Eine Ratte Modell der zentralen Ermüdung mit einem modifizierten mehrere Plattform-Methode

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einem Rattenmodell der zentralen Ermüdung unter Verwendung der modifizierten vorstellen mehrere Plattform Methode (MMPM).

Zusammenfassung

In diesem Artikel vorgestellt wir einem Rattenmodell der zentralen Ermüdung unter Verwendung der modifizierten mehrere Plattform Methode (MMPM). Feld mehrere Plattform wurde als ein Wassertank mit engen Plattformen auf der Unterseite entworfen. Die Modell-Ratten wurden in den Tank setzen und Stand auf den Plattformen für 14 h (18:00-08:00) pro Tag für 21 Tage, mit einer leeren Kontrollgruppe für Kontrast gesetzt. Am Ende der Modellierung zeigten Ratten in der Modellgruppe ein offensichtlich müde aussehen. Um das Modell zu beurteilen, haben wir mehrere Verhaltens Tests durchgeführt, einschließlich das Freiland testen (OFT), die erhöhte plus Labyrinth (EPM)-Test und die erschöpfende Schwimmtest (ES). Die Ergebnisse zeigten, dass Angst, raumkognition Beeinträchtigung, Armen Muskelleistung und abgelehnte Freiwilligentätigkeit im Modell Ratten präsentiert die Diagnose der zentralen Ermüdung zu bestätigen. Änderungen der zentralen Neurotransmitter überprüft auch das Ergebnis. Abschließend das Modell erfolgreich simuliert zentrale Ermüdung und Zukunftsstudie mit dem Modell kann helfen, den Pathomechanismus der Krankheit zeigen.

Einleitung

Müdigkeit ist einer der wichtigsten Faktoren, die die menschliche Gesundheit¹bedrohen. In den vergangenen Jahrzehnten haben verschiedene Untersuchungen bewiesen, dass die Ermüdung peripher ausgelöst, sondern zentral gesteuert und immer begleitet mit emotionaler und kognitiver Störungen ist. Italienischer Physiologe A. Mosso schlug zuerst das Wort zentrale Ermüdung². Es wird allgemein als begrenzte ehrenamtliche Tätigkeit und Kognition Beeinträchtigung durch Dysfunktion des Impuls-Übertragung in das zentrale Nervensystem (ZNS)³definiert. Verglichen mit peripheren Muskelermüdung, betont die zentrale Ermüdung Veränderungen im ZNS, als auch die daraus resultierende emotionale/Verhaltensstörungen, einschließlich Depression, Angst, Beeinträchtigung der Kognition und Gedächtnisverlust. Eine Studie zeigt, dass viele Faktoren zentrale Müdigkeit hervorrufen können, unter denen übermäßige körperliche Aktivität und psychischen Stress ganz unverzichtbar⁴sind. Für die Pathogenese erklären Theorien wie die Tryptophan-Kynurenin Weg Hypothese⁵ Änderungen in bestimmte Bahnen; Weitere vertiefende Studien sind jedoch immer noch erforderlich, die zentral-periphere Zusammenhänge der zentralen Ermüdung zu offenbaren.

Da der zugrunde liegende Mechanismus der zentralen Ermüdung noch unklar ist, ist ein effektives Tiermodell sehr wichtig für die weitere Forschung. Die vorhandene Müdigkeit-Modelle sind meist durch übermäßige Bewegung, wie Laufbänder⁶ und Gewicht Beladen Schwimmen⁷, mit wenig Sorge auf psychische Faktoren induziert. Um die Entwicklung der zentralen Ermüdung besser zu simulieren, hat unsere Gruppe einem Rattenmodell mit der MMPM entwickelt. Während des Modellierungsprozesses bleiben Ratten für lange Stunden, einschließlich eines Teils der Schlafzeit auf den schmalen Plattformen im Feld mehrere Plattform stehen. Anders als übermäßige Bewegung Modelle, verwendet das MMPM Modell partiellen Schlafentzug als ein geistiger Faktor unter Berücksichtigung der komplexen Pathogenese der zentralen Ermüdung.

Für Modellevaluierung verwenden wir die Tests OFT und EPM, um Angst Stimmung und ehrenamtliche Tätigkeit zu bestimmen. Der ES-Test wird durchgeführt, um die peripheren Muskelleistung messen. Darüber hinaus wir nehmen die Ratte Gehirn und Dopamin (DA) zu erkennen / Serotonin (5-HT) Inhalt in beiden Hypothalamuses, die zentrale Neurotransmitter Unterschiede zu beobachten.

