Herstellung von Zunge extrazellulären Matrix und Rekonstitution der Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür In-vitro-

Zusammenfassung

Hier wird eine Methode für die Vorbereitung der Zunge extrazellulären Matrix (TEM) mit effizienten Decellularization angezeigt. Die TEM kann als funktionelle Gerüste für den Wiederaufbau eines Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür (TSCC) Modells unter statischen oder gerührt Kulturbedingungen verwendet werden.

Zusammenfassung

Um eine effektive und realistische Modell für Zunge Plattenepithelkarzinom Karzinom (TSCC) in Vitrozu konstruieren, die Methoden zu produzieren decellularized Zunge extrazelluläre Matrix (TEM) entstanden funktionelle Gerüste für TSCC Bau bietet. TEM bietet eine in-vitro- Nische für Zellwachstum und Differenzierung Zellmigration. Die Mikrostrukturen der native extrazelluläre Matrix (ECM) und biochemische Kompositionen aufbewahrt in der decellularized Matrix bieten gewebespezifischen Nischen für die Verankerung von Zellen. Die Herstellung von TEM kann durch Deoxyribonuclease (DNase) Verdauung begleitet mit einer schweren organischen oder anorganischen Vorbehandlung realisiert werden. Dieses Protokoll ist einfach zu bedienen und sorgt für hohe Effizienz für die Decellularization. Die TEM zeigte günstige Cytocompatibility für TSCC Zellen unter statischen oder gerührt Kulturbedingungen, ermöglicht den Bau des Modells TSCC. Ein self-made-Bioreaktor wurde auch für die anhaltende gerührt Bedingung für die Zellkultur verwendet. Rekonstruierte TSCC mit TEM zeigte die Merkmale und Eigenschaften ähnlich klinische TSCC Histopathologie, was darauf hindeutet das Potenzial in der TSCC Forschung.

Einleitung

Die Zunge hat verschiedene wichtige Funktionen wie Schlucken, Artikulation und Verkostung. Die Beeinträchtigung der Funktion der Zunge hat so großen Einfluss auf Patienten Lebensqualität¹. Die häufigsten malignen Erkrankungen in der Mundhöhle ist Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür (TSCC), die in der Regel tritt bei Menschen, die Alkohol trinken oder Rauchen Tabak².

In den letzten Jahren wurden in der Grundlagenforschung auf TSCC wenig Fortschritte erzielt. Der Mangel an effizienter in-vitro- Forschung Modelle bleibt eines der größten Probleme sein. So entpuppt sich die extrazelluläre Matrix (ECM) eine mögliche Lösung sein. Da ECM ein komplexes Netzwerk Frame hochorganisierte Matrix Komponenten zusammengesetzt ist, wäre eine ECM-artige Struktur und Zusammensetzung Gerüstmaterial zuständigen für die Krebsforschung. Decellularized ECM bieten perfekt die Nische für die Zellen aus der gleichen Herkunft in Vitro, die entpuppt sich als der wichtigste Vorteil von ECM.

ECM kann mit zellulären Komponenten aus dem Gewebe durch die Decellularization mit Wasch- und Enzyme entfernt wird einbehalten. Verschiedenen ECM-Komponenten, einschließlich Kollagen, Fibronektin und Laminin in decellularized Matrix bieten eine Native-Gewebe-Like Mikroumgebung für kultivierten Zellen, fördert das Überleben, Proliferation und Differenzierung von Zellen³. Darüber hinaus kann die Immunogenität zur Transplantation auf einem minimalen Niveau mit der Abwesenheit von zellulären Bestandteilen in ECM reduziert werden.

Bisher sind Fertigungsverfahren für decellularized ECM in verschiedenen Geweben und Organen, wie Herz^4,5,6,7, Leber^{8,9,10 versucht worden ,11}, Lunge^{12,13,14,15,16,17}und Niere^{18,19 , 20}. keine relevanten Forschung hat jedoch auf ähnliche Arbeiten in der Zunge nach bestem Wissen und gewissen gefunden werden.

In dieser Studie wurde decellularized Zunge extrazelluläre Matrix (TEM) durch eine Reihe von physikalischen, chemischen und enzymatischen Behandlung effizient und kostengünstig hergestellt. Dann wurde die TEM zur TSCC in Vitrorekapitulieren zeigt eine entsprechende Simulation für TSCC Verhalten und Entwicklung. TEM hat gute Biokompatibilität sowie die Fähigkeit, die Zellen der Gewebe-spezifische Nische zu führen gibt an, dass TEM ein großes Potenzial in TSCC Forschung³haben kann. Die hier gezeigte Protokoll bietet eine Auswahl für Forscher auf Pathogenese oder Therapien von TSCC.

Protokoll

Alle tierische Arbeit war gemäss Tierschutzgesetz, institutionellen Richtlinien durchgeführt und durch institutionelle Animal Care and Use Committee, Sun Yat-Sen-Universität genehmigt.

