Eine schnelle Silber Färbung Protokoll ermöglicht einfache und effiziente Erkennung von SSR-Marker mit einem Non-denaturierenden Polyacrylamid-Gel

Zusammenfassung

Hier berichten wir über eine einfache und kostengünstige Silber Färbeprotokoll erfordert nur drei Reagenzien und 7 min von Verarbeitung und eignet sich für schnelle Generierung von qualitativ hochwertigen SSR Daten in der genetischen Analyse.

Zusammenfassung

Einfache Sequenz wiederholen (SSR) ist eine der effektivsten Marker in pflanzlichen und tierischen Genforschung und molekulare Zuchtprogramme verwendet. Silberne Färbung ist eine weit verbreitete Methode zur Erkennung von SSR-Marker in einem Polyacrylamid-Gel. Konventionelle Protokolle für die silberne Färbung sind jedoch technisch anspruchsvoll und zeitaufwändig. Wie viele andere biologische Labor wurden Techniken, silberne Färbung Protokolle stetig optimiert, um nachweiseffizienz zu verbessern. Hier berichten wir über eine vereinfachte silberne Färbung Methode, die deutlich reduziert Reagenz Kosten und verbessert die Erkennung Auflösung und Bildqualität. Die neue Methode erfordert zwei wesentliche Schritte (Imprägnierung und Entwicklung) und drei Reagenzien (Silbernitrat, Natriumhydroxid und Formaldehyd) und nur 7 min Verarbeitung für ein nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel. Im Vergleich zu bereits gemeldeten Protokolle, diese neue Methode ist einfacher, schneller und verwendet weniger chemische Reagenzien für SSR-Erkennung. Somit profitieren diese einfache, kostengünstige und effektive Silber Färbeprotokoll genetische Zuordnung und markergestützte Züchtung durch eine schnelle Erzeugung von SSR-Marker-Daten.

Einleitung

Die Entwicklung von PCR-basierten Markern revolutioniert die Wissenschaft der Pflanzengenetik und Zucht¹. Einfach wiederholende (SSR) Sequenzmarken gehören zu den vielseitigsten und am häufigsten verwendeten DNA-Markern. Ihre breiten Genom Abdeckung, Fülle, Genom Spezifität und Reproduzierbarkeit sind nur einige von den Vorzügen des SSR-Marker neben ihrer Vererbung Vererbung für die Erkennung von heterozygote Genotypen². Mehrere Studien haben SSR-Marker zu untersuchen genetischen Vielfalt, Abstammung zu verfolgen, genetische kopplungskarten zu konstruieren, und ordnen Sie Gene für wirtschaftlich wichtige Eigenschaften^3,4verwendet.

PCR-Produkte von SSR-Marker werden häufig getrennt, mit Agarose oder Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und dann visualisiert mit silbernen Färbung oder unter UV-Licht nach der Färbung mit Interkalation Bromid. Silberne Färbung der DNA-Fragmente in den Polyacrylamid-Gelen ist empfindlicher als die anderen Färbung Methoden^5,6 und wurde weithin verwendet, um DNA-Fragmente wie SSR Marker⁷erkennen.

Wie viele biologische Labor-Techniken verbesserte silberne Färbung Polyacrylamid-Gele kontinuierlich seit seiner zuerst als ein Fragment Visualisierungstechnik in 1979⁸berichtet. Die Technik wurde ursprünglich zum Nachweis von DNA-Fragmenten von Bassam Et Al. geändert. ⁶ im Jahr 1991 und dann im Jahr 1994 von Sanguinetti und Kollegen⁹ verbessert. Die Methode wurde in den letzten paar Jahrzehnten^{6,7,9,10,11,12,13,14} weiter optimiert ^{, 15}. jedoch haben die meisten dieser aktualisierten Versionen der Protokolle noch einige Nachteile wie hohen technischen Anspruch und lange Bearbeitungszeit zur Befestigung und Montage⁶, die die Anwendung dieser Protokolle^{7zu beschränken, 11}. Eine optimale Protokoll, die kostengünstige mit hohem Wirkungsgrad von DNA-Fragment Nachweis kombiniert ist für die routinemäßige Anwendung von Silber-Färbung in der biologischen Forschung dringend notwendig.

Darüber hinaus Polyacrylamid-Gel können Geruchsstoffen und nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gele unterteilt werden, und beide können zur Erkennung von SSR-Marker mit der Silber-Färbung Methode verwendet werden. Die Wirkung und die Auflösung von denen nicht unterscheiden sich erheblich, aber nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gele lassen sich besser verarbeiten und nehmen weniger Zeit¹⁶.

Das Ziel der aktuellen Studie soll auf der Grundlage der bisherigen Forschung¹⁵eine optimierte Silber Färbeprotokoll für schnelle, einfache und kostengünstige Erkennung von SSR-Marker in einem nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel im Detail zu beschreiben.

