Induktion eines nephrotischen Syndroms bei Mäusen durch retrobulbären Injektion von Doxorubicin und Verhinderung von Volume Retention von verzögerter Freisetzung Aprotinin

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Induktion eines experimentellen nephrotischen Syndroms bei 129S1/SvImJ Mäusen durch schnelle retrobulbären Injektion von Doxorubicin. Wir behandeln auch Nephrotisches Mäuse mit verzögerter Freisetzung Pellets mit Aprotinin um Harn Serin-Protease-Aktivität hemmen und verhindern, dass Natrium-Retention.

Zusammenfassung

Nephrotisches Syndrom ist die extremste Manifestation des proteinuric Nierenerkrankung und zeichnet sich durch schwere Proteinurie, Hypoalbuminämie und Ödem durch Natrium-Retention und Hyperlipidämie. Zur Untersuchung der Pathophysiologie dieses Syndroms anhand Nagetier, die Modelle entwickelt wurden der Injektion von giftigen Substanzen wie Doxorubicin hemolytic Schaden. Bei Mäusen sind nur wenige Stämme anfällig für dieses Modell. In Wildtyp-129S1/SvImJ-Mäuse induziert die Gabe von Doxorubicin durch schnelle intravenöse Injektion, dem retrobulbären Sinus experimentelle Nephrotisches Syndrom, bietet die Symptome von Krankheiten einschließlich Natrium-Retention und Ödem. Nach dem Einsetzen der Proteinurie erhöht Mäuse Ausstellung Harn Serin-Protease-Aktivität, die zur Aktivierung des epithelialen Natrium-Kanal (ENaC) und Natrium-Retention führt. Pharmakologische Hemmung der Harn Serin Proteasen durch die Behandlung mit verzögerter Freisetzung Aprotinin hebt ENaC Aktivierung und verhindert, dass Natrium-Retention. Dieses Modell ist ideal, um die Pathophysiologie der Proteasuria, dhstudieren., die Ausscheidung von aktiven Serin-Proteasen, die ENaC Aktivierung durch Proteolyse von der γ-Untereinheit verursachen. Dies kann als der primäre Mechanismus der ENaC Aktivierung und Natrium-Retention in proteinuric Nierenerkrankung betrachtet werden.

Einleitung

