein wurde in UAS-GFP co überexprimiert und Ppk-GAL4 fliegt da Nervenzellen für GFP Fluoreszenz imaging-Analyse. Länge, Verzweigung und Struktur von da Neuronen in die dritte Instar Larven wurden quantifiziert. Analyseparameter gehören Länge der Dendriten (µm), Fläche (µm-2), Anzahl der Filialen und verzweigte Struktur (%). Abbildung 1 zeigt die Analyseparameter im Detail.

  1. Länge der Dendriten
    Hinweis: Die Länge der Dendriten ist die Summe aller Dendriten in Tracer Plugin beschriftet.
    1. Setup und Fidschi ImageJ (https://fiji.sc/)20 Software ausführen. Dann Bilder in separate Kanäle aufgeteilt, wenn es mehrere Kanäle von Bildern.
      Hinweis: Das Bild in diesem Protokoll hat nur einen Kanal der GFP.
    2. Führen Sie "Bild | Stapel | Z-Projekt"zu einer Z-Projektion; erscheint ein neues Fenster mit dem Namen "Z-Projektion." Klicken Sie auf "Max. Intensität" für Projektionstyp und organisieren Zahlen zwischen Slice Start und Stop Stück je nach individuellen Vorlieben. Klicken Sie auf "OK". Ein Z-Projektionsbild erscheint präsentiert die Dendriten Projektion deutlich.
    3. Verfolgen Sie die Neuriten.
      1. Wählen Sie "Plugins | Segmentierung | Einfache Neuriten Tracer"im Fenster" ", die Dendriten zu verfolgen. Finden Sie die Neuron Soma zu, und klicken Sie auf einen Punkt an einem Dendriten, Zellkörper und ein weiterer Punkt an der Spitze dieser Dendrit ab.
        Hinweis: Das Programm verbindet die beiden Punkte mit einer blauen Linie.
      2. Drücken Sie "Y" in das Plugin-Fenster, wenn der Pfad klar ist; der Dendrit-Pfad wird bis die Endpunkte des ausgewählten Pfads in den sichtbaren Bildern nachgezeichnet. Klicken Sie auf "vollständige Pfad" auf dem gleichen Plugin-Fenster; das Segment ist abgeschlossen (Abbildung 2).
        Hinweis: Einige Dendriten endete weiter von den Ausgangspunkten, in denen der Weg in kleinere Segmente unterteilt war. Die Segmente wurden kombiniert, um einen vollständigen Pfad für die Tracer zur Verfügung zu stellen.
    4. Nach ein Pfad abgeschlossen ist, gehen Sie zurück zu einem neuen Punkt, wo die Zweige sind. Der neue Pfad kann auf gebaut werden; "Alle Wege" Fenster-Box zeigt die Längenwerte aller Pfade (Abbildung 3). Speichern Sie die Ablaufverfolgung Datei, und fahren Sie mit unfertigen Spuren wie in Abbildung 2dargestellt.
    5. Die Dendrit Längendaten exportieren, indem Sie auf klicken, "Datei | Als *.cvs exportieren Sie"im Fenster"Plugin". Dann die Bahnlängen zusammenzufassen Sie, und exportieren Sie die Daten auf eine Daten-Analyse/Tabellenkalkulations-Software. (Abbildung 3).
  2. Fläche der da Neuronen
    1. Wählen Sie das Hilfsmittel "Freihand zeichnen" im Fenster "Fidschi ImageJ". Die Strecke, und schließen Sie die Endpunkte. Klicken Sie im Menü "Analyze" "Set Messungen | Area." Klicken Sie auf "Messen" aus dem Menü "Analyze". Das Ergebnis wird in einem neuen Feld mit dem Wert für den ausgewählten Bereich (Abbildung 4). Kopieren sie die Daten-Analyse-Software.
  3. Total Anzahl der Äste und Verzweigungen Struktur der Neuronen da
    1. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Filialen mit der Eröffnung von "Analyse" und dann "Rendern | Analysieren Sie skelettiert Pfade"in das Plugin-Fenster (Abbildung 5) zu verfolgen.
      Hinweis: Die Struktur der Laube ist die Summe der Ebenen der Zweige. Der Pfad zwischen den Zellkörper und Dendriten Tipps definiert wurde, und ein Pfad kann mehrere Verzweigungen enthalten, wie die primäre Dorne sind die Dendriten aus dem Neuron Zelle Körper. Die sekundäre Dorne sind Zweige von der primären und so weiter mit dem Tertiär, Quartär und quinary Lauben. Die Struktur der Dendrit Verzweigung ist abhängig von den Ebenen der Zweige getrennt. Beispielsweise ist die primäre % die Zahl der Filialen geteilt durch Anzahl der Verzweigungen, und so weiter.

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Ergebnisse

Die Dendriten der Nervenzellen da waren da neuronale Soma und dendritischer Dorne für GFP Fluoreszenz imaging Analyse von co-überexprimierenden GFP (FH-GFP; Ppk-GAL4) bezeichnet. Die Morphologie der da Neuron Dendriten wurde von einem inversen confocal Mikroskop (Abbildung 2) abgebildet.

Die Dendriten der Nervenzellen da wurden mit Fidschi ImageJ-Software verfolgt. Die Datei wurde zur Schätzung d...

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Diskussion

Dendriten, die die Epidermis innervieren sind die Eingabe Regionen von Neuronen und ihre Morphologien bestimmen, wie Informationen empfangen und verarbeitet von einzelnen Neuronen. Entwicklung Dendrit Morphologie spiegelt gen Modulation der Dendrit-Organisation. Die Drosophila Larven da Neuron des peripheren Nervensystems ist ein wichtiges Modell für das Studium Dendrit Entwicklung: 1) die funktionale Ähnlichkeit mit Säugetieren11,12; (2) vier Klassen...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir möchten William A. Eimer für bildgebende technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Heilung der Alzheimer Krankheit Fonds [R.E.T], das National Institute of Health [R01AG014713 und R01MH60009, R.E.T; R03AR063271 und R15EB019704, A.L.], und die National Science Foundation [NSF1455613, A.L.].

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered saline(PBS)Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
Paraformaldehyde(PFA)Electron Microscopy Sciences15714-S
Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agentDow Corning Corportation3097366-0516;3097358-1004
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36931
Fingernail polish CVS72180
Stereo microscopeNikonSMZ800
Confocal microscopeNikonEclipse Ti-E
Petri dishFalcon353001
ForcepsDumont11255-20
Scissors Roboz Surgical Instrument CoRS-5611
Insect Pins Roboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
Microscope slides and cover slipsFisher Scientific15-188-52

Referenzen

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