Eine familiäre Hypercholesterinämie menschlichen Leber chimärer Maus-Modell mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine menschliche Leber chimärer Maus-Modell der Familiäre Hypercholesterinämie mit menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten zu generieren. Dies ist ein wertvolles Modell zum Testen neuer Therapien für Hypercholesterinämie.

Zusammenfassung

Familiäre Hypercholesterinämie (FH) wird meist von geringer Dichte Lipoprotein (LDLR)-Rezeptor-Mutationen verursacht und führt zu einem erhöhten Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen früh einsetzende durch deutliche Erhöhung von LDL-Cholesterin (LDL-C) im Blut. Statine sind die erste Zeile von lipidsenkenden Medikamenten zur Behandlung von FH und andere Arten von Hypercholesterinämie, aber neue Ansätze entstehen in bestimmten PCSK9-Antikörpern, die nun in klinischen Studien getestet werden. Um neue therapeutische Ansätze für FH, neue Medikamente oder neue Rezepturen erforschen müssen wir in Vivo Modelle geeignet. Bestehen jedoch Unterschiede in der Lipid-Stoffwechselprofile im Vergleich zu Menschen ein zentrales Problem der verfügbaren Tiermodellen der FH. Um dieses Problem zu beheben, haben wir eine menschliche Leber chimärer Mausmodell mit FH induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) erzeugt-Hepatozyten (iHeps) abgeleitet. Wir verwendeten/Ldlr^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- / -} (LRG) Mäuse Immunabwehr von transplantierten menschlichen Zellen zu vermeiden und Beurteilung der Wirkung des LDLR-mangelhafte iHeps in ein LDLR null Hintergrund. Transplantierten FH iHeps könnte wieder zu bevölkern ca. 5-10 % der LRG Maus Leber basierend auf menschliches Albumin-Färbung. Darüber hinaus die eingepflanzt iHeps reagierte auf Lipidsenker und rekapitulierte klinische Beobachtungen der erhöhte Wirksamkeit der PCSK9 Antikörper gegenüber Statinen. Unsere menschlichen Leber Chimäre Modell könnte somit für präklinischen Erprobung neuer Therapien zur FH nützlich sein. Mit dem dasselbe Protokoll, ähnlich wie menschliche Leber chimeric Mäuse für andere FH genetische Varianten oder Mutationen, die entsprechend andere erblichen Erkrankungen der Leber kann auch generiert werden.

Einleitung

Low density Lipoprotein-Rezeptor (LDLR) fängt LDL-Cholesterin (LDL-C) im Blut, Cholesterinsynthese in der Leber zu modulieren. Mutationen im LDLR-Gen sind die häufigste Ursache für Familiäre Hypercholesterinämie (FH)¹. Statine wurden traditionell die erste Zeile von Medikamenten zur Behandlung von FH und andere Arten von Hypercholesterinämie (vererbt oder erworben). Statine hemmen 3-hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym eine Reduktase Cholesterinsynthese in der Leber²zu senken. Darüber hinaus erhöht die Statine LDLR-Ebenen auf der Oberfläche der Hepatozyten, Plasma LDL-C-Abstand zu fördern. Eine große Einschränkung der Behandlung mit Statinen ist jedoch, dass sie gleichzeitig induzieren die Expression von proprotein Konvertase Subtilisin/hexin 9 (PCSK9), ein Enzym, das LDLR bindet seinen Abbau³zu fördern. Dieser Effekt ist verantwortlich für die unzureichende oder sogar null Reaktion auf Statine bei vielen Patienten beobachtet. Dieser Mechanismus zu studieren, unerwartet, zur Entdeckung der eine alternative Möglichkeit zur Behandlung von Hypercholesterinämie führte. PCSK9-Antikörper, die kürzlich von der FDA zugelassen sind derzeit in klinischen Studien eingesetzt und zeigen höhere Wirksamkeit und bessere Verträglichkeit als Statine⁴. Der Erfolg von PCSK9 Antikörpern impliziert auch, dass möglicherweise gibt es andere Therapiemöglichkeiten den LDLR-Abbau-Weg (neben PCSK9) bei Patienten mit Hypercholesterinämie zu modulieren. Ebenso gibt es Interesse an der Entwicklung neuer Inhibitoren des PCSK9 als Antikörper, z. B. SiRNA Oligos⁵.

