Ein Tröpfchen mikrofluidischen Ansatz und Mikrosphären-PCR Verstärkung für Single-Stranded DNA-Amplifikate

Zusammenfassung

Diese Arbeit stellt eine Methode für die Herstellung von mikrofluidischen Droplet-basierten Plattformen und die Anwendung von Polyacrylamid Mikrosphären für Mikrosphären-PCR Verstärkung. Die Mikrosphären-PCR-Methode ermöglicht es, einzelsträngigen DNA-Amplifikate ohne Trennung doppelsträngige DNA zu erhalten.

Zusammenfassung

Tröpfchen-basierte Mikrofluidik ermöglichen die zuverlässige Herstellung von homogenen Mikrosphären in den mikrofluidischen Kanal, Bereitstellung von kontrollierten Größe und Morphologie der erhaltenen Mikrosphären. Eine Mikrosphären copolymerisiert mit einer Acrydite-DNA-Sonde wurde erfolgreich hergestellt. Verschiedene Methoden wie asymmetrische PCR Exonuclease Verdauung und Isolation auf magnetische Beads Streptavidin beschichteten einsetzbar, einzelsträngiger DNA (SsDNA) zu synthetisieren. Jedoch verwenden nicht diese Methoden effizient große Mengen an hochgereinigtes SsDNA. Hier beschreiben wir eine Mikrosphären-PCR-Protokoll Details wie SsDNA effizient verstärkt und einfach durch Pipettieren von einer PCR-Reaktion-Röhre von DsDNA getrennt werden kann. Die Verstärkung der SsDNA kann als potenzielle Reagenzien für die DNA-Microarray und DNA-SELEX (systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) Prozesse angewendet werden.

Einleitung

Einzelsträngiger DNA (SsDNA) wurde ausgiebig als molekulare Erkennung Element (MRE) aufgrund seiner intrinsischen Eigenschaften für DNA-DNA Hybridisierung^1,2berücksichtigt. Die Entwicklung von SsDNA synthetischer Systeme führt zu biologischen Anwendungen wie DNA-Microarrays³, Oligotherapeutics, Diagnostik und integrierte molekulare Erkennung basiert auf komplementäre Interaktionen^4,5.

Bisher wurden erfolgreich Mikrometer-Skala Polymerpartikel mit mikrofluidischen Geräten demonstriert. Verschiedene Techniken der mikrofluidischen nachweislich um zu mächtig für die Herstellung von sehr homogene Mikrosphären auf kontinuierlichen Flow in der Microchannel Umwelt^6,7.

In der Studie von Lee Et al. ⁸, eine Tröpfchen-basierte Mikrofluidik Plattform für Mikrofluidik-Synthese von copolymerizable Oligo-Mikrosphären und SsDNA Verstärkung wurde berichtet. Die mikrofluidischen Plattform besteht aus zwei PDMS (Polydimethylsiloxan) Schichten: einem oberen Teil mit einem Mikrofluidik-Channel-Netzwerk zur Erzeugung von Mikrosphären und einem unteren flachen Teil. Diese bestehen aus drei Arten von PDMS fluidische Kanäle: 1) einen Fluss mit Schwerpunkt Kanal für Tröpfchen Generation, (2) eine serpentine Kanal für das Mischen von zwei Lösungen und (3) eine sequenzielle Polymerisation Kanal für Mikrosphären Erstarrung. Sobald zwei nicht mischbare fließt in einen einzigen PDMS fluidische Kanal eingeführt werden, können die Ströme durch die schmale Öffnung Struktur erzwungen werden. Die Strömung Verhaltensweisen wie Kanalgeometrie, Durchfluss und Viskosität beeinflussen die Größe und Morphologie der Mikrosphären. Daher kann Microscale Monospheres^9,10der Hauptstrom flüssigen unterteilt werden.

Hier ist eine detaillierte Mikrosphären-PCR-Protokoll für die Verstärkung der SsDNA zur Verfügung gestellt. Zunächst wird ein Droplet-basierte Mikrofluidik-Gerät-Design-Prozess beschrieben. Dann wird die Art und Weise, in welcher, die Polyacrylamid Mikrosphären mit zufälligen DNA Schablone komplementär funktionalisiert werden können, erklärt. Schließlich ist ein Mikrosphären-PCR-Protokoll zur Verstärkung SsDNA gezeigt.

