Fetale kardiovaskuläre Bildgebung mit einem Hochfrequenz-Ultraschall (30 / 45MHZ) Maus

Zusammenfassung

Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung der fetalen Maus bildgebenden Auflösung verbessert und bieten präzise nicht-invasive Charakterisierung der kardialen Entwicklung und strukturelle Mängel. Die hier beschriebenen Protokoll soll in Echtzeit fetalen Mäuse Echokardiographie in Vivodurchführen.

Zusammenfassung

Angeborene Herzfehler (CHDs) sind die häufigste Ursache von Morbidität Kindheit und frühe Sterblichkeit. Vorgeburtliche Erkennung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen von CHDs ist entscheidend für neue präventive und therapeutische Strategien zu erfinden. Mutierte Maus-Modellen sind mächtige Werkzeuge zu entdecken, neue Mechanismen und Umweltstress Modifikatoren, die kardiale Entwicklung und deren mögliche Veränderung im CHDs fahren. Bemühungen um die Kausalität von diesen vermeintlichen Mitwirkende gewesen ist jedoch beschränkt auf histologische und molekularbiologische Untersuchungen in Tierversuchen nicht überleben, in denen die Überwachung die wichtigsten physiologischen und hämodynamischen Parameter oft abwesend. Live-imaging-Technologie ist ein wesentliches Instrument herstellen die Ätiologie der CHDs geworden. Vor allem Ultraschall-Bildgebung kann ohne chirurgisch die Föten pränatal eingesetzt werden so dass Aufrechterhaltung ihrer Grundlinie Physiologie während der Überwachung der Auswirkungen von Umweltbelastungen auf die hämodynamische und strukturellen Aspekte der kardialen Kammer Entwicklung. Hier benutzen wir das Hochfrequenz-Ultraschall (30/45)-System, um das Herz-Kreislauf-System im fetalen Mäuse beim E18.5 in Utero an der Grundlinie und als Reaktion auf pränatale Hypoxie Exposition zu untersuchen. Wir zeigen die Machbarkeit des Systems, kardiale kammergröße, Morphologie, linksventrikulären Funktion, fetale Herzfrequenz und Nabelarterie Fluss Indizes und deren Veränderungen im fetalen Mäuse ausgesetzt systemischen chronischen Hypoxie in Utero in Echtzeit zu messen Zeit.

Einleitung

Angeborene Fehlbildungen des Herzens sind heterogene strukturelle Mängel, die während der frühen kardiale Entwicklung auftreten. Aktuelle technische Fortschritte der betrieblichen Abläufe führten zu signifikanten Verbesserungen in den Überlebensraten von Säuglingen mit CHDs^1,2. Lebensqualität ist jedoch oft gefährdeten sekundär zu längeren Krankenhausaufenthalt und Bedürfnisse für chirurgische Reparatur Verfahren^1,2,3,4,5in Szene gesetzt. Vorgeburtliche Erkennung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen von CHDs ist entscheidend, um frühe Interventionen, neue Präventionsstrategien durchzuführen und die lebenslange Ergebnisse^6,7zu verbessern planen.

Obwohl mehrere genetische und umweltbedingte Faktoren in der Pathogenese der CHDs verwickelt waren, bleibt zur Gründung der Kausalität ein ungedeckter Bedarf zur Verbesserung der diagnostischen, therapeutischen und präventiven Strategien^{1,8,9 ,10,11,12}. Darüber hinaus öffnet untersuchen die Rolle der in Utero Stressfaktoren und epigenetische Modifikatoren neue Schauplätze für künftige Untersuchungen^11,12. Das letzte Jahrzehnt erlebte in der Tat schnelle Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation wie Einzel-Nukleotid Polymorphie (SNP) Microarray, ganze Exome Sequenzierung und genomweite Methylierung Studien, deren Nutzung bei der Untersuchung der genetischen Ursachen der komplexen menschlichen Krankheiten, einschließlich CHDs^1,8,9,10,11 ebnet den Weg zu identifizieren, neue Mutationen und genetische Varianten, die bislang nicht für ihre Pathogenität in geeigneten Tiermodellen getestet.