Um zu testen, neue Therapien für FH und im Allgemeinen jede andere Art von Hypercholesterinämie, sind geeignete in-Vivo -Modelle notwendig. Ein Hauptproblem der aktuellen in-Vivo -Modelle, meist Mäuse⁶ und⁷, Kaninchen sind ihre physiologische Unterschiede mit den Menschen. Entscheidend ist, gehören diese Probleme eine unterschiedliche metabolische Lipidprofil. Die Generation der menschlichen Leber Chimären Tiere⁸ könnte helfen, diese Einschränkung zu überwinden. Die menschliche Leber Chimäre Maus ist eine Art von "humanisierte" Maus mit seiner Leber aufgefüllt mit humanen Hepatozyten, z. B. primären humanen Hepatozyten (pHH)⁹. Ein Problem mit pHH ist, dass sie schnell erweiterte Ex Vivo, nicht verlieren ihre Funktion bei der Isolierung und eine begrenzte Quelle sind. Eine Alternative zu pHH ist die Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleitet von Hepatozyten (iHeps)¹⁰. Vor allem iPSCs sind patientenspezifischen und auf unbestimmte Zeit, so dass iHeps on Demand produziert werden kann, ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber frischen pHH angebaut werden können. Darüber hinaus können iPSCs auch leicht gentechnisch werden mit Designer Nukleasen zu korrigieren oder Mutationen in einem isogenen Hintergrund erlauben mehr Treue Vergleiche¹¹vorstellen.

Menschlichen Leber chimärer Maus mit eingepflanzt pHH zeigen Ähnlichkeiten zu den Menschen in der Leber Stoffwechselprofile, Medikament Antworten und Anfälligkeit für Hepatitis-Virus-Infektion-¹². Dadurch haben sie ein gutes Modell, Hyperlipidämie in Vivozu studieren. Die am häufigsten verwendete Mausmodelle basieren auf der/Fah^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- / -} (BRD) Maus¹³ und der uPA transgenen Maus⁸, in dem bis zu 95 % der Maus Leber durch pHH ersetzt werden kann. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht beschriebenen Interessanterweise eine menschliche Leber FH Chimäre Maus (bezogen auf die BRD-Maus) mit pHH von einem Patienten mit einem homozygot LDLR Mutation¹⁴. In diesem Modell Waldlandschaften humanen Hepatozyten hatte keine funktionale LDLR, aber die restlichen Maus Hepatozyten haben, wodurch das Dienstprogramm für die Durchführung von in-Vivo Tests von Medikamenten unter Berufung auf die LDLR-Weg.

Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll basierend auf unserer kürzlich veröffentlichtes Werk¹⁵ für FH-iHeps in die/Ldlr^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- / -} (LRG) Maus Leber Einpflanzen. Diese menschlichen Leber chimärer Maus eignet sich für die FH Modellierung und Durchführung von Drogentests in-vivo.

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden, bei denen die Verwendung von Tieren wurden vom Ausschuss für Verwendung von Leben Tiere in Lehre und Forschung (CULATR) von der University of Hong Kong genehmigt.

1. Vorbereitung und phänotypische Tests Maus

1. Generation von immungeschwächte Ldlr -Knockout (KO)-Mäusen.
   1. Verwenden Sie die Mäuse Stämme Ldlr^{- / -}, Rag2^{- /-}und Il2rg^{- / -} (siehe Tabelle der Materialien).
   2. Überqueren Sie Rag2^{- / -} Mäuse mit Il2rg^{- / -} Mäusen zu generieren Rag2^{- / -}/ Il2rg^{- / -} Mäusen, überqueren dann Ldlr^{- / -} Mäuse mit Rag2^{- / -} / Il2rg^{- / -} Mäuse, Ldlr^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- / -} (LRG) Mäuse¹⁵zu generieren. Im Alter von 3 bis 4 Wochen sammeln Sie genomischen DNA aus dem Ohr des Genotyps durch PCR und Sequenzierung zu bestimmen.
   3. Verwenden Sie im Alter von 8 bis 12 Wochen männliche LRG Mäuse als Empfänger für iHeps zum menschlichen Leber chimeric Mäuse generieren.
2. Füttern Sie die Mäuse mit eine fettreiche und cholesterinreiche Diät (HFHC) 7 Tage vor der Transplantation iHep Hypercholesterinämie entwickeln.
3. Zur Schädigung der Leber zu induzieren, der erleichtert die Verbreitung von eingepflanzt iHeps in der Leber, legen Sie die Mäuse in einen sterilen Behälter und bestrahlen sie mit einem Gamma-Strahler mit γ-Strahlen in einer Dosierung von 3 Gy 24 h vor Engraftment. Kehren Sie die Mäuse zu ihren Käfigen Gehäuse. Der gesunde Status dieser bestrahlten Mäuse kann überwacht werden, indem Sie ihr Gewicht messen.  Mäuse mit 20 % Gewichtsverlust oder größer werden eingeschläfert werden.

2. iHep Differenzierung und Dissoziation

LDLR heterozygot KO (+/-) oder homozygot KO (- / -) menschlichen iPSCs oder FH Patienten-iPSCs mit heterozygoten Mutationen in LDLR (FH iPSCs) werden verwendet, um iHeps zu produzieren. Die Generation der LDLR + /- oder- / - iPSCs und FH iPSCs ist in unserem vorherigen Bericht¹⁵beschrieben.

