Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das Vorhandensein von lebensfähigen Mikrobiota in Tick Eingeweide mit einem modifizierten vollständig-hängen in-situ Hybridisierung Ansatz räumlich und zeitlich zu bewerten.

Zusammenfassung

Infektionskrankheiten, die durch Arthropoden Vektoren übertragen weiterhin eine erhebliche Bedrohung für die menschliche Gesundheit weltweit dar. Die Erreger dieser Krankheiten verursachen existieren nicht isoliert, wenn sie den Vektor kolonisieren; vielmehr führen sie wahrscheinlich Interaktionen mit ansässigen Mikroorganismen im Darm Lumen. Die Vektor-Mikrobiota nachgewiesen wurde, eine wichtige Rolle bei der Übertragung der Erreger für mehrere vektorübertragene Krankheiten. Ob ansässige Bakterien im Darm der Zecke Ixodes Scapularis , der Vektor der mehrere humanpathogene Erreger Borrelia Burgdorferi, einschließlich Tick Übertragung von Krankheitserregern beeinflussen werden nicht bestimmt. Wir benötigen Methoden zur Charakterisierung der Zusammensetzung der Bakterien ermöglichen ein besseres Verständnis der Interspezies Wechselwirkungen im Darm Tick Tick Darm zugeordnet. Mit vollständig-hängen in Situ kann Hybridisierung, RNA-Transkripte, die verbunden sind mit bestimmten Bakterienarten zu visualisieren für die Sammlung qualitativer Daten in Bezug auf die Häufigkeit und Verteilung der Mikrobiota in intaktem Gewebe. Diese Technik kann verwendet werden, um Änderungen im Darm Microbiota Milieu im Laufe der Zecke, die Fütterung zu überprüfen und kann auch angewendet werden, um die Expression von Genen Tick zu analysieren. Färbung des ganzen Tick Eingeweide Ausbeute Informationen über die grobe räumliche Verteilung der Ziel-RNA im Gewebe ohne die Notwendigkeit für dreidimensionale Rekonstruktion und weniger Umweltverschmutzung, die häufig die Sequenzierung-basierte verwirrt betroffen ist Methoden, die häufig verwendet, um komplexe mikrobielle Gemeinschaften zu studieren. Insgesamt ist diese Technik ein wertvolles Instrument, das besser genutzt werden kann Vektor-Erreger-Mikrobiota Interaktionen und ihre Rolle bei der Übertragung von Krankheiten zu verstehen.

Einleitung

Mensch und Vieh Krankheitserreger übertragen durch Arthropoden Vektoren finden sich weltweit und entfallen etwa 20 % von Infektionskrankheiten weltweit¹, aber effektiv und sichere Impfstoffe gegen die meisten dieser Erreger sind nicht verfügbar. Unser Verständnis für die Bedeutung von Kommensalen, symbiotische und pathogenen Mikroorganismen, zusammen bekannt als Mikrobiom², Modulation und Formen die Gesundheit fast aller Metazoen³ erweitert. Es ist nun offensichtlich, dass Arthropoden Überträger von Krankheitserregern auch Darm Microbiota Hafen und dieser Vektor-assoziierten Mikrobiota haben gezeigt, dass verschiedene Vektoren übertragene Krankheitserreger^4,5beeinflussen. Die Arthropoden Microbiome besteht aus Eubakterien, Archaeen und Viren eukaryotic Mikroben wie Protozoen, Nematoden und Pilze⁶. Aber wurde die vorherrschende Forschungsschwerpunkt Eubakterien zurückzuführen, zum Teil, um die Verfügbarkeit von Markergenen und Referenzdatenbanken, bestimmte bakterielle Mitglieder zu identifizieren.