Die unten dargestellte Protokoll soll Modell zentrale Ermüdung induziert durch wiederholte körperliche Aktivität und Mangel an Schlaf, imitiert eine häufige Erkrankung im menschlichen Leben. Jedoch kann durch Anpassung der Modell-Dauer, es in vielen anderen Bereichen, wie im Schlaf Beobachtung und Stress-Studien verwendet werden. In Zukunft Forschung, hoffen wir, dass dieses Modell mehr CNS Änderungen und deren Verbindung mit dem peripheren System hilft, um den Mechanismus der Pathogenese der zentralen Ermüdung zu offenbaren zu entdecken.

Protokoll

Alle Tiere wurden nach den Richtlinien von der chinesischen Gesetzgebung über die ethische Verwendung und Pflege von Versuchstieren beibehalten.

1. Pre-Modellierung-Vorbereitung

1. Labor-Vorbereitung
   1. Führen Sie die UV-Lampe für mindestens 30 min vor dem Experiment.
   2. Die Lab-Temperatur bei 25 ± 3 ° C und die Relative Luftfeuchtigkeit ca. 30 % Steuern.
   3. Das Labor Licht am 06:00 schalten Sie und schalten Sie ihn aus, um 18:00, einen 12 h/12 h Hell/Dunkel-Zyklus zu etablieren.
2. Mehreren Plattform Kastenkonstruktion
   1. Konstruieren Sie eine undurchsichtige Kunststofftank ohne Abdeckung von 110 × 60 × 40 cm³.
   2. Fünfzehn kreisförmige Plattformen zu beheben (h = 8 cm, d = 6,5 cm) auf der Unterseite des Tanks, welche ordentlich in drei Zeilen und 5 Spalten verteilen. Lassen Sie genügend Platz zwischen jeder Plattform, etwa 10 cm zwischen Spalten und 13 cm zwischen den Reihen.
   3. Legen Sie einen Wasseraustritt an der lateralen Seite des Tanks und installieren Sie einen Wasserhahn zu.
   4. Machen Sie ein Eisen-Maschendraht-Cover für den Tank mit einer Lebensmittel-Box hängen.
3. Gruppierung und Gehäuse Ratten
   Hinweis: Männliche Wistar Ratten 8 Wochen alt, mit einem Gewicht von ca. 200-210 g werden im Experiment verwendet. Die Ratten Leben in Gruppen während des Modellierungsprozesses.
   1. Nummerieren Sie die Ratten Schweif Wurzeln mit einem Filzstift.
   2. Wiegen Sie die Ratten, schließen Sie die extrem leichte oder schwere aus und teilen Sie den Rest nach dem Zufallsprinzip in das Modell und Kontrollgruppen.
   3. Legte die Ratten sanft in die saubere Käfige und es ihnen ermöglichen, an das Labor für mindestens 3 Tage akklimatisieren. Stellen Sie ausreichend Wasser und Verpflegung.

2. Modellierung mit MMPM

Hinweis: Der Prozess beginnt um 18:00 und endet um 08:00 am nächsten Tag, für eine Gesamtmenge von 14 h pro Tag, über 21 Tage. Zur Vermeidung von Störfaktoren ist die gleiche Person erforderlich, um das gesamte Experiment während des Tragens der gleichen Laborkittel durchzuführen. Im Experiment werden 10 Wistar-Ratten verwendet.

1. Platzieren Sie den Tank auf einer flachen Oberfläche, z. B., der Boden. Dann füllen Sie den Tank mit ca. 7 cm von Warmwasser (25 ± 3 ° C) ca. 1 cm unterhalb der flachen Plattform.
2. Bereiten Sie genug Essen und trinken für alle Ratten im Tank für 1 Tag. Futter und Wasser in der Lebensmittel-Box und hängen Sie es auf dem Cover.
   Hinweis: Einige intelligente Ratten lernen, auf die Lebensmittel-Box zu ruhen. Wenn ja, fahren sie zurück in den Tank.
3. Die Model Gruppe Ratten aus dem Käfig nehmen, greifen sie am Schwanz und legte sie sanft in den Tank. Die Ratten im Wasser anstelle von den Plattformen zu motivieren, ihre Angst vor dem Wasser zu starten. Stellen Sie sicher, dass jede Ratte eine Plattform bekommt auf, zu stehen, während Ratten der Kontrollgruppe in ihren ursprünglichen Käfigen mit ausreichend Nahrung und Wasser bleiben.
4. Decken Sie den Tank. Überwachen Sie die Ratten um Verletzungen zu vermeiden. Wenn eine Ratte im Wasser für mehr als 1 h bleibt ohne Klettern auf der Plattform, wählen Sie es aus dem Tank und entfernen Sie sie aus dem Test.
5. Nehmen Sie ab 14 Uhr die Modell-Ratten aus dem Tank und trocknen Sie ihre Haare mit einem Trockner. Neu markieren Sie die Ratten Schwänzen wenn es verblasst. Zurückkehren Sie die Ratten zu ihren ursprünglichen Käfigen und Ihnen Sie ausreichend Nahrung und Wasser.
6. Spülen Sie jede Ecke des Tanks. Heben Sie eine Seite des Tanks zu und öffnen Sie den Wasserhahn, um das Abwasser Abfluss.
7. Den Tank mit einem 75 % Ethanol Spray zu sterilisieren und das UV-Licht aussetzen.