1. Gerichtete Differenzierung der iPSCs in iHeps
   Hinweis: Die Methode zur Differenzierung der menschlichen iPSCs in iHeps ist aus einem früheren Bericht¹⁶geändert.
   1. Drei Tage vor der Differenzierung (Tag-3), Samen beschichtet die iPSCs auf extrazelluläre Matrix 6-Well-Platten (siehe Tabelle der Materialien) in einer Dichte von 300.000 Zellen/Brunnen in 1,5 mL (auch im folgenden) menschlichen iPSC Wartung Medium (siehe Tabelle der Materialien ) mit 5 µM-ROCK-Inhibitor (Y27632) ergänzt. Kultur der Zellen bei 37 ° C in einem 5 % CO₂ befeuchteten Inkubator. Normalerweise reichen iHeps aus einer 6-Well-Platte 5 Mäusen einheilungschancen.
   2. 24 Stunden später (Tag-2) und 48 h später (Tag-1), das Medium zu frischem menschlichen iPSC Wartung Medium ohne ROCK-Hemmer verändern.
      Hinweis: iPSCs vor Differenzierung sollte zum Ausdruck bringen hohe OCT4 und NANOG, die durch quantitative RT-PCR, Immunfluoreszenz oder Durchflusszytometrie geprüft werden kann.
   3. Am Tag 0 der Differenzierung waschen Sie die Zellen mit RPMI 1640 einmal und dann fügen Sie RPMI 1640 mit 100 ng/mL Activin A und 25 ng/mL WNT3a ergänzt hinzu.
   4. Am Tag 1 und Tag 2 der Differenzierung verändern Sie das Medium für RPMI 1640 ergänzt mit 100 ng/mL Activin A.
      Hinweis: Wenn in diesem Stadium gibt es zuviel Zelltod (0 – 3 Tage), bis zu 0,5 % fetalen bovine Serum (FBS) kann das Medium zur Verbesserung der Zellviabilität hinzugefügt werden. Wir empfehlen jedoch, testen die minimale Menge an FBS für jede spezifische iPSC-Zeile hinzugefügt werden, da überschüssige FBS auch die Differenzierung beeinflussen kann.
   5. Am 3. Tag waschen Sie die Zellen mit DMEM einmal und wechseln Sie zu 2^Nd Stufe Mittel (20 % Serum Ersatz, 1 X nicht-essentiellen Aminosäuren, 2 M L-Glutamin, 0,1 M Beta-Mercaptoethanol und 1 % Dimethyl Sulfoxid in DMEM Medium). Verändern Sie das Medium jeden zweiten Tag bis 10. Tag.
      Hinweis: Am Tag 7, die Zellen sollten Confluence und Display klare Kanten erreicht haben. Möglicherweise gibt es einige undifferenzierte Bereiche erscheinen in diesem Stadium; ignorieren sie, wenn der Prozentsatz dieser Bereiche klein ist. Wenn der Anteil hoch ist, reduzieren Sie den Zusammenfluss von iPSCs am Tag 0 und die Höhe der FBS verwendet in der ersten Phase der Differenzierung.
   6. Am 10. Tag waschen Sie die Zellen mit Hepatozyten basal Medium einmal und wechseln Sie zu Hepatozyten Kulturmedium ergänzt mit 20 ng/mL menschlichen hepatischen Wachstumsfaktor und 20 ng/mL Oncostatin M iHep Reifung zu fördern. Verändern Sie das Medium täglich.
      Hinweis: in diesem Stadium > 90 % der Zellen nach Immunfluoreszenz-Färbung oder Flow-zytometrie für HNF4A, positiv sein sollte.
   7. Am Tag 15 – 17 sind die Zellen für Engraftment bereit. Optional kann der Überstand der Zellkultur gesammelt und bei-80 ° C zur Quantifizierung der sekretierten Albumin (ALB) von iHeps gespeichert.
      Hinweis: in diesem Stadium > 80 % iHeps für HNF4A, ALB und α1-Antitrypsin (AAT) nach Immunfluoreszenz Färbung positiv sein sollte. Rund sollten 60 – 70 % der Tag 17 iHeps positiv für ASGPR, Durchflusszytometrie gezeigt. In unseren Händen haben iHeps zu dieser Zeit optimalen Kapazität die Maus Leber wieder zu bevölkern; iHeps kann sezernieren höhere in-vitro-ALB aber auch alternde verzögert das Engraftment geworden.
2. Dissoziation und Laden des iHeps in eine Insulin-Spritze
   1. Bereiten Sie den erforderlichen Reagenzien und Materialien:
      1. 24 h vor Engraftment, tauen die erforderliche Menge (V = 40 µL * Mäuse Zahl) der extrazellulären Matrix in ein Eis-box in einem kalten Raum und 4 ° C Kühlschrank der Insulin Spritze und eine Schachtel mit 200 µL Tipps umgesetzt.