Unter die andere Krankheit Modellsystemen ist Maus Tiermodell der Wahl, nicht nur für die Untersuchung von Mechanismen der CHDs während der frühen Cardiogenesis^13,14,15,16, sondern auch zu erläutern deren Auswirkungen auf kardiale Kammer Reifung und Funktion am späten Schwangerschaft im pränatalen und perinatalen Stressfaktoren. Durchführung von in-Vivo phänotypischen Charakterisierung eines mutierte Maus fetalen Herzens während der frühen und späten Stadien der Entwicklung, ist daher wichtig zu verstehen, die Rolle dieser genetischen Variationen und Umweltfaktoren auf kardiale Entwicklung und die möglichen zukünftigen Auswirkungen auf Kammer spezifischen Reifung Prozesse bei Mäusen.

Früherkennung und Diagnose von Herzfehlern während der Entwicklung ist entscheidend für interventionelle Planung^17,18. Als sichere, einfache, portable und wiederholbare, fetale Sonographie in der Tat die Standard imaging Technik für kardiale Beurteilung in der Klinik geworden. Fetalen Kreislauf Bewertung mittels Doppler-Ultraschall hat in der klinischen Praxis nicht nur für den Nachweis von Herzfehlern, sondern auch, vaskulären Anomalien, Plazenta-Insuffizienz und intrauterine Wachstumsretardierung zu erkennen und zu beurteilen, verbreitet Die fetalen Wohlbefinden als Reaktion auf in Utero Beleidigungen einschließlich Hypoxämie, mütterliche Erkrankung und Drogen Toxizität^17,18. Parallel zu seinen Wert bei der Bewertung von menschlichen Fehlern und Krankheiten hat Ultraschall Beurteilung der fetalen Mäuse zunehmende Dienstprogramm in experimentelle Einstellungen^{19,20,21,22gewonnen, 23}. Insbesondere kann fetale Herz-Ultraschall (Echokardiographie) sequentielle in Vivo Visualisierung des Herzens entwickeln. Viele experimentelle Studien haben Ultraschall-Imaging-Technologie verwendet, um fetale Herz-Kreislauf-Entwicklung in fetalen Transgene Mäuse zu beobachten. Doppler-Ultraschall ist besonders nützlich, um die pathophysiologische Parameter, wie die Strömungsmuster im fetalen Kreislauf unter physiologischen Herausforderungen oder Krankheit Bedingungen^10,19aufzuklären gewesen. Bei Mensch und Tier kann abnormale Flow oder Sauerstoff Blutversorgung für den Fötus aus verschiedenen Bedingungen führen, die fetalen Umwelt in der Gebärmutter stören und beeinflussen die Fetoplacental Achse, einschließlich der plazentare Auffälligkeiten, mütterliche Hypoxie, Schwangerschafts-Diabetes und pharmazeutisch induzierten vaskulären Zusammenziehung^15,22. Daher wird Etablierung standardisiertere Methoden zum Ausführen von Doppler Ultraschall auf fetale Mäuse enorm Zukunftsstudien CHDs stärken durch die Erleichterung der Überwachung fließstrukturen und wichtige hämodynamische Indizes der Herz-Kreislauf-Schaltungen während verschiedenen Entwicklungsstadien kardiale in genetischer Mausmodelle.

