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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir führen drei verschiedene Gewebe Vorbereitung Techniken für immunhistochemische Visualisierung der Ratte retinalen mikrovaskuläre perizyten, d. h. Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone Isolierung des vaskulären-Netzes.

Zusammenfassung

Netzhaut perizyten spielen eine wichtige Rolle bei vielen Erkrankungen des Auges. Immunhistochemische Färbung Techniken der Netzhautgefäße und mikrovaskuläre prägen perizyten ophthalmologischen Forschung. Es ist wichtig, eine geeignete Methode zur Visualisierung der mikrovaskulären perizyten wählen. Wir beschreiben retinalen mikrovaskuläre Pericyte immunhistochemische Färbung in Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone isoliert Gefäßsystem mit Antikörpern für Platelet-derived Wachstumsfaktor-Rezeptor β (PDGFRβ) und Nerven/Glia Antigen 2 (NG2). Dies ermöglicht es uns, vor- und Nachteile jeder der drei Gewebe Vorbereitungen für die Visualisierung von der Netzhaut mikrovaskulären perizyten hervorzuheben. Cryo-Abschnitte enthalten nur ein paar gelegentliche Quere Schnitten von den Microvasculature aber Transsectional Visualisierung aller Schichten der Netzhaut. Ganz-Mount bietet eine Übersicht über die gesamte Netzhaut Gefäßsystem, aber Visualisierung von den Microvasculature kann lästig sein. Hypotone Isolierung bietet eine Methode, um die gesamte Netzhaut Gefäßsystem durch den Abbau von Nervenzellen zu visualisieren, aber das macht das Gewebe sehr zerbrechlich.

Einleitung

Netzhaut perizyten stehen im Mittelpunkt von vielen Forschungslabors, wie diese Zellen eine wichtige Rolle in die Integrität des Gefäßsystems spielen. Pathologische Zuständen wie Diabetische Retinopathie1, Ischämie2und Glaukom3 haben vaskuläre Merkmale, die die Funktion der perizyten beinhalten. Perizyten befinden sich in der inneren retinalen Kapillaren Plexi. Der zentralen Netzhautarterie, die die inneren Netzhaut liefert verzweigt sich in zwei Schichten der Kapillare Plexi. Die innere vaskuläre Bett befindet sich zwischen dem Ganglion Zelle und nukleare Innenlagen. Die tiefere Schicht ist dicht und komplex und ist zwischen der inneren und äußeren nuclear Layer4,5lokalisiert. Darüber hinaus enthalten einige Teile der Netzhaut auch eine dritte Netz bezeichnet die radiale Parapapillary Kapillaren. Dies sind lange, gerade Kapillaren, die unter die Nervenfasern und selten liegen anastomosieren mit einander oder die anderen beiden Plexi-6. Innerhalb der Kapillare Wand perizyten sind eingebettet in die Basalmembran und Linie die abluminalen Seite des vaskulären endothelialen Zellen.

Zu diesem Zeitpunkt gibt es keine einzigartige biologische Marker für diese perizyten, die sie von anderen vaskulären Zellen unterscheiden kann. Platelet-derived Wachstumsfaktor-Rezeptor β (PDGFRβ) und Nerven/Glia Antigen 2 (NG2) sind häufig verwendete Markierungen die perizyten aber auch andere vaskulären Zellen zu präsentieren. Identifizierung von perizyten wird weiter erschwert durch das Vorhandensein von Pericyte Teilmengen, deren Morphologie und Protein Ausdruck7variiert. Derzeit setzt die besten Identifizierung auf eine Kombination aus Protein-Marker und die charakteristischen Positionierung des Pericyte in der Gefäßwand. Wir zeigen hier drei verschiedene Gewebe Präparationstechniken für immunhistochemische Färbung PDGFRβ/NG2 Ratte retinalen mikrovaskuläre perizyten, d. h., Cryo-Abschnitte, ganze-Halterungen und hypotone Isolierung des vaskulären-Netzes.