3. Modell: Behavioral Feststellungsprüfung

Hinweis: Alle Tests werden in der Verhaltenstherapie Labor durchgeführt. Zusätzliches Licht und Lärm während der Prüfung dürfen nicht um Störungen zu vermeiden. Verwenden Sie nach Möglichkeit die gleichen Personen, jeder Test durchzuführen. Einen dunklen Mantel und Handschuhe sind Voraussetzung für die Anerkennung der Graustufen in der Bildverarbeitung. Führen Sie das OFT zuerst, da es die geringsten Auswirkungen auf Ratte Verhalten hat.

1. OFT
   1. Überprüfen Sie den Recorder über offenes Feld um sicherzustellen, dass es ordnungsgemäß an die Workstation angeschlossen und deckt jede Ecke des Feldes. Passen Sie die Beleuchtung um Schatten im Feld zu beseitigen.
   2. Verschieben Sie die Ratten in behavioral Labor in ihren ursprünglichen Käfigen. Lassen sie für mindestens 1 h vor dem Test zu akklimatisieren.
   3. Reinigen Sie und Desinfizieren Sie die Box mit 75 % Ethanol um sicherzustellen, dass es keinen Kot oder Geruch aus früheren Experiment verließ.
   4. Entfernen Sie eine Ratte aus dem Käfig, indem den Rücken und legen Sie es sanft in den zentralen Bereich des Feldes. Schnell ziehen Arme aus Feld, nicht um die Aufnahme zu blockieren.
   5. Geben Sie die Nummer der Ratte und Aufnahme starten. Zählen Sie und erfassen Sie die Häufigkeit der Ratte vertikale Aktivitäten, einschließlich der Aufzucht und Klettern.
   6. Beenden Sie nach 5 min die Aufnahme, die Ratte aus der Verpackung nehmen und in den Käfig zurück.
   7. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.3 - 3.1.6, bis die Ratten den Test beendet haben.
2. EPM
   1. Der Pre-Check und Akklimatisierung Schritte wie bei dem OFT (Schritte 3.1.1 - 3.1.2).
   2. Eine Ratte aus dem Käfig entfernen, indem den Rücken und legte sie sanft auf die Kreuzung der beiden Arme. Die Ratte in Richtung der linken offenen Arm landen und lassen Sie schnell um die Aufnahme zu blockieren.
   3. Geben Sie die Nummer der Ratte und Aufnahme starten. Zählen Sie und erfassen Sie die Häufigkeit der verschiedenen Arm-Eingänge. Sinkt die Ratte aus dem Labyrinth im Test, holen Sie es und senden Sie es an das Labyrinth zurück. Detaillierte Informationen zur Datenanalyse.
   4. Beenden Sie nach 5 min die Aufnahme, die Ratte heraus zu nehmen und in den Käfig zurück.
   5. Entfernen Sie die Exkremente und wischen Sie das Labyrinth mit 75 % Ethanol, die ehemalige Ratte Geruch zu beseitigen.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.2 - 3.2.5 bis die Ratten den Test beendet haben.
3. ES test
   1. Füllen Sie den Swimming Tank (70 × 30 × 110 cm³) mit 80 cm Warmwasser (25 ± 3 ° C).
      Hinweis: Ist ein Thermostat im Tank, sollte die Wassertemperatur ca. 37 ° C, festgelegt werden, die Ratte Körpertemperatur ähnelt. Ist dies nicht der Fall, setzen Sie ihn auf Zimmertemperatur, es konstant zu halten.
   2. Stellen eine Belastung für jede Ratte mit Pin Trauben und binden Sie es sanft auf seine Rute Wurzel. Die Last wiegt 10 % des Gewichts der Ratte.
   3. Greifen Sie eine Ratte am Schwanz zu und werfen Sie es in den Tank schwimmen. Wenn die Ratten drängen oder Klammern sich an die Wand, auseinander gesetzt und fahren sie zurück ins Wasser.
   4. Starten der Zeitmessung im Moment wenn die Ratte ist ins Wasser und Stop timing, wenn er erschöpft ist, beweist die als Misserfolg zu kämpfen, aus Wasser mit dem Mund und Nase unter dem Wasser für mehr als 10 s.
      Hinweis: Manchmal, Erschöpfung und ertrinken plötzlich auftreten. Achten Sie darauf, genügend Experimentatoren, aufnehmen und speichern das Tier zur gleichen Zeit haben.
   5. Entfernen Sie die erschöpften Ratten aus dem Wasser ohne andere zu unterbrechen. Trocknen Sie ihre Haare wieder markieren Sie ihre Zahlen und schicken sie zurück zum Käfig.
   6. Wechseln Sie das Wasser im Tank, nachdem eine Gruppe beendet wurde. Nachdem die Ratten fertig sind, leeren Sie den Tank Schwimmen und sauber und mit Ethanol und UV-Licht sterilisiert.

