Elektrisch leitfähige Gerüst zu modulieren und Stammzellen liefern

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von einem Zellkultursystem zu ermöglichen, Aussaat von Stammzellen auf einem leitfähigen Polymer Gerüst für in-vitro- elektrische Stimulation und anschließende in Vivo Implantation von Stammzellen entkernt Gerüst mit einer minimal-invasive Technik.

Zusammenfassung

Stammzell-Therapie ist als eine spannende Schlaganfall therapeutische aufgetaucht, aber die optimale Versandart bleibt unklar. Während die Technik der Mikroinjektion jahrzehntelang verwendet wurde, um Stammzellen in Takt Modelle liefern, wird diese Technik durch die mangelnde Fähigkeit der Stammzellen vor der Injektion zu manipulieren begrenzt. Dieses Dokument beschreibt eine Methode mit einem elektrisch leitfähigen Polymer Gerüst für Stammzell-Lieferung. Die elektrische Stimulation von Zellen mit einem leitfähigen Polymer Gerüst verändert die Stammzelle Gene, die in Zelle überleben, entzündliche Reaktion und synaptischen Umbau. Nach der elektrischen Vorkonditionierung, sind die Stammzellen auf dem Schafott intracranially in einem Rattenmodell distale mittlere zerebrale Arterie Okklusion transplantiert. Dieses Protokoll beschreibt eine leistungsfähige Technik um Stammzellen über ein leitfähiges Polymer Gerüst zu manipulieren und schafft ein neues Tool zur Stammzell-Therapie weiter zu entwickeln.

Einleitung

Der Schlaganfall ist die zweithäufigste Ursache des Todes in der Welt und die fünfthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten. Trotz dieser hohen Todesraten bleiben Behandlungen für Schlaganfall Erholung derzeit eine Herausforderung mit derzeit keine praktikable medizinische Möglichkeiten¹. Derzeit gibt es über 300 klinische Studien, die der Umgang mit ischämischen Schlaganfällen, von denen nur 40 Stammzellen nutzen. Frühere Studien haben gezeigt, dass Stammzell-Therapien eine positive Wirkung auf Schlaganfall Reparatur^{2,3 haben}. Parakrine Faktoren wie Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF) und Thrombospondin-1 (THBS-1) von transplantierten menschliche neurale Vorläuferzellen (hNPCs) freigegeben haben verbesserte Funktionelle Wiederherstellung durch Mechanismen verbunden mit einer Zunahme gezeigt. Synapse, Bildung, Angiogenese, dendritische Verzweigung und neue axonalen Projektionen sowie modulieren das Immunsystem^4,5,6. Die optimalen Methoden der Stammzellen bleiben jedoch schwer.

Erfolgreiche Stammzell-Lieferung an das Gehirn bleibt eine Herausforderung. Derzeit, wurden injizierbaren Hydrogel und Polymere Gerüst-Systeme eingeführt, um Stammzellen zu liefern. Diese Liefermethoden schützen Stammzellen während der Transplantation sowie bieten Schutz vor der rauen nach Schlaganfall-Umgebung, einschließlich des Gastgebers Entzündungsreaktion und hypoxischen Bedingungen^{7,8,9 , 10}. jedoch die am häufigsten verwendeten Materialien sind inert, die schränkt die Verwendung von kontinuierlichen Modulation (d.h. elektrische Stimulation) der Zellen¹¹. Elektrostimulation ist ein Stichwort, der Differenzierung, Kanal Ionendichte und Neurit Auswuchs der Stammzellen¹²beeinflusst. Im Vergleich zu inerten Polymeren können leitfähige Polymeren tragen ein aktueller erlaubt für elektrische Stimulation und Manipulation von Stammzellen². Der genaue Mechanismus, durch den elektrischer Stimulation Neurotrophic Factor Release (z.B. BDNF und THBS-1) moduliert, ist jedoch noch nicht vollständig erforscht.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Schritte, um ein Zellkultursystem bestehend aus leski leitfähiges Polymer Polypyrrol (PPy), die für in-vitro- elektrische Stimulation ermöglicht zu konstruieren. Aufgrund der Art und Weise, in der das Zellkultursystem hergestellt wird, ist die spätere Implantation von Stammzellen entkernt Gerüst auf der Peri-Infarkt Kortex möglich. Für dieses System Voraussetzung wir elektrisch Stammzellen auf dem Gerüst für einen kurzen Zeitraum vor der Implantation. Im Anschluss an elektrische Stimulation wird das leitfähige Polymer Gerüst tragen die Zellen erfolgreich implantiert intracranially mit einer minimal-invasive Methode.

