Licht-Blatt-Mikroskopie zur dreidimensionalen Visualisierung der menschlichen Immunzellen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um Immunzellen, eingebettet in eine dreidimensionale (3D) Kollagen-Matrix mit Licht-Blatt Mikroskopie zu visualisieren. Dieses Protokoll arbeitet auch wie Zellwanderung in 3D zu verfolgen. Dieses Protokoll kann für andere Arten von Aussetzung Zellen in der 3D Matrix eingesetzt werden.

Zusammenfassung

In Vivo, Aktivierung, Verbreitung und Funktion von Immunzellen, die alle auftreten in einer dreidimensionalen (3D) Umgebung, z. B. in Lymphknoten oder Gewebe. Up to Date verlassen sich die meisten in-vitro- Systeme auf zweidimensionale (2D) Oberflächen, wie z. B. Zellkultur Platten oder Deckgläsern. Um optimal mimischen physiologischen Bedingungen in Vitroverwenden wir eine einfache 3D Kollagen-Matrix. Kollagen gehört zu den wichtigsten Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) und wurde häufig verwendet, um 3D Matrizen darstellen. Für 3D-Bildgebung, wird die neu entwickelte Licht-Blatt-Mikroskopie-Technik (auch bezeichnet als einziges Flugzeug Beleuchtung Mikroskopie) mit hoher Geschwindigkeit, große Eindringtiefe, geringe Bleichen und Photozytotoxizität gekennzeichnet. Darüber hinaus ist Licht-Blatt Mikroskopie besonders vorteilhaft für Langzeitmessungen. Hier beschreiben wir einer optimierten Protokoll zum Einrichten und Verarbeiten von menschlichen Immunzellen, z.B. primären menschlichen zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) und natürlichen Killer (NK) Zellen in der 3D Kollagenmatrix für die Verwendung mit der Licht-Blatt-Mikroskopie für live Cell Imaging und feste Proben. Das Verfahren zur Bildaufnahme und Analyse der Zellwanderung werden vorgestellt. Ein besonderer Schwerpunkt ist gegeben, markieren Sie wichtige Schritte und Faktoren für die Probenvorbereitung und Analyse der Daten. Dieses Protokoll kann für andere Arten von Aussetzung Zellen in einer 3D Kollagenmatrix eingesetzt werden und beschränkt sich nicht auf Immunzellen.

Einleitung

Die meisten wissen über Migration Zellen stammt aus 2D Experimente^1,2,3, die sind in der Regel in einem Glas oder Kunststoff-Oberfläche der Kultur/Bildgebung durchgeführt Gericht. Eine physiologische Szenario erfordert jedoch in den meisten Fällen eine 3D Mikroumgebung, in denen die extrazelluläre Matrix (ECM) eine entscheidende Rolle spielt. ECM bietet die 3D-Struktur ätherischen um richtige Zellmorphologie beizubehalten nicht nur, sondern bietet auch überleben Signale oder direktionale Hinweise für eine optimale Funktion von vielen Zellen^4,5 . Daher muss eine 3D-Umgebung Zellfunktionen und Verhalten in einem Umfeld besser reflektieren die physiologischen Zusammenhang besser zu identifizieren.

Im menschlichen Körper üben die meisten Zellen vor allem Immunzellen, ihre Funktionen unter einem 3D Szenario. Zum Beispiel aktivierte T-Zellen patrouillieren Gewebe auf der Suche nach Zielzellen, naive T-Zellen durchwandern Lymphknoten auf der Suche nach ihrem cognate Antigen-präsentierenden Zellen während, die Migrationsmodus und Maschinen an die entsprechenden extrazelluläre angepasst sind Umwelt,^3,6,7. Das 3D Kollagen-Gel wurde weithin als ein etabliertes und gut charakterisierten 3D Zelle Kultur System^8,9,10eingesetzt worden. Unsere bisherige Arbeit zeigt, dass die primären menschliche Lymphozyten sind sehr mobil und mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit von rund 4,8 µm/min in einem 0,25 % Kollagen-basierten Matrix¹¹zu migrieren. Neuordnung des Zytoskeletts spielt eine Schlüsselrolle in der Zelle Migration¹². Sammeln Beweise zeigt, dass Lymphozyten gelten nicht nur einen einzigen Modus der Migration noch können zwischen bestimmten Migrationsverhalten in Abhängigkeit von der Lage, Mikroumgebung, Zytokine, chemotaktische Gradienten und extrazelluläre welche Melodie Signale die Wanderungsverhalten in unterschiedlicher Weise ³.