      2. Eine Stunde vor Engraftment, warme Zelle Dissoziation Enzyms ergänzt mit 50 µg/mL DNase ich auf Raumtemperatur und das RPMI 1640 Medium ergänzt mit 20 % Serum Ersatz auf Eis legen.
   2. Nehmen Sie Kontrast Phasenbilder (100 X und 200 X) des iHeps ihren Status, einschließlich der Zellmorphologie, Wachstum und Zelldichte aufzeichnen.
   3. IHeps mit 2 mL/auch der Raumtemperatur Ca^{2 +} und Mg^{2 +}waschen-PBS zweimal frei, und fügen Sie 1 mL der Zelle Dissoziation Enzym ergänzt mit 50 µg/mL DNase ich in jede Vertiefung. Die Zellen in den Brutkasten für 8 – 10 min zurücklegen.
      Anmerkung: Zur Verbesserung der Zelle Dissoziation mit Zelle Dissoziation Enzym waschen Sie die Zellen mit Ca^{2 +} und Mg^{2 +}-freie PBS. Zur Maximierung der Zellviabilität empfiehlt es sich, nicht mehr als 6 Brunnen pro Charge gleichzeitig abkoppelt. Darüber hinaus empfehlen wir die Zelle Dissoziation Enzymbehandlung auf weniger als 10 Minuten zu beschränken.
   4. Monitor Zellmorphologie unter die Lupe genommen. Wenn die meisten Zellen Runden werden, fügen Sie ein gleiches Volumen an kalten RPMI 1640 ergänzt mit 20 % Serum Ersatz in jede Vertiefung, pipette die Zellen sanft, von der Platte zu lösen und übertragen die Zellsuspension auf eine neue 15 mL Tube.
      Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig für die geernteten Zellen überleben. Wenn die Zellen schwer von der Platte zu lösen sind, ist es egal, ob einige der Zellen übrig geblieben sind. Wenn die Zellen wie große Quadrate der Monolage lösen, dann pipette vorsichtig nach Zentrifugation, eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten.
   5. Wiederholen Sie Schritt 2.2.4 für gut, bis fast alle angeschlossene Zellen gesammelt werden. Zentrifuge bei 200 X g für 3 min bei 4 ° C.
   6. Entfernen Sie den überstand und Aufschwemmen Sie Zellen mit 2 mL kaltem PBS in einer 15 mL Tube. Die Zellen vorsichtig, um zu erhalten eine einzellige Suspension und fügen Sie dann kaltem PBS zu einem Endvolumen von 1 mL Pipette * Anzahl der dissoziierten Brunnen. Zu guter Letzt durchlaufen Sie die Zellen ein 40 µm Zelle Sieb um Aggregate zu entfernen.
      Hinweis: Normalerweise können 1-2 x 10⁶ Zellen/Well nach Filterung geerntet werden.
   7. Aliquoten 20 µL der Zell-Aussetzung und 20 µL 0,4 % Trypan blau Lösung hinzufügen, dann zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zelle Zähler und erfassen die Konzentration der Zellsuspension als "C". Berechnen Sie das benötigte Volumen (V1 = [10⁶ * (n + 1)] / C, wo n ist die Anzahl der Mäuse zu aufgeprägt werden) der Zellsuspension (1 Million/Maus) für die intrasplenic Injektion.
   8. Aliquoten das erforderliche Volumen der Zellsuspension in 15 mL-Tuben und Zentrifuge bei 200 X g für 3 min bei 4 ° C.
   9. Entfernen den überstand, Aufschwemmen der Zellen in das entsprechende Volumen der kaltem PBS zu das Volumen der Zellsuspension (n + 1) * 55/2 µL (n = Anzahl der Mäuse), und fügen Sie dann ein gleiches Volumen der extrazellulären Matrix zu der letzte Band der Zellsuspension (n + 1) * 55 µL.
   10. Die kalte Insulin Spritze auf Eis legen, ziehen Sie den Kolben, 55 µL Zellsuspension in die Spritze zu übertragen und dann wieder den Kolben. Luftblasen vorsichtig zu entladen und die Spritze wieder auf Eis gelegt.
   11. 2.3.10 zu wiederholen, bis alle Spritzen mit den Zellen geladen wurden. Die Spritzen sind nun fertig für die Injektion.
       Hinweis: Um die Zellviabilität zu maximieren, empfehlen wir die halten der Zellen auf dem Eis nach Dissoziation. Stellen Sie für die oben genannten Schritte 2.2.4–2.2.11 sicher alles, was die Reagenzien vor Gebrauch bei 2 – 8 ° C gehalten werden.