Hochfrequenz-Ultraschall ist ein leistungsstarkes Tool zum Messen der Entwicklungs- und physiologische Parameter des Herz-Kreislauf-Systems in Mausmodellen und menschliche Krankheiten¹⁸entstanden. Diese Technologie hat in den letzten Jahren weiterentwickelt worden. Wir und andere Forscher haben die Machbarkeit dieses Systems zur Durchführung von Ultrahochfrequenz Ultraschall Studien über die fetalen Maus Herz^{15,19,20,21,22 gezeigt. ,23}. Das System ist ausgestattet mit Doppler Fluss Farbzuordnung und linear-Array-Sensoren, die zweidimensionale, dynamische Bilder bei hoher Frequenz (30 bis 50 MHz) Frameraten zu generieren. Diese Vorteile, im Vergleich zu niederfrequenten Ultraschall-Systeme und die vorherige Generation der Hochfrequenz Ultraschall^21,22, bieten die notwendige Empfindlichkeit und Auflösung für eingehende Beurteilung der fetalen Kreislauf System, inklusive umfassende Charakterisierung von Herzen Strukturen, Kammer-Funktion und Fluss-Indizes der fetalen Mäuse in experimentelle Einstellungen. Hier erläutern wir Methoden, um schnelle Beurteilung der Herz-Lungen-Kreislauf und Feto-plazentaren Zirkulation an embryonalen Tag E18.5 in Vivo mit einem Hochfrequenz-System durchführen. Wir entschieden uns für einen 30/45 MHz Wandler, der einer axialen Auflösung von etwa 60 µm und einer lateralen Auflösung von 150 µm bietet. Jedoch kann ein höhere Frequenz-Wandler (40/50 MHz), früher Entwicklungsstadien zu analysieren, indem Sie folgen einen ähnlichen methodischen Ansatz gewählt werden. Die ausgewählten M-Modus ermöglicht die Visualisierung von Gewebe mit hoher zeitlicher Auflösung Ebenen (1.000 Bilder/s) in Bewegung. Zu guter Letzt zeigen wir die Machbarkeit der hohen Ultraschall für detaillierte umfassende phänotypischen Charakterisierung der fetalen Herz-Kreislauf-hämodynamischen Status und Funktion bei Mäusen zu Studienbeginn und in Reaktion auf Stress pränatale Hypoxie.

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Protokoll

Die University of California, Los Angeles, Animal Care und Use Committee genehmigt alle Verfahren, die in diesem Protokoll angezeigt. Die Experimente wurden im Rahmen einer laufenden Studie unter aktiven Tier Protokolle, genehmigt durch die institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der University of California, Los Angeles, Kalifornien, USA. Tierische Handhabung und Pflege folgten die Standards des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Vorbereitung des Hochfrequenz-Ultraschalls-Imaging-System

1. Aktivieren Sie die Ultraschall-imaging-System und die Physiologie-Überwachungseinheit.
2. Schließen Sie den 30/45 MHz-Schallkopf.
3. Legen Sie die entsprechenden Scan-Kopf auf der Halterung in der Nähe der bildgebungsplattform.
4. Die Kardiale Messprogramm Option.
5. Ort der Ultraschall gel kopfüber in seinem vor-Erwärmung Container setzen auf 37 ° C.
6. Bestätigen Sie entsprechenden Schlauchsystem für die Anästhesie zu und überprüfen Sie die Ebenen aus Sauerstoff und Isofluran.
7. Desinfizieren Sie die imaging-Plattform und den Arbeitsbereich.
8. Legen Sie die Wärme der imaging Plattform weiterhin eine Konstante Körpertemperatur und Herzfrequenz der Dämme.