Mit einem Fokus auf Ixodes Scapularis, die Zecke Vektor mehrere humanpathogene Erreger Borrelia Burgdorferi⁷, einschließlich der Erreger der Lyme-Borreliose, die Optimierung der mikrobiellen Visualisierungstechnik zielte ein besseres Verständnis der Zecke Darm Microbiota im Zusammenhang mit Vektor-Pathogen Interaktionen. Einige Fragen bleiben, um im Feld Tick Microbiome beantwortet werden. Der Darm ist die Website der erste längere Begegnung zwischen der Zecke und der eingehenden Erreger im Zusammenhang mit horizontal übertragenen Krankheitserreger; Daher wird das Verständnis der Rolle der Vektor Darm Microbiota Modulation Vektor-Pathogen Interaktionen aussagekräftige Erkenntnisse offenbaren. Zecken haben eine einzigartige Art der Blutmahlzeit Verdauung, wo Platz Verarbeitung der Blutmahlzeit Komponenten erfolgt intrazellulär⁸. Die Darm-Lumen scheinbar dient als Gefäß für die Blutmahlzeit der Zecke Feeds enthalten, und Nährstoff Verdauung und Assimilation ergeben in den Tagen der Fütterung und weiter nach Übersättigung. Die Krankheitserreger erworben von der Zecke während der Fütterung geben Sie das Darm Lumen zusammen mit dem Blutsaugen und somit das Lumen eines primären Standorts von Interaktionen zwischen den Tick, Erreger und resident Mikrobiota. Im weiteren Verlauf Verdauung durch die Kalorienzahl und Ixodid Häckchen Häutung erfährt der Darm strukturelle und funktionelle Veränderungen⁹. Die Zusammensetzung und die räumliche Organisation der Darmbakterien dürfte auch im Konzert mit den wechselnden Darm-Milieu zu variieren. Deshalb ist es wichtig, die Architektur der ansässigen Bakterien im Darm zu verstehen, das Zusammenspiel von Tick, Erreger und Darm Microbiota Tick zu verstehen.

Molekulare Techniken, um Host-assoziierten Mikrobiota routinemäßig beschreiben nutzen parallel Hochdurchsatz-Sequenzierung Strategien¹⁰ zu verstärken und zu sequenzieren bakterielle 16 s ribosomalen DNA (rDNA). Diese Abfolge Strategien umgehen axenic Kulturen von bestimmten Bakterien zu erhalten und bieten eine ausführliche Beschreibung aller bakteriellen Mitglieder in der Stichprobe vertreten werden müssen. Dennoch sind solche Strategien durch die Unfähigkeit, ökologische Verunreinigungen von Bona Fide Bewohner unterscheiden verwechselt. Weiter, bei der Beurteilung von Proben, wie Zecken, die sind klein und daher enthalten geringe Mikrobiota-spezifische DNA ergibt, die Wahrscheinlichkeit der Verstärkung von Umweltschadstoffen erhöhte¹¹ und führt die zweideutige Interpretation des Microbiome Zusammensetzung. Funktionelle Charakterisierung in Verbindung mit der Visualisierung von bestimmten lebensfähige Bakterien, daher werden kritisch zu definieren und zu erkennen das Mikrobiom der Zecke, zeitlich und räumlich. Auf dieses Ziel nutzten wir die gesamte-Mount RNA in Situ Hybridisierung. Diese Technik wird routinemäßig verwendet, um gen Expressionsmuster in Organen und Embryonen^12,13,14 beurteilen und ermöglicht semiquantitative Analyse des Ausdrucks über die gesamte Stichprobe von Interesse. Dies unterscheidet sich von traditionellen in Situ Hybridisierung Techniken die Gewebeschnitte nutzen und erfordern häufig umfangreiche Analyse des geschnittenen Materials mit einer rechnerischen Versammlung Ausdruck in ganze Organe¹⁵vorherzusagen. Während vollständig-hängen in der Regel auf ganze Organismen¹²bezieht, bezieht sich hier ganze-Mount auf ganze Eingeweide und Organe. Die Vorteile der Verwendung von ganz-Mount RNA in Situ Hybridisierung Ansatz um zu beurteilen, die Architektur der Zecke Darm Microbiota sind vielfältig. Die Zecke Darm besteht aus 7 Paar Divertikel, jedes Paar unterschiedlicher Größe¹⁶. Die funktionalen Unterschiede, wenn jemand unter dieser Divertikel nicht im Zusammenhang mit der Zecke Biologie verstanden werden kreuzen Mikrobiota oder Tick-Pathogen Interaktionen. Manipulationen des Darms, die den Darm Divertikel platzen würde Mikrobiota in das Lumen des Darms oder die lose mit den Darm und führen zu Fehlinterpretationen der räumliche Lokalisation der Mikrobiota verdrängen. Fluoreszenz-markierte RNA in Situ Hybridisierung wurde früher verwendet worden, um Tick Darm Transkripte¹⁷ untersuchen durch Fixierung und öffnen einzelne Darm Divertikel Sonde Hybridisierung zu gewährleisten und B. Burgdorferi zu lokalisieren Abschriften von Paraffin-eingebetteten ganze Zecken¹⁸-Schnitt. Beide Ansätze erfordern Manipulationen der Zecke Gewebe vor der Hybridisierung, die die Darm Microbiota Architektur beeinflussen würden.