Protokoll

1. Vorbereitung der PCR-Produkte von SSR-Marker

1. Bereiten Sie alle Chemikalien und Reagenzien für PCR-Reaktionen einschließlich Vorlage DNA (30 ng/µL), 2 × PCR-master-Mix (mit 2 × PCR Puffer, 0,4 mM jedes dNTP, 3 mM MgCl₂, 0,1 U/µL Taq-DNA-Polymerase und Farbstoffe), 10 µM jedes weiterleiten und reverse Primer , und destilliertem oder entionisiertem Wasser (dH₂O).
   Hinweis: Die SSR-Marker verwendet, die in der vorliegenden Studie wurden PT51333 (Primer Sequenz vorwärts: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' und rückwärts-Primer Sequenz: 5 "- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3") und PT50903 (Primer Sequenz vorwärts: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' und Primer Sequenz umkehren: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ") für Tabak und CX-43 (Primer Sequenz vorwärts: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3" und reverse Primer Sequenz: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3 ") und CX-157 (Primer Sequenz vorwärts: 5"- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' und reverse Primer Sequenz: 5 "- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3") für blühende Chinakohl.
2. Verstärkung durch Zugabe von 2 µL der Schablone DNA, 5 µL 2 × PCR-master-Mix, 0,2 µL der einzelnen vorwärts Grundierung und rückwärts-Primer und 2,6 µL dH₂O. bereiten Sie 10 µL des PCR-Mixes vor
3. PCR-Amplifikation Reaktion in einem Thermocycler mit einem ersten Schritt von 94 ° C für 5 min durchführen, Folgen von 38 Zyklen 45 s bei 94 ° C Denaturierung, 45 s bei 55 ° C für Grundierung glühen und 1 min bei 72 ° C für Erweiterung und eine letzte Verlängerung Schritt von 10 min bei 72 ° C; Speichern Sie PCR-Produkte bei 4 ° C für die spätere Verwendung.

2. Vorbereitung der Lösungen für Polyacrylamid Gele Gießen

1. Bereiten Sie 1 L 5 × TBE Puffer durch Auflösung 54 g Tris-base und 27,5 g Borsäure dH₂O, 20 mL 0,5 M EDTA (pH 8,0) hinzufügen und anpassen die Lösung zu einem Endvolumen von 1 000 mL mit dH₂O.
   Hinweis: TBE Puffer kann für Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
2. 2 L 0,5 × TBE Puffer durch Zugabe von 200 mL 5 × TBE-Puffer, dH₂O zu einem Endvolumen von 2 L zubereiten und bei Zimmertemperatur aufbewahren.
3. Bereiten Sie eine 6 % nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel Lösung durch Auflösen von 29 g Molekulare Biologie Klasse Acrylamid und 1 g der molekularen Biologie Klasse N, N'-Methylenebisacrylamide in 0,5 × TBE-Puffer zu einem Endvolumen von 500 mL. Decken Sie die Lösung Flasche mit Aluminiumfolie und bei 4 ° C für die spätere Verwendung speichern.
   Achtung: Acrylamid gilt ein starkes Nervengift und sollte mit Vorsicht behandelt werden. Tragen Sie immer Handschuhe beim Verwiegen von Pulver und Handling-Lösungen, die sie enthalten.
4. Bereiten Sie eine 20 % Ammonium Bleichen (APS) Lösung durch Auflösen von 2 g APS mit dH₂O zu einem Endvolumen von 10 mL. Es kann für Monate bei-20 ° C gespeichert werden.
   Hinweis: der Einfachheit halber können 10 mL APS-Lösung 20 % regelmäñig in 1,5 mL oder 2 mL der Zentrifuge Röhren für die Lagerung bei-20 ° c werden Auftauen und vor Gebrauch gut mischen.
5. Bereiten Sie eine verdünnte Bind-Silan-Lösung durch 3 µL der Bind-Silan in 0,997 mL 95 % Ethanol enthält 0,5 % Essigsäure auflösen. Es kann bei 4 ° C wochenlang gespeichert werden.
   Achtung: Bind-Silan ist giftig, tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit der Lösung und Zimmer belüftet zu halten.