2. Schwangere Maus Vorbereitung

1. Legen Sie die schwangere Maus (C57/BL6)-Damm in der Anästhesie-Induktion-Kammer.
2. Induzieren Sie Anästhesie mittels inhalativer Isofluran (Isofluran 2 % - 3 %), gemischt mit 100 % Sauerstoff (100 % O₂) bei einer Durchflussrate von 200 mL/min in der Induktion Kammer kontinuierlich geliefert.
3. Das sedierten Tier auf die imaging Plattform in Rückenlage zu übertragen.
4. Bieten Sie stationäre Sedierung mit einer Gesichtsmaske, verbunden mit der Anästhesie Schlauch System liefert Isofluran (1,0-1,5 %) mit 100 % O₂ bei 200 mL/min gemischt.
   Achtung: Steuern Sie das Austreten von betäubende Gas mithilfe einer Lüftungsanlage ausgestattet mit einen Kohlefilter, Kanister Satz enthält.
5. Kleben Sie die Glieder sanft zu den eingebetteten elektrokardiographischen Elektroden nach Anwendung der Elektroden-Gel zu erreichen, ständige Überwachung der mütterlichen Herz- und Atemwegserkrankungen Raten.
6. Der Pegel der Isofluran weiterhin eine durchschnittliche Herzfrequenz (450 + /-50 Schläge/min (Bpm)).
7. Aufrechterhaltung der Körpertemperatur innerhalb eines Bereichs von 37,0 ° C +/-0,5 ° C. Überwachen Sie die Körpertemperatur und die Herzfrequenz auf die Physiologie-Controller-Einheit angezeigt wird.
8. Dokumentieren Sie die Vitalfunktionen der sediert Maus alle 15 min in den bildgebenden Verfahren.
9. Bewertung des Anästhesie durch die Auswertung der Maus Haltung, Herzfrequenz und Reaktion bis zu den Zehen drückt.
10. Bewerben Sie ophthalmologische Balsam (1 Tropfen in jedes Auge), um Augentrockenheit und Hornhaut Schaden zu verhindern.
11. Entfernen Sie das Fell aus der Mitte des Brusthöhe an den unteren Extremitäten mit einer Enthaarungscreme Ultraschall Dämpfung zu minimieren. Creme 1-1,5 min nach Anwendung durch den Wechsel von nassen und trockenen Gaze wischt, um Schäden an der Haut zu entfernen.

(3) Embryo Identifikation

1. Ertasten der Bauchwand sanft zum Suchen der Föten und verteile sie.
2. Kommentieren Sie jeder Embryo auf dem Damm Bauch und mit einem Marker definieren Sie ihre anterior-posterioren und dorsal-Ventral Orientierungen.
3. Verwenden Sie den Muttermund sediert dam als Wahrzeichen. Beschriften Sie die Föten auf die Links und rechts uterine Hörner als L1, L2, L 3, etc. (linke Seite) und R1, R2, R3, usw. (rechts), bzw. (Abbildung 1A).
   Achtung: Vermeiden Sie die Verbreitung der Feten mit Nachdruck. 1-2 Föten in jedem Wurf überschneiden sich mit den anderen, um ihre Positionierung und bildgebenden unzuverlässig. Diese Föten von der Analyse auszuschließen.

(4) fetalen Herzens Visualisierung und Annotation

1. Tragen Sie vorgewärmten Ultraschallgel auf den Bauch auf und verteilen Sie es sorgfältig durch, um Blasenbildung zu vermeiden. Fügen Sie zusätzliche Menge des Gels auf dem Gebiet der Bildgebung Scan.
2. Die Ultraschallsonde auf der mechanischen Halterung und mobilisieren Sie allmählich in Richtung der Haut die dicken Gelschicht Kontakt während der Suche nach das schlagende Herz Scan B-Modus (Abbildung 1) zu.
3. Klicken Sie auf die Scan B Modus um 2-D-Bilder zu erhalten. Verwenden Sie die Blase als Wahrzeichen zu identifizieren den ersten Fötus positioniert in der rechten oder der linken Uterus Horn und markieren Sie ihn als R1 oder L1, beziehungsweise.
4. Bestätigen Sie die Rechte und linke Ausrichtung des einzelnen Fötus in Echtzeit durch Verschieben der bildgebungsplattform in der Horizontalebene. Scannen von Kopf Schwanz um die Schnauze, die Gliedmaßen und der Wirbelsäule als Landmarken (Abbildung 1 b, 1 Video) zu beschriften.
5. Visualisieren Sie das schlagende Herz zu und mit Anmerkungen versehen Sie, der linke Ventrikel (LV) und den rechten Ventrikel (RV). Verwendung Doppler Farbmodus zur Optimierung der Herz-Visualisierung (Abbildung 1 C-G, Videos 1 - 2).
6. Klicken Sie auf Scan B Modus um ein Parasternal kurze Achse-Ansicht zu erhalten haben die LV und RV in ihrer maximalen Durchmesser in der Mitte des Datenrahmens Erwerb angezeigt. Starten Sie live Imaging (Abbildung 1 b-C).
7. Ändern Sie die Ausrichtung der Maus im Hinblick auf die Scan-Flugzeuge, um einen längs vierkammer-Blick (Abbildung 1) zu erhalten. Ermitteln Sie zuerst die restlichen Strukturen des Herzens wie Atrien, interventricular Septum und Links und rechts Abfluss Traktate. Als nächstes müssen Sie die ventrikulären und Vorhofflimmern Kammern in ihrer maximalen Durchmesser angezeigt. Starten Sie Bildaufnahme.
8. Letzten Endes die suboptimale, schiefe Bilder ausschließen. Klicken Sie auf Cini Daueraufzeichnung "Cineloops" erhalten für ein Minimum von 10 s, dann speichern Sie die aufgezeichneten Bilder.

