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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist, spektralphotometrisch Trans-Plasma Membran Elektronentransport Nutzung extrazelluläre Elektronen Akzeptoren überwachen und enzymatische Interaktionen zu analysieren, die mit dieser extrazellulären Elektronen-Akzeptoren auftreten können.

Zusammenfassung

Trans-Plasma Membran Elektronentransport (tPMET) spielt eine Rolle im Schutz der Zellen vor intrazellulären reduktiven Stress sowie Schutz vor Schäden durch extrazelluläre Oxidantien. Dieser Prozess für den Transport von Elektronen von intrazellulären Reduktionsmitteln extrazelluläre Oxidantien ist nicht gut definiert. Hier präsentieren wir Ihnen spektralphotometrische Proben von C2C12 Myotubes tPMET unter Verwendung der extrazellulären Elektronen-Akzeptoren zu überwachen: wasserlösliche tetrazoliumsalz Salz-1 (WST-1) und 2,6-Dichlorophenolindophenol (‑Aufklärung oder DCIP). Durch die Reduzierung der diese Elektronen-Akzeptoren sind wir in der Lage, diesen Prozess in eine Echtzeit-Analyse zu überwachen. Mit dem Zusatz von Enzymen wie Ascorbat Oxidase (AO) und Superoxid-Dismutase (SOD) für die Tests können wir bestimmen, welcher Teil des tPMET durch Ascorbat Export oder Superoxid Produktion, bzw. ist. Während WST-1 zu stabilen Ergebnissen mit niedrigen Hintergrund gezeigt wurde, konnte ‑Aufklärung nach der Zugabe von AO und SOD, die photometrische Analyse zeigte wieder oxidiert werden. Diese Methode zeigt einen in Echtzeit, Multi-gut, schnelle photometrische Assay mit Vorteilen gegenüber anderen Methoden verwendet, um tPMET, wie ferricyanid (FeCN) und Ferricytochrome C Reduktion zu überwachen.

Einleitung

Die Fähigkeit des gereinigten Plasmamembranen, Elektronen-Akzeptoren reduzieren führte zu der Ansicht, dass der Plasmamembran ein Redox-inhärente Kapazität1hat. Zuvor in Pilzen, Pflanzen und Tiere gesehen, ist tPMET ein Prozess üblich, mehrere Organismen2,3,4,5. Insbesondere wurde dabei in Saccharomyces Cerevisiae, Karotte Zellen, Erythrozyten, Lymphozyten, Osteosarkom, Melanom, Makrophagen, Skelettmuskel und Neutrophilen2,3, nachgewiesen 4 , 5 , 6 , 7. in einem Prozess, der Elektronen über die Plasmamembran extrazelluläre Oxidantien reduzieren transportiert, tPMET engagiert sich in vielen Zellfunktionen einschließlich: Zelle Wachstum5,8, Zelle überleben9, Eisen Stoffwechsel10, Zelle11,12,13, und Schutz vor reaktiven Sauerstoff-Spezies12,14,15. Aufgrund des tPMET Engagements in vielen Zellfunktionen, Hypothese aufgestellt die ein Ungleichgewicht von tPMET als Beitrag zu der Entwicklung von einigen schweren gesundheitlichen Bedingungen, einschließlich Krebs16, Herz-Kreislauf-Krankheit17, und Stoffwechselerkrankungen Syndrom18.

Es gibt mehrere Möglichkeiten, um die Übertragung von Elektronen in der Plasmamembran zu überwachen, aber die am häufigsten verwendete Technik ist die Reduzierung der extrazellulären Elektronen Akzeptoren durch farbmetrische Assays zu beurteilen. Häufig verwendete extrazelluläre Elektronen Akzeptoren sind tetrazoliumsalz Salze, ‑Aufklärung, FeCN und Ferricytochrome C19,20. Das am häufigsten verwendete Tetrazolium-Salz ist als WST-119eine zweite Generation Salz bekannt. Diese Verbindung ist einfacher zu nutzen in farbmetrische Untersuchungen im Vergleich zur ersten Generation tetrazoliumsalz Salze durch zwei Sulfonate Gruppen, die die Wasser Löslichkeit21zu erhöhen. WST-1, wird in Verbindung mit der mittleren Elektron Akzeptor 1-Methoxy-phenazinderivat Methosulfate (Komponenten), in zwei Einzel-Elektronentransfer Ereignisse reduziert. Diese Reduktion ändert die schwach gefärbte oxidierte Form von WST-1 zu einer intensiveren, gelbe Formazan20,22. WST-1 hat eine hohe molare Aussterben Koeffizient von 37 x 103 M-1cm-1, führt zu einer hohen Assay Empfindlichkeit21,22. ‑Aufklärung wird auch als eine extrazelluläre Elektron Akzeptor tPMET Überwachung genutzt. Es hat sich gezeigt, dass ‑Aufklärung tPMET ohne die Hilfe eines zwischengeschalteten Elektronen Akzeptoren23,24extrazellulär gesenkt werden kann. Aufgrund des Fehlens der Mittelstufe Elektronen-Akzeptoren ‑Aufklärung können direkt Pick-up Elektronen aus der Plasmamembran, im Gegensatz zu WST-124. Ähnlich wie bei ‑Aufklärung, FeCN nachweislich extrazellulär tPMET ohne die Hilfe eines zwischengeschalteten Elektronen Akzeptoren19,24, ferrocyanid gesenkt werden. Im Gegensatz zu WST-1 und ‑Aufklärung hat FeCN eine niedrige molare Aussterben Koeffizient führt zu einem geringeren Assay Empfindlichkeit9. Eine andere häufig verwendete extrazelluläre Elektron Akzeptor, tPMET zu überwachen ist Ferricytochrome c. WST-1, Ferricytochrome C Reduktion steigt mit dem Einsatz von mittleren Elektron Akzeptor, Komponenten22ähnlich. Im Gegensatz zu WST-1 ist jedoch die Ferricytochrome C Methode aufgrund hoher Hintergrund und eine niedrige molare Aussterben Koeffizient22weniger empfindlich.