Protokoll

Alle Stammzellen und tierischen Verfahren wurden von Stanfords Stem Cell Research Oversight Committee und von Stanford University Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care (SCRO-616 und APLAC-31909) genehmigt.

(1) Ätzen von ITO-Glas

1. Vorbereiten der Indium-Zinn-Oxid (ITO)-überdachte Objektträger indem man einen Maskierung-Agent über die leitende Seite des Glases.
   Hinweis: Die meisten kommerziellen transparente Bänder können als Maskierung Agent verwendet werden.
   1. Entfernen Sie die überschüssige Maske mit einer Klinge, so dass nur die gewünschte Form des endgültigen ITO Design auf dem Glas abgedeckt.
2. Kombinieren Sie 5 % (V/V) von Salpetersäure und 45 % (V/V) von HCl in ein Becherglas in einer Dampfhaube, Radierung Lösung vorzubereiten.
   1. Verwenden Sie eine Herdplatte und ein Thermometer, um sicherzustellen, dass die Temperatur der Radierung Lösung bei 70 ° c gehalten wird
3. Sobald die Radierung Lösung 70 ° C erreicht, legen Sie die maskiert-ITO-Glas-Folie in die Lösung für 2 Minuten, um die überschüssige ITO-Schicht zu entfernen.
   Hinweis: Masking Tape schützt die ITO-Schicht vor der Exposition gegenüber sauren Lösung.
4. Entfernen Sie die Folie aus der Lösung und spülen Sie ihn mit entionisiertem (DI) H₂O.
5. Entfernen Sie vorsichtig die Maske und Maßnahme Widerstand mit einem Multimeter um sicherzustellen, dass die verbleibenden ITO intakt ist. Auslesen von den gewünschten geätzten Bereich sollte ungefähr 0 Ω.

2. Vorbereitung des Pyrrol-Lösung

1. Lösen Sie in einem 1000-mL-Glasflasche 70 g Natrium-Dodecylbenzenesulfonate (NaDBS auf) in 600 mL DI H₂O.
2. Wenn die NaDBS aufgelöst ist, fügen Sie 14 mL 0,2 M Pyrrol und 386 mL DI H₂O der Projektmappe hinzu.
3. Die Lösung mit Alufolie abdecken und bei 4 ° c Lagern

(3) Galvanik von Polypyrrol auf ITO Glas

1. Erwärmen Sie die Pyrrol-Lösung auf Raumtemperatur, bis NaDBS voll Bodensatz ist.
   Hinweis: Dies dauert etwa 15 bis 20 Minuten.
2. Gießen Sie 25 mL der Pyrrol-Lösung in ein Becherglas.
3. Das geätzte ITO-Glas mit einem Multimeter verbinden und die Folie in die Pyrrol-Lösung eintauchen.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Seite mit 0 Ω Widerstand gegen die Bezugselektrode Platin Netz zeigt.
4. Wenden Sie einen elektrischen Strom um Galvanisierung von Wiedersehen auf der ITO-Oberfläche mit einem Multimeter (aktuell bei 3 mA/cm² für 4 Stunden kontrolliert) zu initiieren.
5. Entfernen Sie das ITO-Glas aus der multimeter und waschen galvanisiert-Wiedersehen in DI H₂O, passives Tensid zu entfernen.
6. Lösen Sie sanft die galvanisiert PPy Platte aus dem ITO Glas mit einer Rasierklinge.
   1. Lagern Sie die PPy Platte bei Raumtemperatur.