5. Bewertung der fetalen Herzfrequenz und linksventrikulären Funktion

1. Klicken Sie der Scan M-Modus um kardiale Bilder aus vier-Kammer-Flugzeuge (Video 3) zu erhalten.
2. Zeigen Sie die Liste der Aufnahmen für die Analyse, sobald die Bilder aller Embryonen abgeschlossen sind.
3. Letzten Endes die suboptimale, schiefe Bilder ausschließen.
4. Klicken Sie auf Analyse , Wandstärke Messen und die Links/rechts-ventrikuläre Innendurchmesser bei Diastole (LVID, d; RVID, d) und Systole (LVID, s; RVID, s), wie in Abbildung 2dargestellt.
5. Bestimmen Sie die durchschnittliche fetale Herzfrequenz durch das Spielen jedes M-Modus aufgezeichnet Ermittlung und Berechnung der Messung einen Flow-Zyklus, der folgende Ablauf Zyklus (den Abstand zwischen benachbarten Gipfeln).
6. Führen Sie mehrere Messungen (mindestens 5 pro Ablaufverfolgung) um die durchschnittliche Herzfrequenz (Abbildung 2) zu erhalten.
7. Messen Sie die zeitlichen Veränderungen zwischen linken ventricular diastolische Innendurchmesser (d LVID) und linken ventricular Innendurchmesser am Ende Systole (LVID, s) in dem Herzzyklus. Berechnen Sie gebrochene Verkürzung Prozentsatz (FS %) wie folgt: FS % = [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d] X100.
8. Führen Sie mehrere Messungen (mindestens 5 pro Ablaufverfolgung) um die FS % Durchschnittswerte zu erhalten.

6. Bewertung der kardiopulmonalen Strömungsparameter

1. Passen Sie dem Sektor in einem Winkel des Erwerbs weniger als 60^o. Klicken Sie Doppler gepulsten Doppler Messungen aus dem 2-D vier-Kammer-Bildgebung Flugzeug mit einer 45-MHz-Schallkopf durchführen.
   1. Zunächst visualisieren Sie die Verzweigung der Lungenarterie, die richtige Ausflusstrakt zu identifizieren. Als nächstes klicken Sie auf gepulsten Doppler um den Strömungsverlauf durch die Lungen- und Aortenklappen (Abb. 3A, Video 4) zu erhalten.
2. Erhalten Sie pulmonale Durchflussmessungen von gepulsten Doppler Ablaufverfolgung, einschließlich Gipfel systolischen Geschwindigkeit (PkV), Beschleunigung der Zeit (AT) und Auswurf Zeit (ET).
3. Führen Sie mehrere Messungen (mindestens 5 pro Ablaufverfolgung) um durchschnittlichen Messwerte zu erhalten, wie in Abbildung 3A (rechts) dargestellt.
4. Berechnen die AT / ET Ratio für jeden Abfluss Ventil als Indikator für den Abfluss Traktate Durchgängigkeit und Durchblutung.
5. Fahren Sie mit der Mitral- und Aortenklappe Strömungsmuster von apikalen vier Kammer 2-D-Ansichten mit gepulsten Doppler zu erhalten. Ermitteln Sie zuerst die linken Vorhofflimmern und linke ventrikulären Kammern. Als nächstes legen Sie die gepulsten Doppler Probenmenge für die Aufnahme der Mitral-Zufluss Doppler Muster und Mess Frühe Diastolische Geschwindigkeit (E) und atrial Kontraktion Geschwindigkeit (A) (Abb. 3 b)^24,25.
6. Doppler-Beispiel Lautstärke um die Aorta Doppler Jet Muster zu erhalten. Verwenden Sie die Aorten-Doppler Jet tracing um Beschleunigung (AT) und Auswurf Zeit (ET) zu messen, wie in Abbildung 3 b (rechts) gezeigt (Video 5)