Mit Cryo-Abschnitten werden die Netzhaut und Sklera durch den Sehnerv geschnitten. Dies ermöglicht die Visualisierung aller geschichteten Strukturen von Neuronen. Die deutlichen zehn Schichten der Netzhaut sind offensichtlich als Vertauschung Kern- und axonalen/dendritischen Strukturen, die mit Flecken wie Hämatoxylin/Eosin oder fluoreszierende nuklearen 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)8visualisiert werden können. Die metabolischen Anforderungen unterscheiden sich zwischen den Schichten9 und es bietet eine Methode, um festzustellen, das dicke oder insgesamt Fehlen einer bestimmten Ebene (z. B.der Verlust von retinalen Ganglienzellen ist eines der Markenzeichen von retinale Ischämie10, 11). Das Gefäßsystem ist klar, wie quer der Netzhaut durchschneidet, die es ermöglichen, die Kapillare Plexi innerhalb der jeweiligen Netzhaut Schichten12,13separat zu studieren.

Eher traditionell sind die Untersuchungen des retinalen Gefäßsystem Netzwerks in retinalen ganze-Halterungen durchgeführt. Gewebe vorbereitet ist die Netzhaut schneiden und flach wie eine Blume-förmige Struktur. Die Methode ist eine relativ schnelle Gewebe Präparationstechnik, die das gesamte Architektur retinalen Gefäßsystem hervorheben kann und es wird daher oft in der Untersuchung der Neovaskularisation in der murinen Netzhaut angewendet. Erfolgreiche Visualisierung von Microvasculature im gesamten montierte Netzhaut wird auch in die Entwicklung Neugeborener Maus und Ratte Netzhaut14,15,16,17,18, berichtet. 19. diese Studien zeigen eine definierte Pericytic-Aktivität mit größeren Kapillar-freie Flächen bei Erwachsenen im Vergleich zu den Neugeborenen Netzhaut14.

Eine weitere Möglichkeit der Visualisierung ist die Netzhaut Microvasculature nach hypotone Isolierung. Dieses Gewebe Präparationstechnik führt Netzhautgefäße und Kapillaren der neuronalen Zellen freigegeben wird. Diese Art von zweidimensionalen Bildgebung des retinalen Gefäße inselnetzes ist in der Regel nach retinalen Trypsin Verdauung20 durchgeführt und zur Beurteilung der vaskulären Anomalien der diabetischen Retinopathie einschließlich Pericyte Verlust und Kapillare Degeneration20,21,22. Die hypotone Isolationsmethode bietet die Untersuchungen der retinalen Gefäße gen und Protein regulatorischen Reaktionen mit RT-PCR und westlichen befleckenden23,24,25getan wurde. Wir bieten hier ein Protokoll für die free-Float-immunhistochemische Färbung des das hypotone isoliert retinalen Gefäßsystem als Alternative zu Trypsin-Verdauung, mikrovaskulären perizyten zu untersuchen.

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Protokoll

Das Protokoll wurde optimiert und an erwachsenen männlichen Albino Ratten gezeigt. In allen experimentellen Verfahren wurden Tiere gemäß den Bestimmungen in der ARVO-Anweisung für den Einsatz von Tieren in Ophthalmic und Vision Forschung behandelt. Tiere wurden durch Kohlendioxid und anschließende zervikale Dislokation eingeschläfert.