Hier präsentieren wir eine Methode zur Echtzeit-Analyse des tPMET durch photometrische Tests. Die Methode genutzt die extrazelluläre Elektronen-Akzeptoren WST-1 und ‑Aufklärung, da sie beide einen hohen molaren Aussterben Koeffizienten haben, während weniger teuer im Vergleich zu den anderen häufig extrazelluläre Elektronen-Akzeptoren wie Ferricytochrome c eingesetzt. Wir nutzten phenazinderivat Methosulfate (PMS) anstelle von Komponenten haben sie eine ähnliche chemische Zusammensetzung und PMS ist weit weniger teuer. Komponenten ist photochemisch stabilen ein wichtiges Merkmal für eine kommerzielle Kit, die eine lange Haltbarkeit. Jedoch machen wir PMS frisch für jeden Test, damit Stabilität kein Problem sein sollte. Wir präsentieren auch eine Methode zur Evaluierung möglicher enzymatischer Interaktionen (siehe Abbildung 1) zwischen der extrazellulären Elektron Akzeptor und Enzyme, die genutzt werden können, um den Prozess der tPMET weiter zu charakterisieren. Insbesondere ermitteln die Enzyme, die AO und SOD verwendet werden kann, welcher Teil des tPMET ist durch Ascorbat Transport oder extrazellulären Superoxid Version, zwei gängige Methoden für Elektronen über die Plasmamembran transportiert werden.

Protokoll

Hinweis: Siehe Abbildung 1 für einen schematischen Überblick über die wichtigsten Schritte.