7. Bewertung der Feto-plazentaren Achse

1. Verwenden Sie den Doppler Farbscan uterine Arterie und Feto-plazentaren Kreislauf Baum visualisieren, indem mit den 45 MHz-Schallkopf (Abb. 4A).
2. Identifizieren Sie die Nabelschnur Schiffe (zwei Arterien und eine Vene) im Segment der Nabelschnur, Intra-Fruchtwasser kurz nachdem die Schnur aus dem fetalen Bauch verlässt.
3. Ort gepulsten Doppler Probenvolumen Nabelarterie Strömungsmuster (Abb. 4A) zu erhalten.
4. Vaskuläre Peak Strömungsparameter einschließlich der Beschleunigung der Zeit (Zeitpunkt), Auswurf (ET) zu messen, und peak Strömungsgeschwindigkeit am Ende Systole (PkV, s) mit gepulsten Doppler scanning Datensatz (Abbildung 4 b).
5. Erhalten Sie 5 aufeinander folgenden Wellenformen in jedem Gefäß, in das Fehlen von Kindsbewegungen und mütterliche Atembewegungen, zur Messung der durchschnittlichen Geschwindigkeit für jedes Schiff.
6. Fahren Sie mit der nächsten Embryo.

8. Post-Bildgebung Tier Überwachung

1. Schalten Sie den Isofluran-Container nach Abschluss den imaging-Prozess.
2. Überwachung der Körpertemperatur, Atemfrequenz und Herzfrequenz während der Erholungsphase weiter.
3. Die Gesichtsmaske und die angeschlossenen Leitungssystem zu entfernen, sobald der Damm spontane Bewegungen beginnt.
4. Der dam mit dem entsprechenden Gehäuse und Fortfahren Sie Beobachtung nach institutionellen postoperativ Standardprotokolle.
5. Die Zeit, um volle Wiederaufnahme der normalen Aktivität zu dokumentieren.

9. die Leistungsanforderungen und technische Überlegungen

1. Begrenzen Sie die Bearbeitungszeit für ~ 8 Feten bis ca. 1 h, die negativen Auswirkungen der verlängerten Anästhesie auf Vitalparameter und physiologische Parameter zu vermeiden.
2. Komplette Ausbildung mit 8-10 schwangeren Mäusen, Techniken für Bildmuster Erwerb und Flow Ablaufverfolgung in einem kurzen Zeitrahmen zu optimieren.

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Ergebnisse

Statistische Analysen der Herz- und hämodynamische Indizes wurden offline durchgeführt. Die Mittel von 5 aufeinander folgenden Messungen in 3 optimale Bilder wurden berechnet. Die Daten wurden geäußert, da ± SEM Student tbedeuten-Test diente der interfraktionellen Arbeitsgruppe Vergleiche zu schließen. Ein P -Wert des ≤0.05 galt als statistisch signifikant.

Im Anschluss an das oben genannte Protokoll ge...

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Diskussion

Herz-Kreislauf-Fehlbildungen und Krankheiten werden von genetischen Faktoren und Umwelteinflüssen¹⁹wesentlich beeinflusst. Wir haben bisher einen signifikanten Einfluss der mütterlichen kalorische Restriktion, initiiert während des zweiten Trimesters auf Feto-plazentaren Kreislauf fließen und fetalen Herzfunktion⁹gezeigt.

Pränatale Hypoxie ist eine weitere gemeinsame Stressfaktor während der fetalen Entwicklung, die Ungeheuer der Feto-plaze...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100	VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada	N/A	High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA
inbred mice (c57/BL6)	Charles River Laboratories	N/A	Inbread wild type mouse strain