1. Rat Netzhautgewebe Vorbereitungen

  1. Cryo-Abschnitt
    1. Machen Sie hinteren und vorderen ~0.5 cm Schlitze des in der Ratte Augenlid mit einem Skalpell.
      1. Kennzeichnen Sie optional: Mit einem Brenner Diathermie das Auge im inneren Winkel, um das Auge auf einheitliche Weise zu orientieren, während einbetten und ermöglichen vertikale Kryostat Schneiden durch den Sehnerv.
    2. Schnappen Sie sich das Auge mit der Pinzette und kippen vorsichtig zur Seite, um das umliegende Gewebe zu entlarven. Enucleate das Auge durch die Kürzungen mit Dissektion Schere im Bindegewebe und Muskulatur Gewebe.
      Achtung: Ziehen Sie nicht das Auge zu hart wie übermäßiger Druck auf den Sehnerv Netzhautablösung führen kann.
    3. Legen Sie das Auge kurz in 4 % Formaldehyd in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu stabilisieren, bevor eine erste Bohrung an der Hornhaut Limbus durch leichten Druck mit der Spitze eines Skalpells machen.
    4. Unter dem Mikroskop, schneiden Sie entlang der Hornhaut Limbus mit Dissektion Schere Entfernen der Hornhaut und die Linse mit der Pinzette entfernen, bevor Eintauchen in 4 % Formaldehyd in PBS für 2 – 4 h.
    5. Spülen Sie nacheinander in Sörensen Phosphatpuffer mit 10 % Saccharose und 25 % Saccharose.
    6. Betten Sie in Yazulla Medium zubereitet mit 3 % Gelatine vom Schwein Haut und 30 % Albumin von Huhn-Ei-weiß.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier mit Gewebe Lagerung bei-20 ° c angehalten werden
  2. Vollständig-hängen
    1. Machen Sie hinteren und vorderen ~0.5 cm Schlitze in der Ratte Augenlid mit einem Skalpell.
    2. Schnappen Sie sich das Auge mit der Pinzette und kippen vorsichtig zur Seite, um das umliegende Gewebe zu entlarven. Enucleate das Auge durch die Kürzungen mit Dissektion Schere im Bindegewebe und Muskulatur Gewebe.
      Achtung: Ziehen Sie nicht das Auge zu hart wie übermäßiger Druck auf den Sehnerv Netzhautablösung führen kann.
    3. Legen Sie das Auge kurz in 4 % Formaldehyd in PBS zu stabilisieren, bevor eine erste Bohrung an der Hornhaut Limbus durch leichten Druck mit der Spitze eines Skalpells machen.
    4. Unter dem Mikroskop Schnitt entlang der Hornhaut Limbus mit Dissektion Schere Entfernen der Hornhaut und die Linse mit einer Pinzette zu entfernen.
    5. Trennen der Netzhaut von das retinale Pigmentepithel in Richtung des Sehnervs mit der Pinzette mit kleinen Kopfsätze großen reißen zu vermeiden.
    6. Die Netzhaut bei den Sehnerv mit Dissektion Schere frei und stellen vier Schlitze von wenigen Millimetern Länge aus der netzhautperipherie in Richtung des sehnervenkopfes.
    7. Die Netzhaut auf einen Objektträger zu verbreiten und für 5 – 10 min trocknen lassen.
    8. Korrigieren Sie in 4 % Formaldehyd für 20-30 min von Formaldehyd auf die Netzhaut tropft.
      Achtung: Gelten Sie nicht direkt auf der Netzhaut, wie es aus dem Glas lösen kann.
    9. Spülen mit PBS. Für ein optimales Ergebnis, Immuno-Fleck direkt nach dem spülen.
  3. Hypotone Isolierung
    1. Machen Sie hinteren und vorderen ~0.5 cm Schlitze in der Ratte Augenlid mit einem Skalpell.
    2. Schnappen Sie sich das Auge mit der Pinzette und kippen vorsichtig zur Seite, um das umliegende Gewebe zu entlarven. Enucleate das Auge durch die Kürzungen mit Dissektion Schere im Bindegewebe und Muskulatur Gewebe.
      Achtung: Ziehen Sie nicht das Auge zu hart wie übermäßiger Druck auf den Sehnerv Netzhautablösung führen kann.
    3. Machen Sie eine erste Bohrung an der Hornhaut Limbus durch leichten Druck mit der Spitze eines Skalpells.
    4. Unter dem Mikroskop Schnitt entlang der Hornhaut Limbus mit Dissektion Schere Entfernen der Hornhaut und die Linse mit einer Pinzette zu entfernen.
    5. Trennen Sie die Netzhaut von das retinale Pigmentepithel in Richtung des sehnervenkopfes mit der Pinzette mit kleinen Kopfsätze großen reißen zu vermeiden.
    6. Kostenlos die Netzhaut auf den Sehnerv mit Dissektion Schere, die Netzhaut in 1 mL entionisiertem Wasser in einer 24-Well-Platte und schütteln bei 200 u/min mit einem 1,5 mm Vibration Orbit für 1 h bei Raumtemperatur.
      Hinweis: Im folgenden die Netzhaut erscheint weniger an den Rändern definiert.
    7. Fügen Sie 200 U DNAse 1 um die Trümmer lysierten Zellen der Netzhaut Gefäßsystem zu distanzieren und schütteln für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur.
      Hinweis: Trümmer könnten in den Brunnen zu bilden beginnen.
    8. Spülen Sie mindestens 3 Mal in entionisiertem Wasser für 5 min mit schütteln bei 150 bis 300 u/min, neuronale Zelle Ablagerungen zu entfernen. Die Netzhaut sollte mit jeder Spülung bezeichnend für die Entfernung von neuronalen zelltrümmer transparenter.
      1. Verwenden Sie einen dunklen Hintergrund um zu prüfen, die 24-Well-Platte, die durchscheinenden isolierende retinale Gefäßsystem klar zu sehen.
      2. (Optional): Wenn das Gefäßsystem nicht frei von neuronalen Ebenen (semi-transparent) an dieser Stelle entweder mehr spülen Schritte hinzufügen erscheint, schütteln beschleunigen oder über eine pipettieren Aspirieren Sie Flüssigkeit auf das Gefäßsystem.
        Achtung: Entweder die optionalen Schritte können das Gefäßsystem beschädigen.
    9. 10 min in 1 mL 4 % Paraformaldehyd in PBS bei Raumtemperatur und Spülen mit PBS-Puffer 3 Mal zu beheben.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier mit Gewebe Lagerung bei 4 ° c angehalten werden