3. Intrasplenic Injektion von iHeps

1. Die Mäuse mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) intraperitoneal injiziert zu betäuben. Tierarzt Salbe auf Mäuse Augen Trockenheit während des Anästhesie-Verfahrens zu verhindern, und überwachen Sie ihre Muskel-Reflexe um die Narkose Wirkung beobachten und beurteilen, Schmerzen.
2. Wenn Mäuse muskelreflex Stimulation verloren haben, legen Sie sie in der rechten Ecke, die seitlichen Dekubitus zu positionieren. Die Schnitt-Bereich in der linken Flanke für 5 – 8 min eine dicke Schicht von Enthaarungscreme zuweisen. Dann entfernen Sie die Enthaarungscreme und Haar durch den Bereich mit einem Wasser angefeuchteten Tupfer abwischen.
3. Schrubben Sie die linke Flanke mit Povidon-Jod oder alternativ mit 70 % Ethanol 3 Mal gefolgt von einer endgültigen Einweichen mit Povidon-Jod zur Desinfektion.
4. In einer Stufe 2 Biosafety Kabinett, platzieren Sie die Milz, die in der linken Flanke transparent visualisiert werden kann, und dann Einschneiden der Haut und Bauchdecke für 0,5 – 1 cm. Exteriorize die Milz durch Herausziehen das Fettgewebe sanft in der Nähe von es mit Spitzen Zange. Die Milz, die mit einem Tupfer vorsichtig zu stabilisieren.
5. Stechen Sie die Nadel der Spritze Insulin 3 – 4 mm in das Parenchym der Milz und injizieren Sie etwa 50 µL Zellsuspension sanft zu. Zurückziehen der Nadelöhrs und einem Wattestäbchen über die Injektionsstelle für 1 Minute, um Blutungen zu verhindern und Auslaufen des Materials.
6. Die Milz, das Peritoneum zurück und schließen Sie die Wunde mit 5: 0-Nylon-Fäden. Dann halten Sie Mäuse in einem warmen Kammer/Inkubator für 3 – 16 h sie wieder ihre normale Körpertemperatur und sie wiederbeleben. Mäuse, die operiert wurden sind nicht an die Gesellschaft anderer Tiere bis vollständig erholt zurückgegeben.
7. Das Trinkwasser Meloxicam (26 μg/mL) hinzu und injizieren Sie Buprenorphin (50 μg/kg) intramuskulär als entzündungshemmendes Medikament und Schmerzmittel, beziehungsweise. Monitor chirurgische Wunden täglich um eine Entzündung zu verhindern.
   Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle Instrumente und Zubehör für die Schritte 4 bis 7 steril sind.

4. Test der LDL-C-Plasmaspiegel

1. Am Tag 0, 7, 14, 21 und 28 nach Engraftment Zurückhalten der LRG Mäuse fest-seitliche Bewegung des Kopfes mit Two-Handed Restrain Methode zu minimieren, dann Punktion der Vena facialis mit der Lanzette. Blut wird nach der Entfernung der Lanzette zu fließen beginnen. Sammeln Sie rund 50 µL Blut in 1,5 mL Röhrchen mit 1 µL EDTA.
   Hinweis: Wenn der Griff zu eng ist, kann das gesammelte Blutvolumen reduziert werden und Mäuse können wegen Atemnot sterben.
2. Das Blut durch invertieren die Röhren mehrmals vorsichtig mischen und dann Zentrifuge bei 950 X g für 15 min. die Überstände zu sammeln und sofort bei-80 ° C aufbewahren.
3. Sobald die Proben gesammelt werden, das Plasma bei Raumtemperatur Auftauen und der LDL-C-Level mit einem LDL-C Detection Kit laut Handbuch des Herstellers zu testen.

5. in Vivo Drogentests in Chimeric Mäuse pfropfte mit LDLR + /- und FH-iHeps

1. Hypercholesterinämie induzieren, füttern Sie die Mäuse eine HFHC Diät 7 Tage vor Engraftment.
2. Bei 7 Tage nach dem Engraftment behandeln jede Gruppe von Mäusen mit Fahrzeug (PBS, subkutan injiziert), 10 mg/kg/Woche PCSK9 Antikörper (eine klinische Grade Formulierung PCSK9 monoklonaler Antikörper, auch subkutan injiziert), 10 mg/kg/Tag Simvastatin (40 mg/L mg / mL im Trinkwasser), oder kombinierte PCSK9 Antikörper und Simvastatin.
3. Maus-Plasma bei 0 (der Tag des Engraftment), 14, 21 und 28 Tagen nach dem Engraftment zu sammeln. Speichern Sie die Proben bei-80 ° C sofort.
4. Sobald die Proben zur Verfügung stehen, testen Sie das Plasma LDL Niveau mit einem LDL-C Detection Kit, laut Handbuch des Herstellers.