1. Reduzierung der WST-1-Assay

  1. Wachsen Sie und differenzieren Sie C2C12 adhärente Zellen mit Standardzellen Kultur Verfahren7 in einer 96-Well-Platte mit Zeilen A-F.
    1. Verwenden Sie eine Differenzierung Medium aus der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 2 % Pferd Serum, 100 U/mL Penicillin und 0,1 mg/mL Streptomycin ergänzt. Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2.
    2. Bei der Überwachung von Ascorbat Beteiligung an tPMET ergänzen Sie Differenzierung Medien mit 100 µM Ascorbinsäure. Können Zellen auszubrüten in Differenzierung Medien für ~ 24-48 h.
  2. WST-1 und PMS Stammlösungen vorzubereiten.
    1. Um ein 10 mM Lager von WST-1 machen, lösen 0,033 g WST-1 (Formel Gewicht (FW): 651.34 g/Mol) in 5 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Shop bei 4 ° C.
    2. Um einen 5 mM bestand von PMS zu machen, lösen 0,0023 g von PMS (FW: 306.34 g/Mol) in 1,5 mL entionisiertem H2O (DiH2O). Bei-20 ° C lagern und vor Licht schützen.
  3. Fügen Sie 0,0108 g Glukose für eine Endkonzentration von 5 mM bis 11,4 mL PBS oder HEPES Kochsalzlösung gepufferten (HBS; 20 mM HEPES Natrium Salz, 140 mM NaCl, KCl, 2,5 mM MgSO4, 5 mM 1 mM CaCl2). Fügen Sie 480 µL 10 mM WST-1 für eine Endkonzentration von 400 µM und 48 µL 5 mM PMS für eine Endkonzentration von 20 µM.
  4. Bei der Überwachung von Ascorbat Beteiligung an tPMET teilen Sie die Lösung in zwei 6 mL-aliquoten. Eine Aliquote hinzugeben Sie 6 µL DiH2O und die anderen aliquoten fügen Sie 6 µL 2 kU/mL AO für eine Endkonzentration von 2 U/mL hinzu.
  5. Beim Überwachen der Superoxid-Beteiligung an tPMET teilen Sie die Lösung in zwei 6 mL-aliquoten. Eine Aliquote fügen Sie 55 µL 0.1 M KPO4 Puffer hinzu und fügen Sie der anderen aliquoten 55 µL 6,5 kU/mL SOD für eine Endkonzentration von 60 U/mL hinzu.
  6. Waschen Sie die Zellen mit PBS. Aspirieren Sie die Medien und fügen Sie 150 µL PBS hinzu. Dann Aspirieren der PBS.
    Hinweis: Der Test erfolgt mit vergoldeten, angeschlossenen Zellen. So gibt es keine Zentrifugation oder Verwendung von Trypsin im Waschprozess.
  7. Hinzufügen von 100 µL der WST-1-Lösung (-) SOD oder (-) AO, Spalten 1 bis 6 und 100 µL der WST-1-Lösung (+) SOD oder (+) AO Spalten 7 bis 12 in der 96-Well-Platte hinzufügen. Verwenden Sie Zeilen G und H als Hintergrund-Kontrollen (d. h.Änderung überwachen in Absorption in das Reagenz allein im Brunnen ohne Zellen).
  8. Messen Sie die Absorption Werte mit dem Spektralphotometer alle 10 min für 1 h bei 438 nm.
  9. Nach der Lektüre, Aspirieren Sie die Medien und waschen jeweils gut mit 150 µL PBS. Dann Aspirieren der PBS.
  10. Berechnen Sie die Änderung der Extinktion für jedes gut durch Subtraktion der ersten Extinktion für einen Brunnen aus der Extinktion zu jedem Zeitpunkt für das gut. Korrigieren Sie diese Änderung für die Änderung der Extinktion (falls vorhanden) in den Hintergrund-Brunnen (d.h., Brunnen mit Assay Lösung aber keine Zellen) beobachtet.
  11. Für die Analyse normalisieren die Extinktion Daten der Kontrollmessung 60 min oder waschen mit PBS oder HBS und führen Sie dann einen Bicinchoninic Säuren (BCA) Protein Assay.
  12. Hinzufügen von 2 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) Standard (Bereich von 0,5-2 µL für die Standardkurve, je nach dem Grad der Zusammenfluss der Zellen), die leeren Brunnen (Zeilen G und H), fügen Sie das BCA-Reagenz in alle Vertiefungen.
  13. Die Daten über Nmol WST-1 Reduktion pro µg Protein zu quantifizieren. Verwenden Sie 37 mM-1 cm-1 22 als vom Aussterben bedroht-Koeffizient für reduzierte WST-1 438 nm.

2. ‑Aufklärung-Reduktion-Assay

  1. Wachsen und C2C12 adhärente Zellen mit dem gleichen Verfahren wie Schritt 1.1 zu unterscheiden.
  2. Lager 10 mM ‑Aufklärung Lösung wie folgt vorbereiten. Lösen Sie 0,029 g ‑Aufklärung (FW: 290.08 g/Mol) in 10 mL DiH2O. bestätigen die Konzentration des ‑Aufklärung durch Messung der Extinktion bei 600 nm mit einem Spektrophotometer. Verwenden Sie 1 mM-1 cm-1 23 als vom Aussterben bedroht-Koeffizient für reduzierte ‑Aufklärung bei 600 nm. Shop bei 4 ° C.
  3. 11,880 mL PBS für eine Endkonzentration von 5 mM 0,0108 g Glukose hinzufügen. Fügen Sie 120 µL 10 mM ‑Aufklärung für eine Endkonzentration von 100 µM.
  4. Bei der Überwachung von Ascorbat Beteiligung an tPMET teilen Sie die Lösung in zwei 6 mL-aliquoten. Eine Aliquote hinzugeben Sie 6 µL DiH2O und die anderen aliquoten fügen Sie 6 µL 2 kU/mL AO für eine Endkonzentration von 2 U/mL hinzu.
  5. Beim Überwachen der Superoxid-Beteiligung an tPMET teilen Sie die Lösung in zwei 6 mL-aliquoten. Eine Aliquote fügen Sie 55 µL 0.1 M KPO4 Puffer hinzu und fügen Sie der anderen aliquoten 55 µL 6,5 kU/mL SOD für eine Endkonzentration von 60 U/mL hinzu.
  6. Aspirieren Sie die Medien und waschen Sie Zellen in 150 µL PBS. Aspirieren der PBS und 100 µL der ‑Aufklärung Lösung (-) hinzufügen SOD oder (-) AO, Spalten 1 bis 6 und 100 µL der ‑Aufklärung Lösung (+) SOD oder (+) AO Spalten 7 bis 12 in der 96-Well-Platte hinzufügen. Verwenden Sie Zeilen G und H wird als Hintergrund-Kontrollen (d. h.Änderung überwachen in Absorption in das Reagenz allein im Brunnen ohne Zellen).
  7. Messung der Extinktion bei 600 nm mit Spektralphotometer alle 10 min für 1 h quantifizieren die Änderung der Extinktion relativ zum Steuerelement bei 60 min Schritten 1.9 1.13 ähnlich.