(2) Immunhistochemie

  1. Färbung der Cryo-Abschnitte
    1. 10 µm Cryo-Sektionen der Gelatine eingebettet Netzhaut als vertikaler Schnitt durch den Sehnerv und die Cryo-Abschnitte auf einem Objektträger und trocknen lassen (mindestens 1 h).
    2. Tauchen Sie den Objektträger in PBS mit 0,25 % Triton x-100 (PBS-T) für 15 Minuten.
    3. Drip, 1 PDGFRβ: 100 und 1: 500 NG2 Primärantikörper in PBS-T + 1 % BSA auf der Cryo-Sektion verdünnt und über Nacht in Inkubation Kammern bei 4 ° C inkubieren.
    4. Tauchen Sie den Objektträger 2 Mal im PBS-T für 15 min und 1: 100 Anti-Maus Alexa Fluor 594 verknüpft und 1: 100 Anti-Kaninchen FITC-linked Sekundärantikörper verdünnt in PBS-T mit 3 % BSA auf der Cryo-Abschnitte tropft.
    5. Inkubieren Sie die Objektträger 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    6. Spülen Sie die Objektträger in PBS-T 2 x 15 min..
      Hinweis: Optional: für Doppel- und Dreibettzimmer immunofluorescent Färbung, sequentielle Färbung von wiederholen den Vorgang von 2.1.3 auf 2.1.6 zwei bis dreimal bzw. durchgeführt werden kann.
    7. Montieren Sie die gefärbten Cryo-Abschnitte mit Anti-Fading Montage mittlerer mit DAPI und einem deckgläschen.
  2. Färbung des gesamten-mount
    1. PBS-T auf die gesamte-Mount Tropfen und bei Raumtemperatur 15 min inkubieren.
    2. Gießen Sie ab und Tropfen Sie 1: 100 PDGFRβ und 1: 500 NG2 Primärantikörper in PBS-T + 1 % BSA verdünnt ab und über Nacht in feuchten Kammern bei 4 ° C inkubieren.
    3. Abgießen und abtropfen auf PBS-T auf den Objektträger in 2 x 15 min. spülen.
    4. Abgießen und abtropfen auf 1: 100 Anti-Kaninchen Cy2 und 1: 100 Anti-Maus Cy3 verknüpft Sekundärantikörper verdünnt in PBS-T mit 3 % BSA 1 h in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
    5. Abgießen und abtropfen auf PBS-T, 2 x 15 min in der Dunkelheit zu spülen.
      Hinweis: Optional: für Doppel- und Dreibettzimmer immunofluorescent Färbung, sequentielle Färbung von wiederholen die Prozedur von 2.2.2 2.2.5 bzw. zwei bis dreimal durchgeführt werden kann.
    6. Montieren Sie die gefärbten vollständig-hängen mit Anti-Fading Montage mittlerer mit DAPI und einem deckgläschen.
  3. Färbung der hypotone isoliert Gefäßsystem
    1. Blockieren Sie das hypotone isolierende Gefäßsystem 1 h unter Schütteln bei 100 u/min und Raumtemperatur mit 500 µL/Well 10 % Esel Serum in PBS verdünnt.
    2. Über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren und schütteln bei 100 u/min mit 600 µL/Well von 1: 100 PDGFRβ und 1: 500 NG2 primären Antikörpern im Serum 10 % Esel in PBS verdünnt.
    3. Spülen der Netzhaut Netzwerk 3 X mit PBS-Puffer für 5 min und in 1: 100 Anti-Maus Alexa Fluor 594 verknüpft und 1: 100 Anti-Kaninchen FITC-linked Sekundärantikörper verdünnt in 10 % Esel Serum in PBS schütteln bei 100 u/min und 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Für 5 min in PBS-T abspülen und in 0,2 ng/mL DAPI im PBS-T für 15 min, gefolgt von 3 x 5 min Spülungen im PBS-T im Dunkeln inkubieren.
    5. Schneiden Sie die Spitze des einen Kunststoff Pasteur pipettieren, Befeuchten Sie es mit PBS-T und es verwenden Sie, um das retinale Netzwerk auf einen 4-Well Kammer Objektträger übertragen.
      Hinweis: Der befeuchtenden Schritt ist wichtig, die Netzhaut Gefäßsystem festhalten an der Innenseite des Pasteur pipettieren zu vermeiden.
    6. Die Netzhaut Gefäßsystem zu entfalten. Berühren Sie das retinale Gefäßsystem mit einer Pinzette, da dadurch das Gefäßsystem zu verwirren können.
      Hinweis: Entfaltung kann erfolgen durch die Kammer Folie hin und her kippen oder Absaugen von Flüssigkeit auf der Netzhaut Gefäßsystem sinkt.
    7. Entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen. Die Oberflächenspannung der Flüssigkeit wird das Gefäßsystem auf die Unterseite der Folie glätten.
    8. Stellen Sie sicher, richtig entfaltet sich unter dem Mikroskop, vor Entfernen der Plastik aus der Kammer Folie aufsteigt.
    9. Montieren Sie die gefärbte Gefäßsystem mit Anti-Fading Eindeckmittel und einem deckgläschen.