Nephrotisches Syndrom ist gekennzeichnet durch schwere Proteinurie, Hypoalbuminämie, Ödeme und Hyperlipidämie und als die extremste Manifestation des proteinuric Nierenerkrankung angesehen werden kann. Bei Nagetieren kann experimentelle Nephrotisches Syndrom durch einmalige Injektion von Anthrazyklinen oder Puromycin führt zu hemolytic Schäden und ähnelt menschlichen minimale Änderung Krankheit und fokal segmentale Glomerulosklerose (FSGS)¹induziert werden. Nach seiner Erstbeschreibung im Jahr 1955 von Frenk Et Al. ², Puromycin Nukleosid Nephrose (PAN) bei Ratten ist ein Standardmodell zu untersuchen, die Pathophysiologie des Nephrotischen Syndroms in zahlreichen Studien^3,4,5,6geworden. Bei Mäusen kann das entsprechende Modell von Anthrazyklin Doxorubicin⁷induziert werden. Allerdings gibt es eine starke Belastung-Abhängigkeit, die durch mindestens zwei genetische Loci⁸genetisch determiniert ist. Darüber hinaus gibt es Unterschiede in der proteinuric Reaktion und Kurs des Nephrotischen Syndroms^9,10. Mit 129S1/SvImJ Mäusen und schnelle intravenöse Injektion von Doxorubicin über den retrobulbären Sinus, erreichen Proteinurie Antworten Werte, die ausreichen, um die typischen Merkmale eines nephrotischen Syndroms, insbesondere Volume Retention zeichnet sich durch induzieren Aszites und beinahe natriumfrei Urin⁷. Natrium-Retention im experimentellen Nephrotisches Syndrom hat vermutlich das Ergebnis der Aktivierung des epithelialen Natrium-Kanal (ENaC) in den distalen Röhrchen durch akzessorisch gefilterte Serin Proteasen wie Plasmin verursacht Proteolyse von der γ-Untereinheit^{4 ,11,12}. Vor kurzem wurde dieses Konzept Nephrotisches Mäusen bewiesen die aus proteolytischen ENaC-Aktivierung und Natrium-Retention durch Behandlung mit Serin Protease-Inhibitor Aprotinin geschützt waren, die ebenso wirksam wie die ENaC Blocker Amilorid¹³war. Um kontinuierliche Lieferung an der distalen Röhrchen zu gewährleisten, wurde Aprotinin über subkutan implantierten verzögerter Freisetzung Pellets verabreicht. Zukünftige Studien sind verpflichtet die Serin-Proteasen zu identifizieren, die verantwortlich für die proteolytische Aktivierung der ENaC in Nephrotisches Syndrom sind die vermutlich die menschliche Situation parallel. Zu diesem Zweck ist Doxorubicin-induzierte Nephrotisches Syndrom ein wertvolles Modell, das auf gentechnisch veränderte Mäuse erweitert oder in Wildtyp Mäusen verwendet werden kann. Seine Vorteile sind niedrige Kosten für das Medikament, geringere Komplexität des Managements und der guten Reproduzierbarkeit¹⁴.