3. Ermittlung der ob reduzierte Elektronen Akzeptoren Substrate für AO oder SOD sind

  1. 5,436 mL PBS oder HBS fügen Sie 240 µL 10 mM WST-1 für eine Endkonzentration von 400 µM und 24 µL 5 mM PMS für eine Endkonzentration von 20 µM hinzu.
    1. Fügen Sie für ‑Aufklärung 60 µL 10 mM ‑Aufklärung, für eine Endkonzentration von 100 µM zu 5,940 mL PBS oder HBS hinzu.
  2. Hinzufügen von 100 µL Lösung jeweils gut in eine flach-Boden-96-Well-Platte in der Abwesenheit von Zellen und Messen Sie die Absorption in einem Spektrophotometer bei 438 nm für WST-1 oder 600 nm für ‑Aufklärung.
  3. 1 µL 10 mM Ascorbat hinzu kommt die Hälfte der Brunnen für eine Endkonzentration von 100 μM. Überwachen Sie die Extinktion, bis es stabilisiert.
  4. Nach Stabilisierung 1 µL 200 U/mL AO für eine Endkonzentration von 2 U/mL in jede Vertiefung oder fügen Sie 1 µL 6 kU/mL SOD für eine Endkonzentration von 60 U/mL für jeden gut und überwachen die Extinktion für 1 h hinzu.

Ergebnisse

Statistiken wurden mit ANOVA mit wiederholten Messungen mit RStudio Statistiksoftware25durchgeführt. Stichprobengrößen entnehmen Sie bitte der Abbildung Legenden.

Um tPMET zu überwachen, wurden C2C12 Myotubes zusammen mit extrazellulären Elektronen Akzeptoren, WST-1 und ‑Aufklärung eingesetzt. AO wurde verwendet, um festzustellen, welcher Teil der WST-1 und ‑Aufklärung Reduktion wurde durch Asc...

Diskussion

Wir haben zwei Methoden zur Nutzung von extrazellulären Elektronen Akzeptoren, WST-1 und ‑Aufklärung, in spektralphotometrische Untersuchungen zur Überwachung von tPMET in C2C12 Myotubes vorgestellt. Mit dem Wachstum von Zelllinien im standard Kultur Verfahren und ein Spektralphotometer Platte Leser ist es möglich, tPMET mit dieser Elektronen-Akzeptoren in einem einfachen Mikrotestplatte Assay zu überwachen. WST-1 Reduzierung ist reproduzierbar aus Brunnen, Brunnen in einen Test, aber es gibt tägliche Variabilit?...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir möchten Neej Patel, Thomas Bell, Lyn Mattathil und Mark Mannino für ihre technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde von United States Public Health Service Award R15DK102122 vom National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Niere-Krankheiten (NIDDK), Jonathan Fisher unterstützt. Der Manuskript-Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der NIDDK oder die National Institutes of Health.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
C2C12 myoblastsAmerican Type Culture Collection CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucoseSigmaD6046
Fetal Plex animal serum complexGemini Bio-Products 100-602
penicillin-streptomycinSigma516106
horse serumGibco Technologies16050-130
Dulbecco's phosphate buffered salineSigmaD8537
trypsin-EDTASigmaT4049
15 cm culture dishesTPP93150
96 well culture platesTPP92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1)Accela ChemBio  IncSY016315
phenazine methosulfate SigmaP9625
L-ascorbic acidSigmaA5960
ascorbate oxidase SigmaA0157
superoxide dismutase SigmaS5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt ICN Biomedicals215011825
D-(+)-glucoseSigmaG7528
HEPES sodium saltSigmaH3784
sodium chlorideSigmaS7653
potassium chlorideFisher Scientific BP366
magnesium sulfate heptahydrateSigmaM5921
calcium chloride dihydrateSigmaC7902
potassium phosphateFisher Scientific BP363
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Powerwave X-I spectrophotometerBiotek Insturmentsdiscontinued 
Spectronic Genesys 5 SpectrophotometerThermo Scientific336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterileMidSci781602
Iron (II) chloride tetrahydrateSigma220299
Iron (II) sulfate heptahydrateSigma215422
hypoxanthineSigmaH9636
xanthine oxidaseSigmaX4500
ExcelMicrosoft
R StudioRstudiohttps://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4Biotek Insturmentsdiscontinued 

Referenzen

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