Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

Zusammenfassung

In diesem Artikel besprechen wir drei Gehirn-Präparate für die ganze Zelle Patch Clamp Aufzeichnung die Retinotectal Schaltung von Xenopus Laevis Kaulquappen zu studieren. Jede Vorbereitung, mit ihren eigenen spezifischen Vorteilen, trägt zur experimentellen Lenkbarkeit des Xenopus Kaulquappe als Vorbild für neuronale Schaltkreis-Funktion zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Xenopus Kaulquappe Retinotectal Schaltung, bestehend aus der retinalen Ganglienzellen (Routinggruppenconnectors) in das Auge, welches Formular direkt auf Neuronen in der optic Tectum Synapsen, ist ein beliebtes Modell, wie neuronale Schaltkreise zu studieren selbst zusammensetzen. Die Fähigkeit zur Durchführung der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahmen vom tectal Neuronen und zum Rekord RGC-evozierten Antworten, entweder in Vivo oder mit einer ganzen Gehirn Zubereitung, hat einen großen Körper der hochauflösenden Daten über die normalen Mechanismen erzeugt , und abnorme, Schaltung Bildung und Funktion. Hier beschreiben wir in Vivo Vorbereitung, die ursprüngliche ganze Gehirn-Vorbereitung, Durchführung und mehr vor kurzem horizontalen Gehirn Slice Vorbereitung für den Erhalt der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahmen von tectal Neuronen. Jede Vorbereitung hat einzigartige experimentelle Vorteile. Die in Vivo -Vorbereitung ermöglicht die Aufzeichnung der direkte Reaktion des tectal Neuronen auf visuelle Reize, die auf das Auge projiziert. Die ganze Gehirn Vorbereitung ermöglicht die RGC Axone sehr kontrollierte Art und Weise aktiviert werden, und die horizontalen Gehirn Slice Vorbereitung ermöglicht die Aufnahme von über alle Ebenen der Tectum.

Einleitung

Die Retinotectal-Schaltung ist der Hauptbestandteil des Sehsystems Amphibien. Es umfasst die Routinggruppenconnectors im Auge, die ihre Axone, die optic Tectum Projekt wo sie synaptische Verbindungen mit tectal postsynaptischen Neuronen bilden. Die Xenopus Kaulquappe Retinotectal Schaltung ist ein beliebtes Entwicklungs Modell Untersuchung neuronaler Schaltkreis Bildung und Funktion. Es gibt viele Attribute dieser Kaulquappe Retinotectal Schaltung, die es ein leistungsfähiges experimentellen Modell^1,2,3machen. Ein wichtiges Attribut, und der Schwerpunkt dieses Artikels ist die Möglichkeit, ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen aus tectal Neuronen, in Vivo oder über eine ganze Gehirn Vorbereitung durchzuführen. Mit einem Elektrophysiologie Rigg ausgestattet mit einem Verstärker, der Spannung und Strom-Klemme Aufnahmemodi unterstützt, können ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen eines Neurons Elektrophysiologie bei hoher Auflösung charakterisiert werden. Infolgedessen haben ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen von tectal Neuronen über die wichtigsten Phasen der Retinotectal Schaltung Bildung ein detailliertes und umfassendes Verständnis für die Entwicklung und Plastizität der intrinsischen^4,5 zur Verfügung gestellt ^{, 6 , 7} und synaptischen^8,9,10,11 Eigenschaften. Kombinieren ganze Zelle Patch Clamp tectal Neuron Aufnahmen, fördert die Möglichkeit, Gene oder Morpholinos Interesse an diesen Neuronen¹²und eine Methode, um visuelle Führung Verhalten über eine etablierte visuellen Vermeidung Test¹³ beurteilen die Identifizierung von Verbindungen zwischen Molekülen, Kreislauf-Funktion und Verhalten.

Es ist wichtig zu beachten, dass die hohe Auflösung, die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen gewonnenen Daten nicht mit neueren bildgebenden Ansätze wie die genetische Kalzium-Anzeige GCaMP6, da geht obwohl Kalzium Indikatoren mit die Bildgebung erlaubt von Calcium Dynamik über große Populationen von Neuronen gleichzeitig, es gibt keine direkte oder naheliegender Weise, dass die spezifischen elektrischen Parameter erhalten Sie durch die Messung der Fluoreszenz-Delta in den Somata, und es keine Möglichkeit, Spannung gibt Klemme das Neuron nach Maß Strom-Spannungs-Beziehungen. Klar, diese zwei unterschiedliche Ansätze, elektrophysiologische Aufnahmen und Kalzium Imaging, besitzen nicht überlappende stärken und erzeugen verschiedene Arten von Daten. Somit hängt der beste Ansatz von experimentellen konkret in Angriff genommen.