6. endotheliale Funktionstest

Endotheliale Funktion ist früh im FH betroffen und als Indikator für die Schwere der Krankheit oder zur Bewertung der Verbesserung mit verschiedenen Behandlungen in unserem Mausmodell getestet werden kann. Ein Stereomicrocope, Dissektion Pinzetten, Scheren, Draht Myograph, Datenerfassungshardware (siehe Tabelle der Materialien), und ein Computer sind dafür erforderlich.

1. Die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg Phenobarbital zu opfern. Inneren Organe zu entfernen, so dass die absteigende Aorta parallel zur Wirbelsäule sichtbar ist und durch Schere zusammen mit angrenzenden Gewebe und Herz zergliedert werden kann. Betrachten, die mit einer feinen Schere zu sezieren und legen Sie sie in kalten sauerstoffhaltigen Krebs-Lösung (mM: 119 NaCl, 4.7 KCl, 2,5 CaCl₂, 1 MgCl₂, 25 Nahco3₃, 1.2 KH₂PO₄und 11 D-Glucose).
2. Übertragen Sie betrachten in Krebs-Lösung auf einer Petrischale silikonbeschichteten. Heften Sie das Bindegewebe um die Aorta Position fixieren ohne dehnen. Unter einem Stereomikroskop, Verwendung feinen Pinzette Frühling die Schere und die Aorta, die frei von Fett und adventitial Gewebes zu sezieren, ohne Beschädigung der Gefäßwand, dann schneiden Sie es in 1,5 bis 2 mm Länge Segmente.
3. Schneiden Sie einen ca. 2 cm lang und 40 μm dicken Edelstahl Draht und legte sanft durch das Lumen der Aorta. Übertragen Sie das Segment der Draht Myograph Kammer gefüllt mit Sauerstoff angereichertes Krebs Lösung halten den Draht.
4. Um die Länge der Segmente betrachten Messen beim Studium der Kontraktilität, legen Sie jedes Segment senkrecht zwischen Kiefer und Aufzeichnung der Lesung (D₁) auf den Mikrometer. Segment zu entfernen und die Backen zusammen zu bewegen und Aufzeichnung der Lesung (D₀). Die Länge des Segments wäre L = D₁-D-₀.
5. Befolgen Sie die Anleitung um den Draht Spannen und sichern Sie es mit dem Schraubendreher, während das Segment zwischen die Backen zu platzieren, aber lassen Sie es ungedehnt.
6. Für Normalisierung vor dem Experiment die Myograph die ungedehnten Position auf NULL gesetzt. Dann langsam bewegen Sie die Kiefer auseinander und beobachten Sie die Aorta Spannung ändern bis 3 min zu erreichen. Nach 15 Minuten abtropfen lassen Sie die Lösung aus der Kammer Myograph und ersetzen Sie durch neue Krebs-Lösung, 15 min. warten Sie und stellen Sie die Spannung wieder auf 3 Mio.
7. Ändern Sie die Standardlösung Krebs Krebs KCl enthaltende Lösung induzieren eine Kontraktion für mindestens 15 min. Spülen mit frischen Krebs Lösung 3 x 60 mm.
8. Fügen Sie steigende Konzentrationen von Phenylephrin (Phe; z. B.von 10 nM bis 100 μm). Auswaschen mit Krebs-Standardlösung und Hinzufügen einer einzigen Konzentration von Phe bei ~ 70 % der maximalen Kontraktion bei der vorherigen Kontraktion. Wenn die Kontraktion stabil ist, fügen Sie steigende Konzentrationen von Acetylcholin (ACh; z.B.1 oder 3 nm bis 10 oder 30 µM), Vasodilatation zu induzieren. ACh wird in ca. 2 min Intervall hinzugefügt.
   Hinweis: In einigen Aortenstenose mit kleinen Phe-induzierten Kontraktion z. B. kleiner als 30 % KCl induzierte Kontraktion, U46619 (ein weiterer Vasokonstriktor) in einer Konzentration von 1 nM bis 30 nM kann verwendet werden, um eine stabile Kontraktion induzieren, die größer als 70 % der KCl-induzierten Kontraktion.
9. Reinigen Sie die Myograph laut Handbuch des Herstellers.
10. Mit Daten-Analyse-Software (siehe Tabelle der Materialien), Aufzeichnung der Kraft (F) nach jeder Zugabe von Medikamenten. Zeichnen die Markierung zum basalen Spannung (F_basale) für relativmessung, bewegen Sie den Pfeil auf dem höchsten Punkt nach Phe als F_Pheund dann bis zum tiefsten Punkt nach jeder Zugabe von ACh als F_ACh. Berechnen Sie die ACh-induzierte Endothel-abhängige Vasodilatation (EDV) durch % Entspannung = (F_ACh-F_basale) / (F_Phe-F_basale) auf der Y-Achse. Bereiten Sie eine Konzentrationskurve Antwort auf Statistiksoftware mit log10 Wert der Konzentration in M auf der X-Achse.
11. Um die Statistische Differenz zu analysieren, nutzen Sie die Fläche unter der Kurve der einzelnen Segmente von einer Maus, und analysieren Sie die Differenz der Fläche unter der Kurve unter Gruppen verwenden einfache ANOVA. Einzelne Punkte können auch analysiert werden, wenn nötig.