4. Vorbereitung der Polydimethylsiloxan (PDMS)

1. Mit einem Spatel und eine Schüssel wiegen, 18 g des Basis-Agents mit 2 g härter mischen und den Teig in zwei 10 cm x 8 cm Glasformen.
2. Entfernen Sie die Luftblasen aus den Formen mit einer Vakuumkammer für 15-20 Minuten.
3. Legen Sie die Formen in einem 70 ° C Backofen für 3 h.
4. Sobald Sie abgekühlt, einem Spatel flach die PDMS aus den Formen entfernen.

5. Herstellung von In-vitro- Elektrostimulation Kammer

1. Autoklaven die Metallplatten (WxL, 2,5 cm x 12,5 cm) und den Fluss Ventile bei 120 ° C für 1 Stunde.
2. Schneiden Sie eine Kammer-Folie als Vorlage verwenden, zwei Stücke von PDMS.
   Hinweis: Einteiler des PDMS dient als der Rand der Zelle Kammer mit Ausschnitten von zwei angrenzenden Quadrate von innerhalb der Zelle Kammer. Das andere Stück PDMS ist eine Gliederung der Kammer Perimeter.
   1. Schneiden Sie das innere Zelle Kammer damit es quadratisch ist geformt und entspricht der Form der Zelle Kammer. Sicherstellen Sie, dass die allgemeine Form der beiden Stücke von PDMS rechteckig ist und der der Kammer-Folie entspricht.
3. Schicht der Materialien wie folgt von unten nach oben: (1) Metall-Platte, (2) PDMS (ohne Ausschnitte), (3) PPy Platte (senkrecht zur PDMS), (4) PDMS (mit Ausschnitten) und (5) Zelle Kammer.
4. Klemmen Sie den Apparat zusammen, sobald sie vollständig ausgerichtet ist.
5. Schneiden Sie zwei 60 cm Stücke aus einem Metalldraht und mit Silberpaste einen Draht an jedem Ende der PPy Platte befestigen, die von außen der Kammer ragt. Stellen Sie sicher, dass die Kabel lang genug sind, um aus der Vorrichtung an der Außenseite der Inkubator zu verlängern.
6. Sobald die Silberpaste geheilt ist, zu verstärken und die Drahtverbindung mit Epoxidharz zu versiegeln.
   1. Notieren Sie den Widerstand mit einem Multimeter um sicherzustellen, dass das angewandte Feld das gleiche in jeder Kammer ist.
   2. Entfernen Sie für die Implantation die Kabel; muss die Zelle Kammern und PDMS und dann sie getrennt von dem leitenden Gerüst. Die Dimension der implantierten Gerüste ist ca. 1 x 3 x 0,25 mm.

6. plating menschlichen neuronalen Vorläuferzellen (hNPCs) auf Wiedersehen

1. Sterilisieren Sie die zusammengesetzten Kammern unter UV-Licht für 2 Stunden.
   1. Nach 1 Stunde, drehen Sie den versammelten Kammern 90°.
2. Nach Sterilisation Mantel der Oberfläche der PPy an der Unterseite der Kammer mit 800 µL eines Substrats, Beschichtung und das Substrat, auf Wiedersehen-Platte in einem Inkubator bei 37 ° C um 5 % CO₂ für 1 h zu festigen.
3. Entfernen Sie nach 1 Stunde den überstand von Kammern und sanft Spülen mit 1 mL des DPBS + Ca + Mg pro Bohrloch.
   Hinweis: Vermeiden Sie, waschen die Oberfläche des PPy mit Nachdruck als die Ablösung des Substrats Beschichtung dadurch.
4. Trennen Sie mit Frischzellen-Media, mechanisch kultivierte Zellen für den Einsatz mit den Kammern aus einer Gewebekultur-Platte mit sanften pipettieren.
   Hinweis: Zellen sollte 90-100 % Zusammenfluss bei Dissoziation.
5. Sammeln Sie hNPC Pellets mit Zentrifugation bei 8000 X g für 5 Minuten.
6. Mit einer Hemocytometer, zählen und Aufschwemmen der Zellen bei einem Volumen von 100.000 Zellen/cm².
7. Platte 100.000 Zellen in jeder Kammer gut (100.000 Zellen/cm² in 1 mL der Medien).
8. Zurück Kammern zum Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO_2.