Protokoll

(1) Herstellung einer PDMS mikrofluidischen Plattform

1. Bereiten Sie 20 mL flüssige PDMS Prepolymer durch Mischen Basispolymer und Katalysator in einem Volumen-Verhältnis von 10:1. Gießen Sie 10 mL Flüssigkeit PDMS auf eine vorbereitete SU-8-Form auf einem Silizium-Wafer für den oberen Teil des Netzes mikrofluidischen. Gießen Sie für den unteren flachen Teil die gleiche Menge an flüssigem PDMS auf dem Siliziumwafer ohne Schimmel Struktur.
   Hinweis: Das mikrofluidischen Netzwerk ist in einem CAD-Programm entwickelt und dann in einer Fotomaske umgewandelt, um ein Meister mit dem typischen Photolithographie-Prozess (siehe Ergänzende Zahlen) zu fabrizieren. Dieser Meister besteht aus den negativen Photoresist SU-8 Schimmel auf der Silizium-Wafer-¹¹.
2. Legen Sie zwei Silizium-Wafern, beschichtet mit flüssigen PDMS-Prepolymer auf der heißen Platte und Heilung bei 75 ° C für 30 Minuten.
   1. Manuell die gehärtete PDMS-Schicht aus der SU-8 Form abziehen. Richten Sie einen Durchmesser von 1,5 mm Runde Loch Stanzwerkzeug um den Ölhafen im replizierten mikrofluidischen Netzwerk für die Anbindung von Mikron-Skala Strömungskanäle mit der Makro-Flüssigkeitsproben. Die Durchgangsbohrung manuell ausstanzen.
   2. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal für die Bildung der beiden Lösungen und die Auslassöffnung Stanzen.
3. Durchführen Sie hydrophile Oberflächenbehandlung in der oberen und unteren PDMS Schichten mit einer handgeführten Corona Treater¹² für mehrere Sekunden pro Probe.
   1. Stapeln Sie zwei plasmabehandelte PDMS Schichten und Hitze bei 90 ° C für 30 Minuten mit einer Heizplatte für PDMS-PDMS-Bonding-Verfahren. Das Druckwasser mit der Spritzenpumpe in drei Einlass-Ports für die strukturellen Klebens und Dichtigkeitsprüfung des gefertigten Gerätes zu liefern.

2. Herstellung von Polyacrylamid Oligo-Mikrosphären

1. Bereiten Sie in Tabelle 1beschriebenen Wulst-Mischung zu.
2. Wirbel und kurz Zentrifuge standard SsDNA Acrydite mit der Bezeichnung Sonde (Ap, 100 μM) und Acrylamide:bis (19:1) Stammlösung.
3. Bereiten Sie Lösung ich durch das Mischen von 25 μL von 40 % Acrylamid BIZ Lösung, 10 μL SsDNA (Acrydite-Sonde), 10 μL der 5 X TBE-Puffer (1,1 M Tris, Borat 900 mM, 25 mM EDTA) und 5 μL des Wassers. Bereiten Sie Lösung II mit 50 μL der 20 % Ammonium bleichen.
4. Bereiten Sie zwei Spritzen individuell gefüllt mit Lösung I und Lösung II und klebe sie auf die Pumpe Lösung fließt in mikrofluidischen Plattform einzuführen. Bereiten Sie Mineralöl vermischt mit 0,4 % TEMED für Oberfläche erstarren die Mikrosphären.
   Hinweis: TEMED ist bekannt als freie Radikale Stabilisator. Freie Radikale können die Polymerbildung mit Ammonium Bleichen (APS) beschleunigen um Acrylamid Polymerisation zu katalysieren.
5. Füllen Sie eine Glasflasche mit 4 mL des Mineralöls zu einen kontinuierlichen Strom zu erzeugen.
6. Legen Sie zwei Röhren mit zwei Ports in die Kappe der Glasflasche als mikrofluidischen Reservoir: der pneumatischen Anschluss für die Anwendung der Druckluft in die Glasflasche von Kompressor und dem flüssigen Hafen für die Versorgung das Drucköl, micro Channel-Netzwerk aus der Glasflasche. Schläuche zwischen der Glasflasche und Ölhafen in mikrofluidischen Gerät anschließen.
   1. Verbinden Sie die Rohre mit den zwei Lösung Anschlüssen in mikrofluidischen Gerät um die beiden Lösungen aus der Spritzenpumpen liefern. Legen Sie Röhren in die Auslassöffnung um die generierten Mikrosphären in das Becherglas zu übertragen.
7. Legen Sie die Durchflussrate der Spritzenpumpe auf 0,4 - 0,7 mL/h. Adjust Druckluft Druck des Kompressors mit einem Regler (82-116 kPa). Legen Sie die Drehzahl (500 u/min) der Magnetrührer Bar in das Becherglas auf einer heißen Platte. Betrieben Sie die Spritzenpumpe und liefern Sie die komprimierte Luft in die Glasflasche mit dem ON/OFF Control ein elektromagnetisches Ventil¹³von einem externen Kompressor erzeugt.
8. Die Bildung von Mikrosphären in der Strömung mit Schwerpunkt Geometrie und Verfestigung der generierten Mikrosphären in das Glasgefäß mit einem digitalen Mikroskop zu beobachten.
   Hinweis: Die Größe und Geschwindigkeit der Mikrosphären hängen der Durchfluß von Lösungen und der Druck für die Mineralöl-Fluss (Tabelle 2).