Hier beschreiben wir unsere Methode für den Erwerb der ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen von Neuronen der Kaulquappe optic Tectum mit einer in Vivo -Vorbereitung, ganze Gehirn Vorbereitung und eine neuere verändert ganze Gehirn-Vorbereitung, die in unserem Labor^{14 entwickelt wurde} . Im Abschnitt Vertreter Ergebnisse zeigen wir die experimentelle Vorteile jeder Vorbereitung und die verschiedenen Arten von Daten, die abgerufen werden können. Die Grenzen und Stärken der verschiedenen Zubereitungen, sowie Tipps zur Fehlerbehebung, sind in die Diskussion Abschnitt enthalten.

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Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Wyoming genehmigt. Alle Verfahren, einschließlich elektrophysiologische Aufnahmen erfolgt bei Zimmertemperatur ca. 23 ° C. Alle hier beschriebene Methoden sind für die Aufzeichnung von tectal Neuronen von Kaulquappen zwischen Entwicklungsstadium 42 und 49 (inszeniert nach Neiuwkoop und Faber¹⁵) optimiert.

1. in-Vivo -Vorbereitung

1. Die Kaulquappe zu betäuben.
   1. Legen Sie die Kaulquappe in eine kleine Petrischale mit Steinbergs Lösung mit 0,01 % MS-222 für ca. 5 Minuten.
      Hinweis: MS-222 aka "Tricaine" ist eine gemeinsame Fische und Amphibien Narkose. Die Kaulquappen sind aufgewachsen in der Steinberg-Lösung in mM: 0,067 KCl, 0,034 Ca (NO₃)₂•4H₂O, 0.083 MgSO₄•7H₂O, 5,8 NaCl, 4,9 HEPES.
   2. Sicherstellen Sie, dass die Kaulquappe tief betäubt (nicht mehr reagiert und nicht mehr schwimmen) bevor Sie mit Schritt 2 fortfahren.
2. Sichern Sie den narkotisierten Kaulquappe zu einem versunkenen Silikon Block auf dem Boden der Schale sezieren/Aufnahme.
   1. Verwenden eine Einweg-Transferpipette narkotisierter Kaulquappe auf eine Dissektion/Aufnahme-Schale mit externen Aufzeichnungslösung verschieben (115 mM NaCl, KCl, 2 mM 3 mM CaCl₂, 3 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, 1 mM Glukose; justieren pH bis 7,25 mit 10 N NaOH, Osmolarität 255 mOsm).
      1. Zur Minimierung von spontanen Muskel zuckt, Hinzufügen der Acetylcholin-Rezeptor-Blocker, Tubocurarin (100 µM), die externe Lösung. (In der Regel geschieht dies durch die Verwendung einer 200 µL Pipette 10 mL externe Lösung 100 µL einer 10 mM Tubocurarin Aktie hinzu).
   2. Mit Hilfe der Insekten Pins, sichern die Kaulquappe, Rückenseite, einem untergetauchten Block aus Silikon-Elastomer (z. B. Sylgard 184, siehe Materialtabelle für Details), die hat auf den sezierenden Gericht Boden geklebt worden.
      Hinweis: Die Platzierung der Pins ist kritisch: Legen Sie sie auf beiden Seiten des Gehirns, zu vermeiden, durchbohrt die afferenten RGC Axone ausreichend kaudalen dieses Projekt aus dem Auge und geben das Gehirn nur anterior optic Tectum (Abb. 1A).
3. Filet im Gehirn entlang der Mittellinie.
   1. Entfernen Sie für eine klare Sicht auf das Gehirn die Haut über das Gehirn durch einen oberflächlichen Schnitt entlang der Mittellinie mit einer sterilen Nadel 25 G.
   2. Filetieren Sie und das Gehirn entlang der gleichen Mittellinie Achse durch Einsetzen der Nadel in das Neuralrohr und ziehen sanft nach oben (dorsal) solche, die der dorsale Teil des Rohres sauber (abgetrennten) geschnitten wird beim Verlassen der Bodenplatte intakt (Abbildung 1B).
      Hinweis: Es ist wichtig, dass die Bodenplatte des Neuralrohrs intakt gelassen werden, weil die afferenten sensorischen Inputs über die Bodenplatte der Tectum eingeben.
4. Entfernen Sie die transparente ventrikuläre Membran, die die tectal Neuronen deckt.
   1. Bewegen Sie die Aufnahme Schale Elektrophysiologie-Rig und eine zerbrochenes Glas-Pipettenspitze, um ventrikuläre Membran darüberliegenden tectal Neuron Zelle stellen zu entfernen. Brechen Sie die Spitze von leicht über eine heikle Aufgabe Scheibenwischer ziehen.
   2. Schrauben Sie die Pipette in die Pipette Halterung und senken Sie es hinunter die optic Tectum über dem Mikromanipulator.
   3. Verwenden Sie die defekte Pipette um zu schälen die ventrikuläre Membran von der Tectum.
      Hinweis: Es ist nicht notwendig, die Membran aus der gesamten Tectum entfernen; ein kleines Fenster wird genügen und den Zugriff auf viele Neuronen.
5. Erhalten Sie die gesamte Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen.
   Hinweis: Der Ansatz von diesem Punkt an ist ähnlich Durchführung ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen von Maus Gehirnscheiben beschriebenen Segev, Et al. ¹⁶ (Abbildung 1C).
6. Zeichnen Sie die tectal Neuron Antworten auf ein ganzes Feld Lichtblitz auf die Netzhaut projiziert.
   1. Um ein ganzes Feld Lichtblitz auf die Netzhaut zu projizieren, platzieren Sie eine Glasfaser neben der Kaulquappe Auge. Am anderen Ende der optischen Faser ist eine LED im Einklang mit einem Variablen Widerstand, der für die leichte Leuchtdichte kontrolliert werden kann. Auslöser der LED durch den digitalen Ausgang des Verstärkers. Auf diese Weise aufgezeichnet ganze Feld, das Lichtblitze unterschiedlicher Intensität des Lichts werden können (Abb. 4A).