Immunzellen Funktionen und Verhalten, z. B. Migration, Vorwölbung Bildung oder vesikulärer Transport zuverlässig zu analysieren ist es von großem Vorteil in der Lage sein, Bilder in relativ großen Mengen 3D in einer schnellen und zuverlässigen Art und Weise zu erwerben. Für 3D-Bildgebung bietet die neu entwickelte Licht-Blatt-Mikroskopie-Technologie (auch bezeichnet als einziges Flugzeug Beleuchtung Mikroskopie) eine zufrieden stellende Lösung^13,14. Während imaging Acquisition, wird eine statische Licht Dünnblech generiert, um die Probe beleuchten. Auf diese Weise auf die Fokusebene kann großflächig gleichzeitig beleuchtet werden, ohne die Zellen außerhalb der Ebene. Diese Funktion ermöglicht eine hohe Geschwindigkeit mit einem drastisch reduzierten Bleichen und Photozytotoxizität. In diesem Artikel beschreiben wir wie primäre menschliche Immunzellen mit Licht-Blatt Mikroskopie zu visualisieren und analysieren Sie die Migration in einem Szenario mit 3D.

Protokoll

Für diese Studie mit Menschenmaterial (Leukozyten Reduktion System Kammern von menschlichen Blutspendern) durchgeführten Forschungsarbeiten ist berechtigt, von der lokalen Ethikkommission (Erklärung von 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) und folgt den entsprechenden Richtlinien.

1. Vorbereitung des neutralisierten Kollagen Lösung (500 µL)

1. Übertragen Sie 400 µL der Stammlösung gekühlte Kollagen (10,4 mg/mL) auf eine sterile 1,5 mL-Tube unter der Haube Zelle Kultur. Fügen Sie langsam 50 µL 10 X PBS (pH-Wert 7,0-7,3) zu 400 µL der Stammlösung gekühlte Kollagen gekühlt. Mischen Sie die Lösung durch sanft das Rohr mit Ziegeln zu decken.
   Hinweis: Alle Schritte in Teil 1 sollte unter einer Zelle Kultur Kapuze erfolgen.
2. Fügen Sie 8 µL 0.1 M NaOH in 500 µL der Kollagen-Lösung von 1,1. um den pH-Wert auf 7,2-7,6 einstellen. Verwenden Sie pH-Teststreifen (pH-Bereich: 6-10) an den pH-Wert des Gemisches zu bestimmen.
   Hinweis: Volumes variieren für verschiedene Chargen von Kollagen. NaOH Lösung muss langsam gemischt werden, um Luftblasen zu vermeiden. Die Mischung sollte auf dem Eis zu Kollagen Gelierung gehalten werden.
3. Fügen Sie 2 µL steriler DdH₂O, das Endvolumen zu 500 µL. gut mischen und dieses Kollagen-Lösung (8,32 mg/mL) auf Eis oder bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung zu speichern.
   Hinweis: Unter dieser Bedingung neutralisierte Kollagen kann verwendet werden für 24 h Aliquote werden nicht empfohlen, um Luftblasen zu vermeiden.