3. Durchführung von Polyacrylamid Oligo-Mikrosphären zählt

1. Zur Quantifizierung der Hemocytometer nehmen Sie eine kleine Menge (ca. 100 μL) wässrige Lösung von Polyacrylamid Oligo-Mikrosphären und Platz auf der Glas-Hemocytometer, und füllen Sie sanft die Mikrosphären Suspension gut von der Zählkammer.
   Hinweis: Weitere Informationen finden Sie unter http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.
2. Verwenden Sie ein Mikroskop und Hand Stückzähler Mikrosphären in einem Satz von 16 Quadrate zu zählen. Dann verschieben Sie die Hemocytometer zum nächsten Satz der Kammer und weitermachen Sie zählen, bis alle vier Sätze von 16 Ecken gezählt werden.
3. Bestimmen Sie die Anzahl der durchschnittlichen Mikrosphären und berechnen Sie die Anzahl der Mikrosphären in der ursprünglichen Wulst-Suspension.
4. Übertragen Sie 100 μL der Mikrosphären auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Entfernen des Überstands durch sanftes Zentrifugieren (400 X g) und pipettieren.

4. Durchführung von DNA-Hybridisierung auf der Oberfläche der Polyacrylamid-Oligomicrosphere

Hinweis: Eine identische DNA-Sonde mit einer 5'-NH₂-Gruppe statt 5'-Acrytide-Modifikation wird in Lösung ich hinzugefügt und für Ap-haltigen Mikrosphären parallel getestet. DNA-Hybridisierung Ergebnisse sind in Abbildung 2dargestellt. Die Cy3 beschriftet ergänzende Oligonukleotid Sonden (GAP) Lösung sollte in einem dunklen Raum platziert werden.

1. Aufschwemmen Cy3-cAp mit 100 μl 1xTE-Puffer (TE-Puffer: 10 mM Tris und 1μM EDTA, pH 8,0) um eine Endkonzentration von 100 μM zu erreichen. Z. B. Aufschwemmen Sie 1 Pmol GAP in 100 mL TE-Puffer und Transfer zu einem Microcentrifuge Schlauch mit Aluminiumfolie abgedeckt.
   Hinweis: Für Strang-Sequenzen, siehe Tabelle 3.
2. Fügen Sie 100 μM Cy3-cAp zu einem sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit Ap copolymerisiert Mikrosphären.
3. Tippen Sie auf das Rohr ein paar Mal zu mischen und Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln für 1 h.
4. Den Überstand verwerfen und verbleibende Puffer durch Pipettieren zu entfernen.
5. Spülen Sie drei Mal mit 500 μl TE-Puffer.
6. Aufzuwirbeln Sie Mikrosphären durch leichtes Klopfen Microcentrifuge Schlauch. Wiederholen Sie Schritt 4.4.
7. Die Objektträger (75 x 50 mm) und die Abdeckung mit Alu-Folie vor Bildgebung Mikrosphären aufsetzen.

(5) asymmetrische PCR zur Verstärkung ssDNA

1. Bereiten Sie eine asymmetrische PCR-Reagenz-Mischung zur Verstärkung SsDNA analysiert werden. Die Reagenzien in Tabelle 4 auf Eis auftauen. Halten Sie nicht das Enzym Taq Polymerase (50 U/µL) auf dem Eis, sondern eher speichern sie bei-20 ° C bis benötigt.
2. Sanft Wirbel alle Reagenzien und dann kurz Zentrifugieren Rohre bei 10.000 x g für 10 s.
3. Alle Reagenzien zu kombinieren, wie in beschrieben Tabelle 4.
4. Proben in einem Thermocycler und beginnen die asymmetrische PCR unter folgenden Bedingungen: 25 Zyklen (95 ° C für 30 s, 52 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s), 85 ° C für 5 min bei 4 ° c zu halten

6. Mikrosphären-PCR zur Verstärkung ssDNA

Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt das Protokoll zur Verstärkung SsDNA in einer PCR-Reaktion-Röhre. Mikrosphären-PCR-Reaktionen wurden in 50 μl Reaktionsvolumen durchgeführt. Die detaillierte Sequenzen verwendet, um SsDNA verstärken sind in Tabelle 5aufgeführt. In diesem Fall kann Ap auf der Oberfläche der Mikrosphären an zufälligen DNA Vorlagen ergänzend Tempern. Dies ist ein sehr wichtiger Schritt für die Herstellung von komplementären DNA-Stränge (antisense DNA-Strang, Abbildung 3). Die DNA erweitert dient als Kopiervorlage für Mikrosphären-PCR Verstärkung.