In diesem Artikel zeigen wir die Induktion der experimentellen Nephrotisches Syndrom durch schnelle intravenöse Injektion von Doxorubicin, des retrobulbären Sinus und Implantation von retard-Pellets mit Aprotinin um Harn Serin Protease hemmen Aktivität mit einem chromogenen Assay gemessen.

Protokoll

Alle Methoden wurden nach der nationalen Institute der Gesundheit Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und das deutsche Recht für das Wohlergehen der Tiere durchgeführt, und sie wurden von den lokalen Behörden (Regierungspräsidium Tübingen) genehmigt.

1. Induktion von experimentellen Nephrotisches Syndrom von Doxorubicin Einspritzung des retrobulbären Sinus

1. Bereiten Sie eine 0,5 mL Spritze mit einer montierten 30G Kanüle durch die Markierung der Stop-Stellung des Kolbens.
2. Injektionsvolumen von Doxorubicin für männliche (7,25 µL/g Körpergewicht (bw) gleich 14,5 µg/g bw Doxorubicin) und weiblichen Mäusen (6.9 µL/g bw gleich 13,8 µg/g bw Doxorubicin) entsprechend dem Körpergewicht von morgens zu berechnen.
   Hinweis: Die angegebene Dosis eignet sich für die Induktion eines nephrotischen Syndroms. Geringfügige Änderungen in der Dosierung führen zu einem entscheidenden verschiedene Nephropathie reicht von milden chronischen Nierenerkrankung mit nur kleinen Änderungen in glomeruläre Filtrationsrate (12,6 µg/g bw Doxorubicin) zu akuten Nierenversagens Scheitern (15,4 µg/g bw Doxorubicin)^{7, 15}.
3. Den berechneten Betrag von Doxorubicin Lösung (2 µg/µL) in einem 37 ° C warmen Raum warm.
   Achtung: Doxorubicin ist schädlich, wenn geschluckt und können Krebs verursachen. Immer tragen Sie Handschuhe, wenn mit Doxorubicin arbeiten und vermeiden Sie jeden Kontakt mit der Haut.
4. Vorausfüllen von der Spritze mit Doxorubicin Lösung bis der Markierungspunkt und die Waage auf NULL gesetzt. Füllen Sie die Spritze mit der Einspritzmenge und überprüfen Sie die Lautstärke durch Wiegen der Spritze.
5. Betäuben Sie die Maus mit 5 Vol % Isofluran mit einem Vaporizer und Sauerstoff-Flow von 2 L/min tief.
   1. Verwenden Sie die Salbe nicht auf die Augen vor der Injektion. Der Bediener braucht einen klaren Blick auf die Augenhöhle für eine sichere und erfolgreiche retrobulbären Injektion durchführen.
   2. Bewertung des Anästhesie durch Pedal Reflex und ggf. Narkose Lieferung vor Beginn der Injektion.
6. Platzieren Sie den Mauszeiger rechts seitlich liegen, mit dem Rücken, mit Blick auf den Körper des Fahrers und den Kopf mit Blick auf die Hand des Bedieners Injektion.
   Hinweis: Das Verfahren ist für Rechtshänder, beschrieben, für Linkshänder, die Durchführung der Injektion mit der linken Hand es einfacher ist, die Position und Injektion umgekehrt rechts nach links.
7. Ragen Sie sorgfältig die Maus linken Augapfel aus der Augenhöhle durch sanften Druck auf die Haut, dorsalen und ventralen für das Auge.
8. Punktion des linken retrobulbären Sinus vom inneren Augenwinkel (mediale palpebrale Kommissur). Vermeiden Sie den Kontakt mit dem Mouse´s Augapfel.
9. Leicht kippen Sie die Spritze und injizieren Sie gesamten Datenträgers in einem Rutsch zu. Stellen Sie sicher, dass die Lautstärke ohne Widerstand und ohne irgendwelche Anzeichen von Extravasation wie Exopthalmus oder Leckage aus der Einstichstelle injiziert wird.
10. Da Doxorubicin eine hochgiftige Substanz ist, überprüfen Sie Wohlbefinden mindestens einmal täglich mit einem Notenblatt nach Morton und Griffiths Et al. ¹⁶ und Zahlen besondere Aufmerksamkeit auf die Injektionsstelle. Wenn keine Anzeichen einer Extravasation Exopthalmus mögen, beeinträchtigt Augenlid Schließung oder irgendwelche Anzeichen von Nekrose wie Schwellungen oder Haut Läsionen auftreten nach der Injektion oder in den folgenden Tagen sollte die Maus eingeschläfert werden.