2. ganzes Gehirn Vorbereitung

1. Führen Sie Schritte 1.1 bis 1.3.
   Hinweis: Gibt es keine Notwendigkeit für Tubocurarin in die externe Lösung für dieses Präparat.
2. Das Gehirn zu isolieren.
   1. Verwenden Sie eine 25-G-Nadel Hinterhirn (Abb. 2A) zu durchtrennen.
   2. Um das ganze Gehirn von der Kaulquappe zu isolieren, führen Sie die Nadel sanft unter das Gehirn in einer kaudalen, rostral Richtung alle lateralen und ventralen Bindegewebe und Nervenfasern zu durchtrennen.
3. Sichern Sie das Gehirn in einen Block aus Silikon-Elastomer.
   1. Sobald völlig befreit, sichern Sie das Gehirn in einen Block aus Silikon-Elastomer indem man eine Nadel durch eines der olfaktorischen Birnen und einem anderen Stift durch das Hinterhirn (Abbildung 2B). Dies ist die optimale Konfiguration für die Aufnahme von tectal Neuronen.
4. Verschieben Sie die Schale mit der fixierten ganze Gehirn Vorbereitung vom sezierenden Anwendungsbereich der Elektrophysiologie-Rig. Entfernen Sie die ventrikuläre Membran mit einer Pipette Glasscherben, wie unter Punkt 1.4 beschrieben.
5. Legen Sie eine bipolare Elektrode anregendste auf Optik Chiasmus (wo kreuzen die Axon-Traktate von jedem Auge im Mittelhirn) um die RGC Axone direkt zu aktivieren.
   1. Ort der bipolaren anregende Elektrode rostral und fast neben dem großen mittleren Ventrikel. Die Optik Chiasmus befindet sich unmittelbar rostral zum großen mittleren Ventrikel (Abbildung 2B).
      1. Senken Sie sanft die anregende Elektrode nach unten auf die Optik Chiasmus derart, dass eine kleine Delle im Gewebe gebildet wird. Die bipolare Elektrode treibt ein Puls-Stimulator ermöglicht die Stärke der Stimulation genau kontrolliert werden.
6. Führen Sie die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme (Abbildung 2C), wie durch Segev, Et Al. beschrieben ¹⁶