7. die elektrische Stimulation von hNPCs

1. Einen Tag nach der Aussaat verwenden die Zellen auf die Kammern einen Wellenform-Generator elektrischen Stimulation der Zellen anwenden.
2. Vor Stimulation auch jede Kammer alte Medien entnehmen und mit 800 µL frische Medien ergänzen.
3. Nachdem die Medien geändert werden, setzen Sie die Kammern wieder in den Inkubator, erweitern Sie die Drähte aus dem Inkubator und bringen Sie sie zu einem Waveform-generator
4. Wenden Sie die Stimulation auf die Zellen mit einem Rechtecksignal bei ±400 mV mit 100 Hz für 1 h.
5. Entfernen Sie nach der Stimulation die Kabel und inkubieren Sie die Kammern für einen weiteren Tag im Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO₂eingestellt.
6. Führen Sie nachfolgende biologische Analyse einschließlich Zellviabilität und quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) nach der Hersteller-Protokolls.

8. in Vivo PPy Implantation

1. Führen Sie distale mittlere zerebrale Arterie (dMCA) Okklusion Schlaganfall Modelle auf T-Zell-defizienten Erwachsene männlichen nackte Ratten (NIH-RNU 230 ± 30 g) wie zuvor beschrieben². Durchführen Sie Implantation einer Woche Post-dMCA Okklusion.
2. Geben Sie einen Tag vor der Operation Ampicillin (1 mg/mL), die Ratten in ihrem Käfig Wasser.
3. Betäuben Sie die Ratte in eine Induktion Kammer mit 0,5 - 3 % mg/kg Isofluran per Inhalation verabreicht.
4. Bestätigen Sie Anesthetization der Ratte durch einen Mangel an Zehe Prise reflex Antwort.
   1. Während das Tier in Narkose ist, weiterhin seine Membran Farbe, Atmung und rektale Temperatur überwachen alle 15 Minuten.
5. Sobald Anesthetization bestätigt wurde, gelten Sie künstliche Tränen in Augen der Ratte um Trockenheit zu verhindern.
6. Sicherstellen Sie, dass aseptischer Technik während dieses Verfahrens beibehalten wird, mithilfe von sterilen Handschuhen und ein steriles op-Tuch-¹³. Halten Sie sterile chirurgische Instrumente in einem sterilen Bereich.
7. Während die Ratte unter Narkose ist, Bohren Sie ein kraniektomien oberhalb der linken Cortex. Öffnen Sie die Dura.
   1. Die Dura Mater aus dem Gehirn mit einer Mikro-dünne chirurgische Nadel zu entfernen.
8. Implantat-leitfähige Gerüste aus in-vitro- System auf die Ratte Kortex.
   Hinweis: Für unsere Experimente implantiert wir Gerüste von in-vitro- Tag 3 nach hNPC Beschichtung.
   1. Legen Sie das Implantat in erster Linie auf der Halbschattenphase Kortex medial der Schlaganfall-Läsion.
9. Nachdem das Gerüst platziert ist, legen Sie Surgicel über dem Implantat, Bewegung mit Haut-Verschluss zu verhindern.
10. Naht die Wunde geschlossen und subkutan injizieren die Ratten mit Buprenorphin SR in einer Dosierung von 1 mg/kg, die Schmerzen im Zusammenhang mit der stereotaktischen Chirurgie und dMCA Okklusion zu verwalten.
11. Legen Sie die Ratte in einem Käfig Erholung, wie es das Bewusstsein wiedererlangt.
    1. Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt während er bewusstlos ist.
    2. Legen Sie das Tier mit anderen nicht, bis es vollständig Bewusstsein erlangt hat.
12. Beobachten Sie Tiere täglich auf Anzeichen von Schmerzen einschließlich Körper Gewichtsverlust, verminderte Essen/Wasseraufnahme, reduzierte Pflege/ungepflegten Mantel, spontane Aktivität verringert/erhöht, abnorme Körperhaltung, Dehydrierung/Haut Zelten, eingefallenen Augen, versteckt, Selbstverstümmelung, schnelle Atmung, offenen Mund atmen, Zuckungen, Zittern, Tremor und Vokalisation.
    1. Beobachten Sie die Tiere täglich bis es erscheint, dass sie essen, trinken, Pflege, und Gewichtszunahme; und dann wöchentlich nach Gewicht zu gewinnen.
13. Frühen Euthanization über CO₂ Inhalation und eine sekundäre Bestätigung des Euthanization (um sicherzustellen, das Tier wird nicht durch normale Versorgung Post CO₂ Sauerstoffinhalation wieder beleben) erfolgt für jedes Tier, das scheint nicht zu essen, trinken und Gewichtszunahme nach dem ersten chirurgischen Eingriff; erscheint in Schmerz; oder erscheint nicht in der Lage, die Verhaltensstörungen Tests durch eine größer als motorische Kortex Defizit erwartet abgeschlossen.