1. Vorbereitung der TEM

1. Ausführen von Mäusen durch zervikale Dislokation und entfernen Sie die Zungen mit sterile chirurgische Scheren und Pinzetten.
2. Tauchen Sie die Zungen in 75 % Ethanol für 3 min, dann setzen jede Zunge in 1,5 mL Eppendorf (EP)-Röhrchen mit 1 mL 10 mM steril Phosphat gepufferte Lösung (PBS).
   Hinweis: Die Konzentration der PBS in den folgenden Schritten ist identisch mit der Konzentration in diesem Schritt.
3. Zell-Lyse durch Frost-Tau-wechseln: Einfrieren der Zungen in EP-Rohre bei-80 ° C für 1 h, und dann auftauen die Zungen bei Raumtemperatur für 45 min 3 Zyklen.
4. Laden Sie jede Zunge auf ein Stück der chirurgischen Naht mit einer chirurgischen Nadel und wickeln Sie das Ende der Naht mit einem kleinen Stück sterile Alufolie. Führen Sie den Vorgang in der Kulturschale 3,5 cm oder 6 cm mit 75 % igem Ethanol unter sterilen Bedingungen.
   Hinweis: Die entsprechende Länge der einzelnen chirurgischen Naht ist ca. 20 cm und die entsprechende Größe der jedes Stück Alufolie ist etwa 0,3 cm² (1 cm × 0,3 cm). Die Zunge sollte in der Nähe der Alufolie geladen werden.
5. Spülen Sie jede Zunge mit 3 mL sterile PBS 30 S. führen diese Operation unter sterilen Bedingungen in der Kulturschale 3,5 cm oder 6 cm.
6. Waschen Sie die Zungen mit Reinstwasser: eine Endkonzentration von 90 µg/mL Ampicilin in eine breit-Mund-Flasche mit 250 mL steriles ultrapure Wasser hinzufügen. Legen Sie die Zungen in die Flasche mit einer Stir Bar. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.
   Hinweis: Bis zu 5 Sprachen können in der gleichen Flasche unter Berücksichtigung des Nahtmaterials Schlinger genommen werden. Die Alufolie ist am Ende der Naht in der Flasche zu verhindern, dass die Zunge rutscht. Die Zungen sollte 2 cm hoch vom Boden der Flasche durch Einstellen der Länge des Nahtmaterials in der Flasche verbleibende platziert werden. Dieser Hinweis ist auch für Schritte 1,8, 1.10 und 1.12 1.16.
7. Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 12 h.
8. Waschen Sie die Zungen mit NaCl: Fügen Sie Ampicilin in einer breit-Mund-Flasche mit 250 mL sterile 1 M NaCl, eine Endkonzentration von 90 µg/mL. Bewegen Sie die Zungen und Stir Bar in der Flasche. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.
9. Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 24 h.
10. Zell-Lyse von Triton x-100: Ampicilin hinzufügen, eine Endkonzentration von 90 µg/mL in eine breit-Mund-Flasche mit 250 mL sterile 2 % Triton x-100 mit PBS-Puffer. Bewegen Sie die Zungen und Stir Bar in der Flasche. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.
11. Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 48 h.
12. Zungen mit CaCl₂/MgCl₂waschen: eine Endkonzentration von 90 µg/mL Ampicilin in eine breit-Mund-Flasche mit 250 mL sterile 5 mm CaCl₂/MgCl₂ hinzufügen. Bewegen Sie die Zungen und Stir Bar in der Flasche. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.
13. Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 24 h.
14. Verdauung durch DNase: Fügen Sie 1 mL Hank es ausgewogen Salzlösung (HBSS) zu jedem EP-Röhrchen. Fügen Sie DNase in HBSS bzw. um eine Endkonzentration von 300 µM. verschieben Sie jede Zunge in jedes EP-Rohr, mit einem Teil des Nahtmaterials außerhalb der Röhre. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der Teil der Naht, die in die Flaschen in den vorherigen Schritten bleibt auch in der EP-Röhre in diesem Schritt bleibt, und stellen Sie sicher, dass der Teil der Naht, die außerhalb der Flaschen in den vorherigen Schritten bleibt auch außerhalb der EP-Rohr in diesem Schritt bleibt.
15. Inkubieren Sie die Zungen in EP-Röhrchen bei 37 ° C für 24 h.
16. Die Zungen mit PBS waschen: Fügen Sie Ampicilin in einer breit-Mund-Flasche mit 250 mL sterile PBS, eine Endkonzentration von 90 µg/mL. Bewegen Sie die Zungen und Stir Bar in der Flasche. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.
17. Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 24 h.
18. Die vorbereitete TEM in sterilen PBS bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.