2. Probenvorbereitung für Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie mit Kapillaren

1. Eindringmittel beschriften der lebenden Zellen mit der gewünschten primären Fluoreszenzfarbstoffen¹⁵ oder fluoreszierende Proteine¹¹ wie zuvor beschrieben.
2. Übertragen Sie 1 × 10⁶ Zellen in eine sterile 1,5 mL-Tube unter einer Haube Zelle Kultur. Zentrifugieren der Röhre bei 200 X g für 8 min. verwerfen des Überstands und das Pellet in 200 µL Kulturmedium aufzuwirbeln.
   Hinweis: Die Zelldichte von 5 × 10⁶ Zellen/mL wird zur Visualisierung der menschlichen Immunzelle Migration, vor allem für zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) und natürliche Killerzellen (NK) empfohlen.
3. Fügen Sie 85.9 µL neutralisierte Kollagen-Lösung von 1,3. in der Zellsuspension von 2,2. und richtig mischen, um eine Kollagen-Konzentration von 2,5 mg/mL zu erreichen. Lassen Sie die Zelle/Kollagen-Mischung auf dem Eis in der Haube.
   Hinweis: Angenommen, die gewünschte Konzentration von Kollagen N mg/mL, neutralisiert das Volumen der Kollagen-Lösung (für 200 µL Zellsuspension) = 200 × N /(8.32-N)
4. Legen Sie als nächstes den passenden Kolben in der Kapillare (Innendurchmesser ~ 1 mm) bis der Kolben 1 mm aus der Kapillare ist. Befeuchten Sie den Kolben durch Eintauchen in Kulturmedium (Abbildung 1A).
   Hinweis: Dieser Schritt könnte helfen, um Luftblasen zu verhindern, wenn die Kapillare in der Zelle/Kollagen-Mischung getaucht wird. Die Kapillare und den Kolben müssen nicht steril sein.
5. Tauchen Sie die Kapillare in der Zelle/Kollagen-Mix von 2,3. Ziehen Sie langsam den Kolben wieder für 10-20 mm (Abbildung 1 b). Wischen Sie die äußere Wand der Kapillare mit einem Papiertuch angefeuchtet mit 70 % Ethanol Spray, die verbleibende Kollagen-Lösung zu entfernen.
6. Montieren Sie die Kapillare mit Knetmasse an der Innenwand einer 5 mL-Röhre und schieben Sie die Zelle/Kollagen-Mischung an den Rand der Kapillare (Abbildung 1).
7. Halten Sie die Kapillare bei 37 ° C mit 5 % CO₂ für 1 h für Kollagen-Polymerisation.
8. Eine 5 mL-Tube das Kulturmedium (ca. 1-2 mL) hinzufügen. Drücken Sie vorsichtig die polymerisierten Kollagen-Rute, in das Medium zu etwa 3/4 des Kollagens hängen in das Medium (Abbildung 1).
9. Halten Sie die Kapillare, wie diese, bei 37 ° C mit 5 % CO₂ für ein weiteres 30 min, die Kollagen-Rute mit dem Medium equilibrate.
   Hinweis: Danach kann der Kollagen-Stab in die Kapillare und kultivierten weitere vor der weiteren Verwendung zurückgezogen werden.

3. die Bildaufnahme mit Licht-Blatt Mikroskopie

1. Montage der Probenkammer nach Anweisungen des Herstellers.
2. Aktivieren Sie die Inkubation und das Mikroskop, die Probenkammer auf 37 ° C (für live Cell imaging nur) zu erhitzen.
3. Legen Sie die Kapillare in der Probenkammer und suchen Sie die Probe um den Bereich von Interesse für die Bildaufnahme zu finden.
4. Aktivieren Sie die entsprechenden Laser. Legen Sie die folgenden Einstellungen: laser-Power, Belichtungszeit, Schrittweite von Z-Stapel, Start- und Endposition des Z-Stack und das Zeitintervall für das live Cell Imaging.
   Hinweis: zum Beispiel, das Beispiel in Abbildung 2 abgebildet war alle 40 s 6 h bei 37 ° C mit einer Schrittweite von 1 µm (Gesamtstärke: 538 µm). Die Laserleistung war 1 % mit einer Belichtungszeit von 30 ms die Pixelgröße bei X-y-Richtung 0,23 µm.
5. Starten Sie die Bildaufnahme.