7. Nachweis der iHep Wiederbesiedlung in der Maus-Leber

1. Am Endpunkt Opfern Sie die Mäuse durch die intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg Phenobarbital.
2. Sammeln Sie Plasma durch Herzpunktion. Sezieren Sie Lappen der Leber mit ophthalmologischen Schere, dann Leber in ein 10-cm-Peri-Gericht und zweimal mit Kochsalzlösung waschen. Saline von der Leber Oberfläche mit Küchenpapier entfernen, dann die Lappen in um Länge von 0,6 cm Stücke schneiden. Befestigen Sie die Lappen der Leber in 10 % Formalin.
3. Betten Sie die festen Lebern in Paraffin und Abschnitt mit einem Gewebe Verarbeitung System und eine gleitende Mikrotom bzw. nach Herstellerangaben ein.
4. Erhitzen Sie die Folien auf 60 ° C für 1 h bis das Wachs zu schmelzen. Dann Tauchen Sie die Folien in Xylol für 5 min zweimal, und rehydrieren Sie das Gewebe mit 100 %, 90 % und 70 % Ethanol sukzessive.
5. Tauchen Sie die Folien in der Dia-Kammer, enthält etwa 50 mL Antigen-Retrieval-Lösung und setzen Sie dann die Kammer in den Schnellkochtopf, 120 ° C 1,5 min. waschen die Folien vorsichtig mit Rohr für 5 Minuten Wasser.
6. Färben Sie die Abschnitte mit primären Antikörper (rund 100 µL/Abschnitt) auf menschliche ALB (hALB) und menschlichen Zellkerne Antigen (hNA). Dann Fleck mit sekundären Antikörper konjugiert mit einem fluoreszierenden Etikett oder Meerrettich-Peroxidase (die mit dem DAB Detection Kit reagiert).
7. Um den Prozentsatz der hALB + Gebiete und hNA + Zellen berechnen, Scannen Sie die Dias mit Anti-hALB und Anti-hNA befleckt und reagierten mit DAB mit einer automatisierten Folie Abtastsystem ganzer Abschnitt Bilder zu bekommen.
   Hinweis: Ganze Abschnitt gescannten Bilder sind hilfreich, um Waldlandschaften Effizienz basierend auf hALB + Bereiche oder hNA +-Zellen in der Leber Immunohistochemistry gebeizt unvoreingenommen zu berechnen. Als eine alternative Methode zur iHep Wiederbesiedlung Effizienz zu überwachen kann menschliches Albumin-Plasmaspiegel mit einem menschlichen spezifische ALB ELISA-Kit getestet werden.
8. Nehmen Sie Schnappschüsse um die ganze Folie mit dem zugehörigen digitalen Schieber Viewer-Software unter 5 X Ansicht zu decken. Zur Quantifizierung des Prozentsatz der hALB + Bereiche für jedes Snapshotbild, das Mikroskop imaging-Software verwenden, um den positiven Bereich (P) und die Gesamtfläche (T) des Bildes zu qualifizieren und Bild J verwenden, um den leeren Bereich (B) zu qualifizieren. Der Anteil der hALB + Bereiche wird ausgedrückt als P/(T-B) * 100 %. Für jede Gruppe sollte mindestens 3 Mäuse ausgewählt werden. Und für jede Maus mindestens 4 Abschnitte aus verschiedenen Positionen der Leber gewählt werden.
9. Zur Quantifizierung des Prozentsatz der hNA + Zellen für jedes Snapshotbild, nach dem Zufallsprinzip auswählen 1/16 des Bereichs mit einer Bildverarbeitungs-Software, und dann manuell die Anzahl der insgesamt Kerne (T) und hNA + Kerne (N). Der Anteil der hNA + wird ausgedrückt als N/T * 100 %. Für jede Gruppe sollte mindestens 3 Mäuse ausgewählt werden. Für jede Maus sollte mindestens 4 Abschnitte aus verschiedenen Positionen der Leber ausgewählt werden.