3. Vorbereitung der Polyacrylamid-Gele für Elektrophorese

1. Waschen Sie einen Satz von Glasplatten und Spacer mit Reinigungsmittel in Leitungswasser, gefolgt von eine komplette Spülung mit dH₂O. Luft trocknen die Platten in einem Wäscheständer Teller setzen.
2. 1 mL der Bind-Silan-Lösung auf der inneren Oberfläche von einer rechteckigen Glasplatte und trocken für 5 min zu zerstreuen.
   Hinweis: Wenn die Bind-Silan-Lösung auf der Oberfläche der Platte nicht gleichmäßig verteilt ist, das Gel kann abgenommen werden, während der Färbung und eine unbefriedigende Färbung Wirkung zur Folge.
3. 1 mL abstoßen-Silan auf der Innenfläche einer gekerbten Glasplatte mit einem Tupfer zu zerstreuen, wischen Sie überschüssiges abstoßen-Silan mit Seidenpapier und an der Luft trocknen für 5 Minuten.
   Hinweis: Wenn das Abstoßen-Silan die Oberfläche der Glasplatte nicht gleichmäßig Beschichten, können sie das Gel beschädigen, durch teilweise entfernen.
4. Montieren Sie die Glasplatten mit Abstandshalter mit der gekerbte Platte an der Spitze, und Klemmen Sie beide Seiten der Baugruppe mit casting Klemmen.
5. Gießen Sie entsprechende Menge (40 mL) 6 % nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel-Lösung in ein Becherglas auf die Platte 33 cm Breite × 10 cm Höhe und Abstandhalter Dicke von 1,5 mm, 20 µL Tetramethylethylenediamine (TEMED) und 200 µLfresh 20 % APS und vorsichtig mischen.
   Hinweis: Der entsprechende Betrag (40 mL) Gel-Lösung wurde aus das innere Volumen der beiden Platten mit einer Dicke von Abstandshalter (30 cm × 8,5 cm × 0,15 cm) berechnet. Für die Menge an TEMED und APS für Gel-Polymerisation ist eine Standardverhältnis Gel Lösung TEMED und APS basierend auf dem Referenz-¹⁷. Die Gel-Lösung oben beschriebenen ist bei 4 ° c aufbewahrt. Gel-Lösung Lagerung bei Raumtemperatur 20 µL TEMED und 100 µL 20 % APS sollte verwendet werden. Rühren Sie vorsichtig die Mischung der Gel-Lösung mit einem Glas-Stock, Luftblasen in der Lösung zu vermeiden.
6. Gießen Sie die Lösung sofort und füllen Sie sorgfältig in die montierten Glasplatten entlang der Kante der gekerbte Platte, den Raum fast bis zum Gipfel, und legen Sie den Kamm. Fügen Sie eine kleine Menge Gel-Lösung über den Kamm.
   Hinweis: Halten Sie die Glasplatten horizontal zu verhindern, dass das Gel undicht. Entfernen Sie alle Bläschen mit einer Blase Haken, ggf..
7. Lassen Sie das Gel für 30 min bei Raumtemperatur festgelegt.
   Hinweis: Die Zeit für die Polymerisation kann mit Temperaturen von Gel-Lösung und Umgebung ändern.
8. Nachdem das Gel vollständig Polymerisation ist, entfernen Sie die Casting-Klammern Positionieren des Platte Satzes in der Elektrophorese tankeinheit mit der gekerbte Platte mit Blick in Richtung des oberen Puffer-Stausees und mit großen Klemmen der Platte soll die Tank-Einheit befestigt.
9. Gießen Sie 1 L 0,5 × TBE-Puffer in jede der oberen und unteren Kammern. Entfernen Sie den Kamm und spülen Sie alle Brunnen mit Puffer mit einer Pipette oder Spritze gründlich.
   Hinweis: Sicherstellen Sie, dass das Gel-Sandwich an der Unterseite der Platte vollständig im Puffer blasenfrei getränkt ist.

4. Lauf Gele

1. Laden Sie etwa 1 µL des PCR-Produktes in jede Vertiefung der Polyacrylamid-Gel. Laden Sie eine DNA-Größe Leiter beidseitig auf das Gel zusammen mit Proben von PCR-Produkten. Befestigen Sie die Sicherheitsabdeckung an der oberen Sperrkammer.
2. Schließen Sie die Leitungen an die Stromversorgung, passend die farbcodierten rot an Rot und schwarz an schwarz. Führen Sie das Gel bei einer Konstanten Spannung von 110 V, bis der Farbstoff eine definierte Position, normalerweise für ~ 70 min erreicht.
   Hinweis: Die Spannung und laufen Zeit kann je nach Größe der PCR Produkte eingestellt werden.