4. automatische Tracking-Analyse

1. Öffnen Sie die Datei-Konverter, klicken Sie auf Dateien hinzufügen wählen Sie die bildgebenden Datei(en) in der Software-Datei-Format (*.ims) umgewandelt werden. Klicken Sie auf Durchsuchen und wählen Sie einen Ordner für die konvertierten Dateien speichern. Klicken Sie auf Start alle.
2. Öffnen Sie die Analysesoftware. Klicken Sie zu übertreffen. Gehen Sie auf Datei und klicken Sie auf Öffnen, dann wählen Sie die Image Datei analysiert werden.
   Hinweis: Wenn die Datei groß ist dieser Schritt dauert. Dateien, die größer als 1 Terabyte (TB) sind nicht zu empfehlen für ein einziges Experiment als den Prozess so große Dateien sind höchst Rechenkapazität anspruchsvoll.
3. Klicken Sie auf hinzufügen neue Spots. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Prozess ganze Bild schließlich. Klicken Sie auf weiter.
4. Geben Sie die Koordinaten für x und y (in Pixel), die Region von Interesse zu definieren. Geben Sie die Anzahl der Frames (Zeit und Z-Position) zu analysieren. Klicken Sie auf weiter.
5. Wählen Sie den Ziel-Kanal, der zu verfolgenden Objekte enthält, in der Dropdown-Liste der Quellkanal. Geben Sie die geschätzte Xy Durchmesser (in µm). Klicken Sie auf weiter.
   Hinweis: Geschätzte Xy Durchmesser beträgt der durchschnittliche Durchmesser in der X-y-Dimension von Objekten verfolgt werden.
6. Klicken Sie auf Qualität. Legen Sie einen Schwellenwert, in dem meisten Zellen (Objekte) eingeschlossen werden sollen. Klicken Sie auf weiter.
7. Wählen Sie den gewünschten Algorithmus (Autoregressive Bewegung wird empfohlen). Geben Sie die maximale Entfernung (20 µm wird empfohlen) und die maximale Lückengröße (3 oder 2 wird empfohlen). Klicken Sie auf Prozess ganze Bild schließlich.
   Hinweis: Max. Entfernung und Max. Größe der Lücke sind zwei Schwellen, Schienen zu brechen. Genauer gesagt, in zwei kontinuierliche Rahmen überschreitet die Distanz zwischen demselben Objekt max. Entfernung, dieses Objekt in dem späteren Bild als neues Objekt gelten. Manchmal während der Akquisition kann dasselbe Objekt für ein paar Frames verschwinden und wieder auftauchen. In diesem Fall nur dann, wenn dieses Objekt innerhalb der Max Lückengröße erscheint, es als das gleiche Objekt gelten.
8. Klicken Sie auf Filter-Typ und wählen Sie die Option zum Ausschließen von unerwünschter Spuren.
   Hinweis: Dieser Schritt ist optional.
9. Klicken Sie auf weiter und klicken Sie dann auf Beenden.
   Hinweis: Dieser Schritt dauert Stunden bis Tage, je nach Rechenleistung.
10. Klicken Sie auf Bearbeiten Tracks und wählen Sie Richtige Driftzu. Wählen Sie den entsprechenden Algorithmus (Translationale Drift wird empfohlen). Wählen Sie das gewünschte Ergebnis-Dataset-Größe (Neue Größe gleich aktuelle Größe wird empfohlen). Klicken Sie auf "OK".
    Hinweis: Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn das Kollagen während der Bildaufnahme trieb.
11. Klick- Statistik und wählen Sie Konfigurieren der sichtbaren Statistiken Listenwerte. Überprüfen Sie die Optionen von Interesse sein (z. B. Koordinaten, Geschwindigkeit usw.) exportiert. Klicken Sie auf "OK".
12. Klicken Sie auf Exportieren alle Statistiken auf Datei , und geben Sie den Dateinamen.