4. Modell Bewertung: Zentrale Neurotransmitter Erkennung

1. Betäuben Sie die Ratte mit Intra peritoneale Injektion von 10 % Chloral Hydrate (3 mL/kg), bis sie bewusstlos ist.
2. Die Ratte zu enthaupten.
3. Eine longitudinale Einschnitt entlang der Post-mediale, der Schädel beidseitig zu öffnen und aussetzen des Gehirns. Umdrehen Sie der Schädel, entfernen Sie das Gehirn zu und setzen Sie das Gehirn auf einen Eisbeutel.
4. Trennen Sie und entfernen Sie den Hypothalamus, die rautenförmigen Bereich im zentralen Teil der Basis des Gehirns, die eine klare Grenze mit umgebenden Gewebe hat. Legen Sie sie in ein steriles Röhrchen und fixieren Sie sie mit flüssigem Stickstoff. Alle Proben im Kühlschrank-80 ° C aufbewahren.
5. Erkennen Sie den Inhalt der DA und 5-HT im Hypothalamus mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)⁸.

Ergebnisse

Wir beschreiben einem Rattenmodell der zentralen Ermüdung mit MMPM. 24 Wistar-Ratten sind zufällig in der Kontrollgruppe und der Modellgruppe mit 12 Ratten in den einzelnen Gruppen unterteilt. Das Modell Gerät dient als ein Wassertank mit engen Plattformen auf der Unterseite (Abbildung 1). Modell Ratten stehen auf den Plattformen für 14 h pro Tag, inklusive teilweise Schlafzeit, für 21 Tage (Abbildung 2).

Diskussion

Die MMPM ist ursprünglich für Schlaf Entzug⁹. Ratten sind in einen Wassertank mit Plattformen auf der Unterseite fest ins Leben gerufen. Angetrieben durch die instinktive Angst vor dem Wasser, Ratten auf den Plattformen stehen bleiben und keinen Schlaf auftritt. Die Studie zeigt, dass verschiedene Stunden Schlafentzug zu verschiedenen Veränderungen der Ratte Verhalten und Stimmung, einschließlich Anerkennung Beeinträchtigung¹⁰, negative Emotionen¹¹

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
multiple platform sleep deprivation water tank	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		110cm x 60cm x 40cm. There are 15 plastic small platforms at the bottom. The small platform is 6.5cm in diameter and 8cm high
Wistar rats	Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Company	license number SYXK (Beijing) 2016-0011	Use 32 Wistar healthy male rats ,8 week old (200-210 g)
Agilent 1100LC high performance liquid chromatograph	Agilent	G1379A, G1311A, G1313A , G1316A	G1379A, G1311A type chromatographic pump, G1313A automatic sampler, G1316A column temperature box
DECADE II SDC electrochemical detector	Dutch ANTEC company		glassy carbon electrode, Ag/AgCl reference electrode, workstations (Clarity CHS)
Biofuge Stratos high-speed refrigeration centrifuge	HERAEUS
VCX130 ultrasonic fracturing instrument	SONICS
ACS-ZEAS electronic scale	Phos technology development, Beijing.		The weight of the weighing rats can be accurate to 0.1g.
Open Field Box	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		wooden box of open field  100 cm by 100 cm x 40 cm, inside wall and bottom as the gray.The bottom is divided into 25 equal area squares, each of which is 20cm x 20cm, and the 16 grids along the outer wall are the external ones, and the other 9 grids are central.The camera is mounted above the median.
Elevated Plus-maze	Beijing zhongshi dechuang technology development co. LTD.		The open arms and close  arms of the cross are composed of 30cm x 5cm x 15cm, and the central area is 5cm x 5cm, with a camera mounted above the center and 45cm high.
rat swimming bucket.	Zhenhua biological instrument equipment co., LTD. Anhui,China.		The volume of plastic drum is 70cm x 30cm x 110cm, which is used for swimming in rats.
Thermometer	Shiya instrument co., LTD., changzhou,China.		Control water temperature
Small water pump	Xincheng technology co., LTD., chengdu,China.		Used for water tank and swimming behavior.
Ethovition3.0 behavioral software.	Nuldus,Netherlands		Measurement analysis of rat behavior videos.