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Ergebnisse

Die erfolgreiche Protokolle bieten drei verschiedene retinalen Präparate zur Visualisierung von mikrovaskulärer perizyten. Jede dieser Methoden verwendet, die PDGFRβ und NG2 Immunoreactivity Co-Lokalisierung und die einmalige Lage der perizyten, die wrap-around der Kapillaren Endothel Foridentification.

Mit Cryo-Abschnitte die neuronalen Schichten durch die fluoreszierenden Dichte des DAPI gekennzeichnet Kernen und inneren id...

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Diskussion

Wir präsentieren Ihnen drei retinalen Vorbereitung Techniken, die in der Studie von mikrovaskulären retinalen perizyten angewendet werden können. Unten, wir bieten einen Vergleich zwischen den einzelnen Methoden und wichtige Schritte in den Protokollen zu markieren.

Mit Cryo-Schnitt, die Netzhaut ist in sagittaler Abschnitte geschnitten und daher ist es möglich, zahlreiche Exemplare von der gleichen Netzhaut zu erhalten. Die Bezugszeichen Abschnitte aus dieser Methode machen es ideal für ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Forschung wurde finanziert durch die Lundbeck Foundation, Dänemark.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Geletin from porcine skinSigma-AldrichG2625-500G
Albumin from chicken egg whiteSigma-AldrichA5253-500G
Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreasSigma-AldrichD5025-15KUDissolved in 0.15 M NaCl
Bovine serum albumin (BSA)VWR0332-100G
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch017-000-121, lot 129348
Rabbit anti-PDGFRβSanta Cruzsc-4321:100
Mouse anti-NG2Abcamab500091:500
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-585-1521:100
Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-095-1511:100
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-225-1521:100
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-165-1501:100
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542-1MGDissolved in DMSO
Anti-fading mounting mediumVector LaboratoriesH-1000
Anti-fading mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slideThermo Fisher Scientific154526

Referenzen

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