5. Fixierung und Immunfluoreszenz Färbung der Zellen im Kollagen Matrizen

1. Übertragen Sie 1.000 µL 4 % Paraformaldehyd (PFA, mit PBS-Puffer) in eine 5 mL-Tube unter einer chemischen Kapuze.
   Hinweis: PFA sollte auf Raumtemperatur ausgeglichen werden.
2. Tauchen Sie die Kapillare mit polymerisierten Kollagen von 2,9. in PFA-Lösung (für ~ 5 mm) und montieren Sie die Kapillare an der Innenwand der 5 mL-Tube mit Knetmasse (siehe Abbildung 1).
3. Drücken Sie den Kolben vorsichtig, bis die Hälfte der Kollagen-Stange hängt in der PFA-Lösung (Abbildung 1). Halten Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 20 min.
4. Ziehen Sie den Kolben um den Kollagen-Stab innerhalb der Kapillare zu erhalten. Nehmen Sie die Kapillare und verwerfen Sie PFA zu.
5. Montieren Sie die Kapillare in ein frisches Gefäß und fügen Sie 1 mL PBS. Stellen Sie sicher, dass die Kapillare in die PBS eingetaucht ist.
6. Drücken Sie den Kolben vorsichtig, bis die Hälfte der Kollagen-Stange hängt in der Lösung. Montieren Sie die Kapillare an der Innenwand mit Knetmasse.
7. Halten Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
8. 5.4 zu wiederholen. -5,7 für weitere 2 mal.
9. Ziehen Sie den Kolben um den Kollagen-Stab innerhalb der Kapillare zu erhalten. PBS zu verwerfen. 1-2 mL blockiert/Permeabilisierung Puffer (PBS + 1 % BSA + 0,1 % nicht-ionische Tenside) in das Rohr zu übertragen und 5.6 zu wiederholen.
   Hinweis: Die BSA (1 %) kann durch 5 % Serum des Tieres ersetzt werden, wie die sekundäre Ab in angesprochen wurde.
10. Halten Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 30-60 Minuten.
11. Ziehen Sie den Kolben um den Kollagen-Stab innerhalb der Kapillare zu erhalten. Entsorgen Sie die Permeabilisierung Puffer. 200-500 µL Primärantikörper in blockieren/Permeabilisierung Puffer übertragen und scheidet den Stab in die Lösung.
12. Halten Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 1 h.
13. Waschen Sie die Kollagen-Rute 3 Mal mit PBST (PBS + 0,1 % nicht-ionische Tenside) wie in 5.4 beschrieben. -5.8.
14. Inkubieren Sie die Rute in sekundären Antikörper blockieren/Permeabilisierung Puffer für 1 h bei Raumtemperatur. Halten Sie es vor Licht.
15. Waschen Sie die Kollagen-Rute 3 Mal mit PBS, wie in 5.4 beschrieben. -5.8.
16. Ziehen Sie den Kolben um den Kollagen-Stab innerhalb der Kapillare zu erhalten. Bewahren Sie die Proben mit PBS-Puffer bis Bildgebung.
17. Scannen Sie die Proben, wie unter 3 beschrieben.

Ergebnisse

Protrusion Formation während der T-Zell-Migration ist ein sehr dynamischer Prozess, der Aktin angewiesen ist. Um Vorsprung Bildung der primären menschlichen CTL zu visualisieren, transfizierten wir vorübergehend ein mEGFP verschmolzen Protein Aktin-Zytoskeletts in CTL wie beschrieben vor¹¹beschriften. Einen Tag nach Transfektion, wurden die Zellen in der Kollagenmatrix eingebettet. Bild-Stacks erworben wurden alle 40 s mit einer Schrittweite von 1 µm bei 37 ° ...

Diskussion

Die meisten in-vitro- Tests sind auf einer 2D Oberfläche, zum Beispiel in Petrischalen Zellkultur Platten oder auf Deckgläsern, durchgeführt, während in Vivo Zellen, vor allem Immunzellen, vor allem eine 3D Mikroumgebung erleben. Anzeichen dafür zeigt, dass Migrationsmuster von Immunzellen zwischen 2D und 3D Szenarien¹⁷unterscheiden. Die expressionsprofile von Tumorzellen unterscheiden sich darüber hinaus auch in 2D und 3D kultiviert Gewebe^18,

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibricol, bovine collagen solution	Advanced Biomatrix	#5133-20ML	Collagen matrix
0.5 M NaOH Solution	Merck	1091381000	for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose	Affymetrix	32821-10GM	Sample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit	Thermo Fisher	11348D	Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation	Thermo Fisher	11132D	Activation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2	Thermo Fisher	PHC0023	Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kit	Lonza	V4XP-30XX	Transfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgG	Abcam	ab124904	IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Thermo Fisher	A22284	IF
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Thermo Fisher	C10045	Fluorescent cell label
Tween 20	Sigma	P1379-250mL	IF
Triton X-100	Eurobio	018774	IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline	Thermo Fisher	14190250	IF
Bovine serum albumin	Sigma	A9418-100G	IF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit	Thermo Fisher	A-11011	IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy)	Zeiss	N.A.
Cell culture hood	Thermo Fisher	HeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i	Thermo Fisher	N.A.
Centrifuge 5418 and 5452	Eppendorf	N.A.
Pippettes	Eppendorf	3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tips	VWR	89079-444, 89079-436, 89079-452
15 mL tubes	Sarstedt	62.554.002
Capillaries 50 µL	VWR (Brand)	613-3373	Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillaries	VWR (Brand)	BRND701934	"Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stips	Merck	1095430001	to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringes	BD	Z230723 ALDRICH	Alternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7)	Play-Doh	N.A.
Imaris file converter	Bitplane	available at http://www.bitplane.com	Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)	Bitplane	available at http://www.bitplane.com	Analysis of 3D and 4D imaging data