(2) dreidimensionale (3D) Rekonstitution von TSCC

1. Statische TSCC-Modellbau
   1. 1.0 x 10⁶ einzelne TSCC Samenzellen (Cal27) in einer Kulturschale 3,5 cm. Fügen Sie 3 mL Dulbecco des Adlers Medium/F12 (DF12) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 90 µg/mL Ampicilin und 90 µg/mL Kanamycin modifiziert.
   2. Kultur der Cal27 Zellen bei 37 ° C für 2 bis 3 Tage. Stellen Sie sicher, dass die Zellen von mindestens 60 % decken Bereich der unteren Schale.
   3. Laden Sie TEM auf der Cal27-Monolayer in der Kulturschale.
   4. Setzen Sie die Schale in eine CO₂ Inkubator bei 37 ° C für 28 Tage.
   5. Aktualisieren Sie das Kulturmedium jeden Tag bei der Zelle Kultur. Die CO₂ -Konzentration in den Inkubator beträgt 5 %.
2. Gerührten TSCC-Modellbau
   1. Vorbereitung von einem selbstgebauten gerührten minibioreactor
      1. Nehmen Sie den Kolben aus einer 10 mL Spritze.
      2. Graben Sie ein Loch (Durchmesser von 1 cm) in der Nähe der Talstation des Stabes und Laden einer Stir Bar in das Loch.
      3. Graben Sie ein Loch (Durchmesser von 0,5 cm) in der Mitte der Deckel der Flasche eine Plastikflasche breit-Mund und legte die Kolbenstange durch die GAP.
      4. Schneiden Sie die Hälfte einer 50 mL Zentrifugenröhrchen und auf der äußeren Seite der Deckel der Flasche zu Schweißen.
      5. Legen Sie Angelhaken auf der Rute durch Umwickeln mit Angelschnüre, die an den Angelhaken gebunden sind.
         Hinweis: Können bis zu 4 Angelhaken zu einem Stab angebracht werden.
      6. Autoklaven der selbstgemachten Komplex vor Gebrauch.
         Hinweis: Führen Sie nicht Autoklaven die Plastikflasche breit-Mund. Verwenden Sie eine neue sterile Plastikflasche breit-Mund während der Kultivierung von Zellen.
3. Dynamische Zellkultur
   1. Samen 1.0 x 10⁶ Cal27 Einzelzellen in selbstgebauten Minibioreactor. Hinzugeben Sie 150 mL DF12 Medium enthält 10 % FBS, 90 µg/mL Ampicilin und 90 µg/mL Kanamycin.
   2. Laden Sie TEM auf der Minibioreactor mit den Angelhaken an der Rute befestigt.
   3. Ziehen Sie den Deckel und legen Sie die Minibioreactor auf einen Magnetrührer. Aktivieren Sie die Minibioreactor bei 200 u/min in einem CO₂ Inkubator bei 37 ° C für 7 bis 14 Tage.
      Hinweis: Die Konzentration von CO₂ in die CO₂ Inkubator beträgt 5 %.

Ergebnisse

Dieses Protokoll für die Vorbereitung der TEM entpuppt sich als effizient und angemessen. Die TEM zeigte perfekte Decellularization im Vergleich mit Muttersprache Gewebe. Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung (Abbildung 1A-B) bestätigte die Wirksamkeit von Decellularization. Die HE-Färbung Ergebnisse ergab völlige Verschwinden der nuklearen Färbung in TEM (Abbildung 1B). Darüber hinaus zeigten D...

Diskussion

Ein gut etabliertes Protokoll für decellularized ECM-Herstellung sollten die native ECM Zusammensetzung beim Entfernen von zellulären Bestandteilen in Geweben behalten fast komplett²¹. Trotz aktuell gemeldete Decellularization Protokolle erfordern Perfusion durch das Gefäßsystem, zellulare Werkstoffe durch konvektiven Transport entfernen, mechanische Agitation hier, wurde bekannt als eine traditionelle einfache und preiswerte Methode^{22 , 23<...}

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57-BL/6J mice	Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory	HB15-GR-2.5L
Sodium chloride	Sangon Biotech	A501218
Potassium chloride	Sangon Biotech	A100395
Dibasic Sodium Phosphate	Guangzhou Chemical Reagent Factory	BE14-GR-500G
Potassium Phosphate Monobasic	Sangon Biotech	A501211
1.5 mL EP tube	Axygen	MCT-150-A
Ultra-low temperature freezer	Thermo Fisher Scientific
3.5 cm cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	153066
6 cm cell culture dish	Greiner	628160
Triton X-100	Sigma-Aldrich	V900502
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	746495
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	449164
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Magnesium sulphate	Sangon Biotech	A601988
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9393
Kanamycin	Sigma-Aldrich	PHR1487
Surgical suture	Shanghai Jinhuan
250 mL wide-mouth bottle	SHUNIU	1407
Magnetic stirrer	AS ONE	1-4602-32
CO2 incubator	SHEL LAB	SCO5A
10 mL syringe	Hunan Pingan
50 mL centrifuge tube	Greiner	227270
Cal27 cell	Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank		Tongue squamous cell carcinoma cell line
U2OS cell	Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank		Human osteosarcoma cell line
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D0547
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Hepes free acid	BBI	A600264
FBS	Hyclone	SH30084.03
4 °C fridge	Haier
Water purifier	ELGA
Hemocytometer	BLAU	717805