2. Implantation von retard-Pellets mit Aprotinin

1. Pellets mit der gewünschten Dosis pro Tag und Freigabe Dauer im Voraus zu bestellen. Im Falle von Aprotinin wählen Sie eine Dosis von 1 mg pro Tag über 10 Tage freigegeben werden.
   Hinweis: In dieser Studie die Aprotinin Pellets enthalten eine Dosis von 10 mg.
   1. Speichern Sie die Pellets unter trockenen Bedingungen und vermeiden Sie jede Exposition gegenüber Feuchtigkeit.
2. Bereiten Sie erforderliche Elemente für die Chirurgie, einschließlich Haar Schere, Haut Vorbereitung Schere, Skalpell, chirurgische Pinzette, zwei Paare von Gewebe Pinzette, Nadelhalter und 15 cm Monofile Faden nicht resorbierbaren vor.
   1. Sterilisieren Sie die Instrumente mit einem Wärme-Sterilisator für 5 min. bei 240 ° C. Vor der Verwendung der Instrumente, für 5 min warten Sie, bis sie Zimmertemperatur erreicht.
      1. Vermeiden Sie den Kontakt von sterilisierten Instrument Tipps unsterilen Oberflächen.
      2. Hautverbrennungen zu vermeiden, indem Sie heiße Instrumente.
3. Betäuben Sie Maus mit Isofluran 5 Vol-% gefolgt von 1,5 vol% mit einem Vaporizer und Sauerstoff Flow von 2 L/min.
4. Platzieren Sie den Mauszeiger in Bauchlage auf einem wärmenden Gerät, bedeckt mit einer Schicht aus Gaze zur Vermeidung von thermischer Verletzungen zur Maus. Oberflächentemperatur beträgt ca. 37 ° C.
5. Schützen Sie die Augen mit Salbe.
6. Entfernen Sie die Haare in der Mitte zurück in eine Fläche von etwa 0,5 cm² mit einer Schere oder einem haarschneidegerät und Desinfizieren Sie die unbehaarte Haut mit einem Desinfektionsmittel für hautdesinfektion geeignet. Entfernen Sie so weniger Haare wie möglich, so es immer schwieriger für die Maus bleibt, um die Wunde zu erreichen und Thread später endet und Körpertemperatur zu halten.
7. Einzuschneiden Sie die unbehaarte Haut mit einem Skalpell in Cranio-Caudale Richtung in einer Länge von etwa 5 mm. Vorbereiten einer linken seitlichen Tasche von ca. 1 cm tief in das subkutane Bindegewebe mit einer stumpfen Zubereitung.
   1. Bewertung des Anästhesie durch Pedal Reflex und ggf. Narkose Lieferung vor Beginn der Operation.
8. Einsetzen Sie eine 10-Tage-Version Pellet in bereit linken seitlichen Beutels Pinzette steril Gewebe. Lassen Sie die Kugel an der Unterseite des Beutels in eine planare Position.
   1. Vermeiden Sie jeden Kontakt des Pellet-Flüssigkeit und Feuchtigkeit bis in die vorbereitete Tasche platziert.
9. Schließen Sie die Haut mit 2-3 Fäden. Lassen Sie nur sehr kurze Fadenenden machen es schwieriger für die Maus, um die Nähte durch nagen zu öffnen.
10. Legen Sie die Mäuse einzeln, postoperative Stress zu reduzieren und Öffnen der Nähte durch nagen zu verhindern. Halten Sie die Maustaste im Blick, bis es nach der Narkose ausreichend Bewusstsein wiedererlangt hat.
    Hinweis: Es gibt keine Notwendigkeit für die postoperative Schmerztherapie da dieser Eingriff ohne irgendwelche Anzeichen von Unbehagen oder Schmerzen gut vertragen wird. Alternativ empfehlen wir topische Analgetika, z. B. einen Tropfen Bupivacain auf den Einschnitt vor der Schließung, die bis zu 8 h Analgesie bieten würde.

3. Bewertung für Modell Induktion, Zeichen des Nephrotischen Syndroms und Wohlbefinden

1. Sammeln Sie Morgenurin (08:00) in einer Reaktion Tasse (1,5 mL) täglich ab dem Tag der Injektion durch das Massieren der Blase.
   1. Proteinurie mithilfe von Bradford Protein Assay zu messen und zu Kreatinin normalisieren.
      Hinweis: Für die Induktion eines nephrotischen Syndroms, Proteinurie sollte eine Schwelle von 120 mg/mg Kreatinin zwischen 7. und 10. Tag nach der Injektion von Doxorubicin erreichen.
2. Suchen Sie nach der Entwicklung von Aszites. Suchen Sie nach Erhöhung der Bauch Umfang oder überhängende Flanken.
3. Wiegen Sie die Maus, die Lebensmittel-Pellets und die Trinkflasche am Morgen (08:00) jeden Tag.
4. Überprüfen Sie Wohlbefinden mindestens einmal täglich mit einem Notenblatt nach Morton und Griffiths Et Al. ¹⁶