5. Silber-Färbung zum Nachweis von SSR-Marker in ein nicht-Polyacrylamid-Gel

1. Nach Elektrophorese Ablassen des Puffers von der oberen Kammer in ein großes Becherglas über das Ventil. Lösen Sie die Spannpratzen, entfernen Sie die Platten aus dem Gerät, sorgfältig trennen Sie die eingekerbte Glasplatte entlang einer Seite mit einem Spatel und stellen Sie sicher, dass das Gel bleibt mit der anderen Glasplatte verbunden mit Bind Silan beschichtet.
2. Machen Sie 1 L frische Imprägnierung Lösung durch Auflösen von 1,5 g von AgNO₃ in 1 L dH₂O. bereiten 1 L frische Entwicklung Lösung durch Auflösen von 10 g NaOH in 900 mL dH₂O zu, fügen Sie 1 mL 37 % Formaldehyd , und passen Sie zu einem Endvolumen von 1 L mit dH₂O.
   Hinweis: Tragen Sie Handschuhe und behandeln Sie die oben genannten Chemikalien und Lösungen mit Sorgfalt zu. Es ist nicht notwendig, die Lösungen und die entsprechenden Schritte mit den Lösungen im Dunkeln zu halten.
3. Spülen Sie sorgfältig die Gel und Glas Platte mit reichlich dH₂O zum Entfernen des Elektrophorese Puffers, dann die Platte mit dem Gel nach oben auf ein Kunststoff-Tablett und Tauchen Sie das Gel in 1 L Imprägnierung Lösung. Stellte das Tablett auf einem Boston-Shaker.
4. Schütteln Sie das Fach bei 60 u/min für ca. 3-4 min leicht.
   Hinweis: Schütteln Mal nach Gel Stärke und Konzentration von Silbernitrat in der Imprägnierung Lösung einstellbar.
5. Bewegen Sie die Platte aus der Imprägnierung Lösung und setzen Sie es auf einem anderen Fach. Spülen Sie die restliche Imprägnierung Lösung Weg von der Oberfläche der Platte und das Gel mit reichlich dH₂O zweimal für 3-5 s.
6. Legen Sie die Platte mit dem Gel nach oben auf einem anderen Fach, Tauchen Sie die Platte in 1 L Lösung für die Entwicklung, dann schütteln Sie das Fach vorsichtig bei 50 u/min für ~ 3 min. Monitor die Darstellung von DNA-Fragmenten und stoppen Sie Entwicklung zu, wenn das höchste Verhältnis des Signals von DNA-Fragmenten um den Lärm der Hintergrund beobachtet (dieser Schritt dauert ca. 3 min).
7. Spülen Sie die Platte und das Gel mit reichlich dH₂O zweimal, und trocknen Sie die Gelplatte mit einem Papiertuch.
8. Das Gel mit einem geeigneten Scanner zu scannen. Eine Auflösung von 300 dpi bietet eine übersichtliche Visualisierung von DNA-Fragmenten. Das Gel kann auch mit einer Kamera fotografiert werden.
9. Bandenmuster von SSR-Marker kann basierend auf der DNA-Fragmente im Bild bewertet werden.

Ergebnisse

Der PCR-Amplifikate wurden mit den korrespondierenden SSR Grundierung Paare in Blüte Chinakohl und Tabak hergestellt. Nach Elektrophorese waren die Polyacrylamid-Gele befleckt mit dem oben genannten Silber Färbeprotokoll, die eindeutig die Streifenbildung Muster des SSR-Marker (Abbildung 1) entdeckt.

Um die nachweiseffizienz verschiedene Silber Färbung Protokolle vergleichen, PCR-Produkte von SSR...

Diskussion

Das Waschen von Gel nach der Imprägnierung ist ein entscheidender Schritt. Unzureichende Reinigung Zeit und Wasser Volumen kann dazu führen, dass die unvollständige Entfernung der Imprägnierung Lösung auf der Oberfläche der Platte und das Gel und führen zu einem dunklen Hintergrund. Die entsprechenden Entwicklungszeit ist ein weiterer wichtiger Schritt, übermäßige Entwicklung kann dazu führen, dass ein dunkel-braunen Hintergrund mit kontrastarmen Bild von DNA-Fragmenten. Darüber hinaus beeinflusst die Impräg...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR master mix (Green Taq Mix)	Vazyme Biotech Co. Ltd, China	#P131-03
50-2000 bp DNA Ladder	Bio-Rad, USA	#170-8200
DL500 DNA marker	Takara Bio Inc., Japan	#3590A
Tris base	Sangon Biotech Shanghai, China	#77-86-1
Boric acid	Sangon Biotech Shanghai, China	#10043-35-3
EDTA-Na2	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#6381-92-6
Acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#79-06-1
N,N'-methylene-bis-acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-26-9
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-18-9
Ammonium persulfate	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7727-54-0
Bind-silane	Solarbio Beijing, China	#B8150
AgNO3	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#7761-88-8
Formaldehyde	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#50-00-0
NaOH	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#1310-73-2
Acetic acid	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-19-7
Na2CO3	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#497-19-8
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-17-5
HNO3	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7697-37-2
Na2S2O3.5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#10102-17-7
Eriochrome black T(EBT)	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#1787-61-7
Plastic tray	Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China	-
TS-1 Shaker	Qilinbeter JiangSu, China	-
BenQ M800 Scanner	BenQ, China	-
DYY-6C Power supply	Beijing Liuyi Instrument Factory, China	-
High throughout vertical gel systems, JY-SCZF	Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China	-