Ergebnisse

Gerichtete Differenzierung der menschlichen iPSCs in iHeps
Beim Zusammenfluss von 70 % zu erreichen, werden menschliche iPSCs in iHeps mit einem 3-Stufen-Protokoll¹⁶ (Abbildung 1 obere Leiste) unterschieden. Nach 3 Tagen Entoderm Differenzierung werden iPSC Kolonien gelockert und breitete sich auf volle Zusammenfluss (Abbildung 1 untere Leiste). Dann mit 2^Nd Stufe Mittel, Hep...

Diskussion

Frühere Studien mit iHeps bei Nagetieren haben bestätigt, dass sie ein wirksames Mittel zur Leber Erbkrankheiten¹⁷zu studieren sind. Weiter erweitern den Einsatz dieser Technologie und weil aktuelle FH Tiermodelle suboptimal sind, wir pfropfte FH iHeps in LRG Mäuse und zeigte, dass die eingepflanzt LDLR + / oder heterozygot LDLR-mutierte FH iHeps können Mäuse Plasma LDL-C Ebene reduzieren und reagieren auf Lipid-senkende Medikamente in Vivo.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
40 µm Cell strainer	BD	B4-VW-352340
6-Well plate	Thermofisher	140675	Extracellular matrix coated
Accutase	Millipore	SCR005
Acetylcholine	Sigma Aldrich	A6625	Dissolve in water
Antigen retrieval solution	IHC World	IW-1100-1L
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C8106	CaCl2
Cell dissociation enzyme	Thermofisher	12604-013	TrypLE
D-glucose	Sigma Aldrich	D8270
Dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	D5879	DMSO
DMEM	Thermofisher	10829	Knockout DMEM
DNase I	Roche	11284932001
EDTA	USB	15694	0.5 M, PH=8.0
Extracellular matrix (for cell suspension)	Corning	354234	Matrigel
Extracellular matrix (for iHep differentiation)	Corning	354230	Matrigel
Hepatocyte basal medium	Lonza	CC-3199
Hepatocyte culture medium	Lonza	CC-3198
High-fat and high-cholesterol diet	Research Diet	D12079B
Human Activin A	Peprotech	120-14E
Human hepatocyte growth factor	Peprotech	100-39
Human iPSC maintenance medium	STEMCELL Technologies	5850	mTeSR1
Human oncostatin M	Peprotech	300-10
Ketamine 10%	Alfasan	N/A
L-glutamine	Thermofisher	35050
LDL-C detection kit	WAKO	993-00404 and 993-00504
Magnesium chloride	VWR	P25108	MgCl2
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	NADA 141-213
Monopotassium phosphate	USB	S20227	KH2PO4
Non-essential amino acids	Thermofisher	11140
PBS	GE	SH30256.02	Calcium and magnesium-free
PCSK9 antibodies	Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals	SAR236553/REGN727	Alirocumab
Phenobarbital	Alfamedic company	013003
Phenylephrine	RBI	P-133	Dissolve in water
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333	KCl
Povidone-iodine	Mundipharma	Betadine
Recombinant mouse Wnt3a	R&D Systems	1324-WN-500/CF
ROCK inhibitor Y27632	Sigma Aldrich	Y0503-5MG
RPMI 1640	Thermofisher	21875
Serum replacement	Thermofisher	10828
Silicone coated petri dish	Dow Corning	Sylgard 184 silicone elastomer kit
Simvastatin	Merck Sharp & Dohme	ZOCOR
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6297	NaHCO3
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S7653	NaCl
Trypan blue solution 0.4%	Thermofisher	15250061
U-46619	Cayman	16450	Dissolve in DMSO
Xylazine 2%	Alfasan	N/A
β-mercaptoethanol	Thermofisher	31350
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
AAT	DAKO	A0012	1:400
ALB	Bethyl Laboratories	A80-129	1:200
ASGPR	Santa Cruz	Sc-28977	1:100
HNF4A	Santa Cruz	Sc-6557	1:35
NANOG	Stemgent	09-0020	1:200
OCT4	Stemgent	09-0023	1:200
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Il2rg-/-	Jacson lab	003174
Ldlr-/-	Jacson lab	002077
Rag2-/-	Jacson lab	008449
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Automated cell counter	Invitrogen	Countess
Gamma irradiator	MDS Nordion	Gammacell 3000 Elan II
Insulin syringe	BD	324911
Powerlab	ADInstruments	Model 8/30
Slides scanning system	Leica biosystems	Aperio scanScope system
Sliding Microtome	Leica biosystems	RM2125RT
Stereomicrocope	Nikon	SMZ800
Tissue processing system	Leica biosystems	ASP200S
Wire myograph	DMT	610M
Name	Company	Catalog Number	Comments
Softwares
Digital slide viewing software	Leica	Aperio ImageScope Version 12.3.2
Image J	NIH	Version 1.51e
Image processing software	Adobe	Photoshop CC Version 2015
Microscope imaging software	Carl Zeiss	AxioVision LE Version 4.7