1. Bereiten Sie Mikrosphären-PCR-Reagenz Mixes. Die Reagenzien in Tabelle 6 auf Eis auftauen; Denken Sie jedoch nicht das Taq Polymerase Enzym auf Eis. Bewahren Sie es bei-20 ° C bis benötigt.
2. Sanft Wirbel alle Reagenzien und dann kurz Zentrifugieren Rohre bei 10.000 x g für 10 s.
3. Erhalten Sie ca. ~ 25 Mikrosphären durch mikroskopische zählen.
   Hinweis: Die Anzahl der Mikrosphären in einem Reaktionsgefäß werden mit einem Lichtmikroskop mit 40 X Vergrößerung berechnet. Etwa 25 ~ Mikrosphären werden Mikrosphären-PCR Verstärkung. Detailliertere Informationen sind in Schritt 3.
4. Alle Reagenzien zu kombinieren, wie in beschrieben Tabelle 6.
5. Proben in einem Thermocycler und beginnen die asymmetrische PCR unter folgenden Bedingungen: 25 Zyklen (95 ° C für 30 s, 52 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s), 85 ° C für 5 min bei 4 ° c zu halten
6. Folgende Verstärkung 8 μl 6 x Ladepuffer hinzufügen und laden 15 μl jeder Probe in 2 % Agarose-Gel. Führen Sie dann die Elektrophorese bei 100 V 35 min in 1 X TAE (Tris-Acetat-EDTA, 40 mM Tris Acetat, 1 mM EDTA pH 8,2) Puffer.

(7) konfokalen Mikroskopie Erwerb

Hinweis: Die Ergebnisse der Mikrosphären-DNA-Sonde Hybridisierung werden unter einem confocal Mikroskop abgebildet. Bildanalyse erfolgt mittels ImageJ.

1. Befestigen Sie hybridisierte Mikrosphären auf die Bühne des Mikroskops in einer Halterung.
2. Wählen Sie den Laser (Helium/Neon Laser, 543 nm-Linie) und schalten Sie ihn ein in Lasersteuerung.
3. Wählen Sie die Objektivlinse in Mikroskopkontrolle.
4. Wählen Sie den gewünschten Filter für Cy3 und Kanal in Konfigurationskontrolle.
5. Starten Sie das Experiment zu und beobachten Sie die Probe. Einstellungen für das konfokale Mikroskop sind in Tabelle 7zusammengefasst.

Ergebnisse

Die vorgefertigten Polymeren Droplet-basierte mikrofluidischen Plattform besteht aus zwei Schichten in PDMS (Abbildung 1a). Drei Arten von mikrofluidischen Channel-Netzwerke sind für die Erzeugung von Mikrosphären verwendet: (1) Flow-mit Schwerpunkt Geometrie wie in Abbildung 1 b, 2) eine serpentine Kanal für mixing-Lösung I und Lösung II und (3) eine Polymerisation Kanal für Mikrosphären gezeigt Erstarrung. Die Höhe alle...

Diskussion

Verunreinigungen der DsDNA sind ein wichtiges Thema in SsDNA Verstärkung. Es bleibt schwierig, DsDNA Verstärkung in herkömmlichen asymmetrischen PCR Verstärkung¹⁵zu minimieren. Obwohl technische Verbesserungen für die Erzeugung von SsDNA uns zur Steigerung der Effizienz der Probendurchsatz aktiviert haben, ist darüber hinaus SsDNA Isolation aufgrund seiner hohen Kosten und unvollständige Reinigung Erträge nach wie vor problematisch.

Asymmetrische PCR ist eine de...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
40% Acrylamide:bis solution (19:1)	Bio-rad	1610140	Components of Copolymerizable oligo-microsphere
Ammonium persulfate, APS	Sigma Aldrich	A3678	Hardener of acrylamide:bis solution
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Catalyst of ammonium persulfate
Mineral oil	Sigma Aldrich	M5904	Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents
Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes	Bioneer	synthesized	Table 3. Sequence information
ssDNA acrydite labeled probe	Bioneer	synthesized	Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents
Tris	Biosesang	T1016	Components of TE buffer, pH buffer solution
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA amplification
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM 510	Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface
Light Microscope	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Caculating number of microspheres
T100 Thermal Cycler	Bio-rad	1861096	ssDNA amplification
Hand-held Corona Treater	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	Hydrophilic surface treatment
Hot plate	As one	HI-1000	heating plate for curing of liquid PDMS
Syringe pump	kd Scientific	78-1100	Uniform flow of Solution I and Solution II
Compressor	Kohands	KC-250A	Flow control of Solution III
Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich	Z359629	Caculating number of microspheres