4. Messung der Harn Serin Protease mit einem chromogenen Assay

1. Bereiten Sie Substrat funktionierende Lösung durch Zugabe von 15 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), eine Flasche von 25 mg lyophilisiert chromogenen Substrat S-2251, mit einer Konzentration von 2 mM. Auflösen von Aprotinin in PBS, eine Aprotinin-Lösung mit einer Konzentration von 2 mg/mL zu erhalten.
   1. Speichern von vorbereiteten Lösungen bei-20 ° C. Dies verlangsamt deutlich den Auto-Abbau von S-2251. Verwenden Sie alte Lösungen nicht mit einem starken Gelbton.
2. Verwendung frisch zubereitet oder Substrat Arbeitslösung aufgetaut und in einer Wärmekammer 37 ° C warm.
3. Urinproben bei Raumtemperatur Auftauen.
   1. Verhindern, dass Protease-Abbau durch wiederholtes Auftauen und Einfrieren zu vermeiden. Speichern von Urinproben bei-20 ° C.
4. Verwenden Sie eine 96 Microwell-Platte für photometrische Messung geeignet. Fügen Sie 3 µL des unverdünnten Urin in jedem der zwei Brunnen hinzu und 50 µL Substratlösung arbeiten mit 3 µL PBS oder Aprotinin-Lösung in die Vertiefungen. Die Platte mit einer Versiegelung Platte abdecken.
5. Inkubieren Sie die überdachte Microwell-Platte für 60 min in einer Wärmekammer 37 ° C.
6. Messung die optische Dichte von jedem Bohrloch bei 450 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.
7. Nehmen Sie den Unterschied zwischen der OD ohne Aprotinin und mit Aprotinin als Harn Aprotinin-Sensitive Serin-Protease-Aktivität.
   Hinweis: Messung einer gekoppelten Probe mit und ohne Aprotinin erhöht Spezifität des Assays, da das Substrat auch durch andere Proteasen gespalten werden könnte, die keine pathophysiologische Rolle spielen.

Ergebnisse

Nach der Induktion der Isoflurane Narkose wurde Doxorubicin rasch über den linken retrobulbären Sinus injiziert. Das gesamte Volumen von 7,25 µL/g bw injiziert wurde, ohne jeden Widerstand und Extravasation beweisen intravenöse Lage der Kanüle korrigieren. Die Maus schnell von Narkose erholt und hatte keine Wertminderung an jenem Tag und danach. Insbesondere gab es keine Anzeichen einer Beschädigung am linken Auge. Nach Doxorubicin Einspritzung, Nahrung und Flüssigkeit Einnahme san...

Diskussion

Hier zeigen wir, dass Doxorubicin Injektion mittels retrobulbären Sinus Injektion experimentelle Nephrotisches Syndrom bei 129S1/SvImJ Mäusen mit Proteinurie, Natrium-Retention, Hypoalbumenia und Hyperlipidämie induziert. Allerdings gibt es zwei kritische Fragen, die bei der Verwendung dieses Musters berücksichtigt werden müssen. Erstens die Modell-Induktion ist streng dosisabhängig und Abweichungen von Doxorubicin Dosis so klein wie 0,3 µg/g beeinflussen die Reaktion der Mäuse¹⁵. Wenn Sie...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
supplies
BD Micro FINE + U-40 (0.30 mm x 8 mm)	BD Deutschland GmbH, Heidelberg, Germany	PZN: 07468060	syring
ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm)	Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany)	EH7823H	suture
Name	Company	Catalog Number	Comments
reagents
aprotinin (6000 KIU/mg)	LOXO, Heidelberg, Germany	CAS 9087-70-1
Bepanthen, Augen- und Nasensalbe	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	PZN: 1578681	ointment
Chromogenix S-2251	HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Germany	82 0332 39	chromogenic substrate
doxorubicin (2.0 µg/µL)	Cell Pharm, Bad Vilbel, Germany	CAS 25316-40-9	doxorubicin
isofluran CP (1 mL/mL)	CP-Pharma, Burgdorf, Germany	CAS 26675-46-7	isofluran
pellets with matrix-driven sustained release (custom-made)	Innovative Research of America, Sarasota, FL	X-999	pellet
Name	Company	Catalog Number	Comments
equipment
ELx808 Absorbance Mikroplate Reader	BioTek, Bad Friedrichshall, Germany	ELx808	microplate reader
MICROSTERIL - 436	B.M.S., Trescore Balneario, Italy	GAL/436	sterilizer
Hybridization oven/shaker	GE Healthcare UK Limited, Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UK	RPN 2511	heat chamber
Thermo MAT Pro 10 W, 15x25 cm, Lucky Reptile	Import Export Peter Hoch GmbH, Waldkirch, Germany	61201	mouse warming device