Ergebnisse

In Abbildung 1 gezeigten Schaltplan repräsentiert den gesamten Arbeitsablauf der elektrischen Stimulation des hNPCs und mögliche downstream-Anwendungen. Eine Strombegrenzung in Stammzell-Therapie ist, dass Stammzellen nach Transplantation Umgebungen einschließlich Entzündungen und ischämischen Bedingungen ausgesetzt sind. Diese schwierigen Bedingungen wahrscheinlich begrenzen ihre therapeutische Wirksamkeit^14,

Diskussion

Immer mehr Hinweise hat das Versprechen von Stammzellen als eine neuartige Schlaganfall-Therapie gezeigt. Dieses Versprechen führte eine Hauptbemühung, Stammzell-Therapie um das Krankenbett mit mindestens 40 laufenden oder abgeschlossenen klinischen Studien zu gelangen. Schlaganfall-Pathologie bietet eine einzigartige neurologische Störung, die eignet sich für Stammzell-Therapie, weil nach der akuten Beleidigung gibt es keine Neurodegenerative Prozess, d.h. die Wiederherstellung. Der genaue Mechanismus der Stammzelle...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
FGF-Basic	Invitrogen	CTP0261	20 ng/mL for working media
Matrigel	Corning	cb40234a	1:200 dilution
LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL)	EMD Millipore	LIF1010	10 ng/mL for working media
Sylgard 184 silicone 3.9 kg	Fisherbrand	NC0162601
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA56-4
Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical	Fisherbrand	SA95
ITO Glass	Delta Technologies	CG-40IN-0115
Sodium dodecylbenzenesulfonate	Sigma	289957-1KG
Pyrrole	Sigma	131709-500ML	Protect pyrrole solution from light and room temperature
8 well glass slide chambers	Thermo Sci Nuc	125658	Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions
Flat-Surface Bracket, 3"x1"	McMaster-Carr	1030A4
TWO PART SILVER PAINT 14G	Electron Microscopy Sciences	1264214	Mix two parts (1:1) in plastic plate
DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red	Genesse	25-508C
AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit	Aruna Biomedical	ABNS7013.2
hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit	Aruna Biomedical	hNP7013.1
Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD	McMaster-Carr	5330K22
Multimeter	Keysight	E3641A
Wavefoam generator	Keysight	33210A-10MHz
Pt meshes	Sigma-Aldrich	298107-425MG	Reference electrode with dimensions, 1x1 cm
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Thermo Fisher Scientific	L3224
BDNF	Thermo Fisher Scientific	Hs02718934_s1
THBS1	Thermo Fisher Scientific	Hs00962908_m1
GAPDH	Thermo Fisher Scientific	Hs02758991_g1
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106
QIAshredder (250)	Qiagen	79656
RNase-Free DNase Set (50)	QIAGEN	79254
iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns	BIORAD	1708891
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4369510
7-8 Week Old, male, RNU Rats	NCI-Frederick
4-0 Ethicon Silk Suture	eSutures.com	683G
Isoflurane	Henry Schein	29405
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901806
Surgicel Original Absorbable Hemostat	Ethicon	1952
Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat	Stoelting	51600
Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves	Fisherbrand	19-063-130
Sterile Drape	Medline	DYNJSD1092
Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades	Fisherbrand	53-34
Walter Stern Scalpel Blade Series 300	Fisherbrand	17-654-456
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4484642
Frazier Micro Dissecting Hook	Harvard Apparatus	52-2706