3. horizontale Gehirn Slice Vorbereitung

1. Führen Sie Schritte 2.1 bis 2.3.
2. Verwenden Sie eine Rasierklinge, Verbrauchsteuern am seitlichen viertes (welche in Vivo am dorsalen vierten entspricht) von einer Seite von einem optic Tectum. Dieser Schnitt erfolgt parallel zur rostral-kaudalen Ebene, wie in Abbildung 3dargestellt.
3. Neu pin das Gehirn auf die Seite der Silikon-Elastomer mit den in Scheiben geschnittenen Seite nach oben (so dass die Somata und Neuropil direkt für die Aufnahme zur Verfügung steht) und die ventrikuläre Oberfläche des Gehirns abgewandten des Silikon-Elastomer-Blocks (Abbildung 3 B) (so, dass eine bipolare Elektrode auf die Optik Chiasmus platziert werden kann).
4. Durchführen Sie die ganze Zelle Patch Clamp oder lokale eingereichten mögliche Aufzeichnung (Abb. 3C), wie beschrieben durch Segev, Et al. ¹⁶

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Ergebnisse

Um Licht-evozierten Antworten zu erfassen ist ein ganzes Feld Lichtblitz auf die Netzhaut projiziert, während die resultierende Reaktion von einzelnen tectal Neuronen (Abb. 4A) erfasst wird. Dieses besondere Protokoll wurde entwickelt, um sowohl die Reaktion des Neurons, das Licht einschalten ("On" (Antwort) und dann ausschalten 15 Messen s später zu messen, die "Off-Antwort." Tectal Neuronen weisen in der Regel robuste ein- und Ausschalte...

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Diskussion

Alle in dieser Arbeit beschriebene Methoden sind für die Aufzeichnung von tectal Neuronen von Kaulquappen zwischen Entwicklungsstadium 42 und 49 (inszeniert nach Neiuwkoop und Faber¹⁵) optimiert. Stufe 42, die Kaulquappen sind groß genug und ausreichend entwickelt, dass die Insekten Pins auf beiden Seiten des Gehirns für in-Vivo -Aufnahmen und für die Durchführung des gesamten Gehirns Dissektion platziert werden können. In früheren Stadien, wenn die Kaulquappen im wesentlichen zwei...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stemi Stereo 508	Zeiss	495009-0006-000	Dissecting microscope
MS-222 "Tricane"	Finquel	ARF5G	Amphibian general anesthetic
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Used to prepare Stienberg's solution and external solution
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Used to prepare Stienberg's solution and external solution
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-1KG	Used to prepare Stienberg's solution and external solution
Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O)	Sigma-Aldrich	237124-500G	Used to prepare Stienberg's solution
Magnesium Sulfate (MgSO4)	Mallinckrodt Chemicals	6066-04	Used to prepare Steinberg's solution
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5080-500G	Used to prepare external recording solution
Magnesium Chloride (MgCl2)	J.T. Baker	2444-01	Used to prepare external recording solution
D-glucose Anhydrous	Mallinckrodt Chemicals	6066-04	Used to prepare external recording solution
Tubocurarine hydrochloride pentahydrate	Sigma	T2379	Nicotinic acetylcholine receptor antagonist
Insect Pins	Fine Science Tools	26002-10	0.1mm diameter stainless steel pins
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	761028	Preweighed monomer and curing agent kit
Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm	Fisher Scientific	AS4052	Small petri dishes
PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)	BD	305122	Syringe needles
1mL Slip Tip Tuberculin Syringe	BD	309659	Disposable, sterile syringes
Borosilicate pipette glass	Sutter Instrument	BF150-86-10HP	Pulled to desired specifications using pipette pulling machine
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97	Fabricates micropipettes for electrophysiology recording
Kimwipes Kimtech wipes	Kimberly-Clark	34120	Delicate task lint-free wipers
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B	Molecular Devices	1-CV-7B	Current clamp and voltage clamp headstage
MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller	Sutter Instrument	MP-285/T	Control for headstage on electrophysiology rig
Fiber-Coupled LED (Green)	Thorlabs	M530F2	Fiber optic cable paired with green LED
Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter)	FHC	30207	Bipolar stimulating electrode
ISO-Flex Stimulator	A.M.P.I. (Israel)	Contact manufacturer	Flexible stimulus isolator
Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier	Molecular Devices	2500-0157	Amplifier for voltage- and current-clamp recording
Digidata 1322A digitizer	Molecular Devices	2500-135	Data acquisition system for electrophysiology recording
Axio Examiner.A1	Zeiss	491404-0001-000	Microscope for electrophysiology
Micro-g Lab Table	TMC	63-533	Air table for electrophysiology microscope
Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit	Dell	D06D001	Computer running electrophysiology software
c2400 CCD camera	Hamamatsu	70826-5	Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging
7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades	Gillette	CMM01049	Platinum-coated stainless razor blades
Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-711-7M	Disposable Polyethylene transfer pipets