In diesem Bericht beschreiben wir ausführlich das Protokoll um tragfähige Tick Darm Microbiota mit vollständig-hängen in Situ Hybridisierung (WMISH) zu untersuchen. Die Verwendung von ganzen-Mount RNA in Situ Hybridisierung ermöglicht ein globales Verständnis der Gegenwart und Fülle von bestimmten Darmbakterien in den verschiedenen Regionen des Darms und kann neue Einblicke in die Zecke Darm Biologie im Rahmen des Erregers Kolonisation Sporn und Getriebe. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von RNA-Sonden, die gegen bestimmte bakterielle RNA Erkennung von lebensfähigen Bakterien im Darm von Zecken.

Protokoll

1. Vorbereitung der DNA-Templates

1. Die 16 s rRNA Sequenz spezifische auf jede bakterielle Gattungen von NCBI Datenbank und Design Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kompatibel vorwärts herunterladen und reverse Primer, die Gattungen-spezifische Regionen (~ 200-250-Basenpaare lang) verstärken werden, wie oben beschrieben ¹⁹. Siehe auch die open-Source-Datenbanken SILVA^20,21 und ProbeBase²² Online-Ressourcen für rRNA-gezielte Oligonukleotid Sonden und Grundierungen, RNA-Sonden für einige bakterielle Gattungen kommerziell sein mag zur Verfügung.
   Hinweis: Es ist wichtig, wählen Genregionen, die nur für bestimmte Gattungen sind und dafür sorgen, dass gestaltete Primer nicht verwandte bakterielle Gattungen verstärken. Dies ist entscheidend für gen/Gattungen-spezifischen Sonde Hybridisierung zu erhalten.
2. Ernähren Sie Zecken sich für 24, 48 oder 72 h an Mäusen, Tick Mut zu sezieren und RNA und cDNA von Tick Mut wie beschrieben früheren²³vorzubereiten. Verwendung cDNA als Vorlage zur PCR verstärken Gattungen-spezifischen Amplifikate mit einem Thermocycler. Führen Sie eine Aliquote des PCR-Produkt/Amplifikate auf einem 1,5 % Agarose-Gel und bestätigen Sie, dass der erwarteten Größe der Amplifikate durch Visualisierung unter ultraviolettem (UV) Licht mit einem Gel imaging-System entspricht.
3. Klonen Sie die bakterielle 16 s ribosomalen RNA Amplifikate von Interesse in einen handelsüblichen TA Vektor (Table of Materials), die RNA-Polymerase Promotoren geeignet für Bakteriophage Polymerasen (SP6, T7 oder T3) enthalten. Die Klone zur Bestätigung der Identität der Amplifikate und die Richtwirkung des Klons in Bezug auf jeden der Promotoren-Sequenz. Bestimmen Sie auf dieser Basis, dass der Veranstalter der Wahl um Sinn oder antisense-RNA zu generieren (Abb. 1) Sonden.
4. Linearisieren Sie 1 mg des Plasmids mit einem entsprechenden Beschränkung Enzym in einem Reaktionsvolumen von bis zu 30 µLfor 2 h bei Temperaturen, die vom Hersteller empfohlenen. Wählen Sie Restriktionsenzyme anhand der Projektträger, der verwendet wird, um den Sinn oder antisense-Sonde (Abbildung 1) zu erzeugen. Überprüfen Sie die Linearisierung durch Visualisierung von 2 µL Digest Reaktion auf einem 1 % Agarose-Gel.
5. Die restlichen 28 µL verdaute DNA mit Hilfe eines handelsüblichen PCR Produkt Spalte Reinigung-Kits zu reinigen und Quantifizierung der DNA-Konzentration von Spektralphotometer.
   Hinweis: Einige Sinn-Sonden möglicherweise Hintergrundfärbung viel höher als die entsprechende Antisense-Sonde und andere Optionen können erforscht werden müssen. Alternative Negativkontrollen enthalten Plasmide Codierung Sequenzen in der Probe oder einer anderen Sonde, die ergibt sich ein charakteristisches Muster der Hybridisierung nicht vertreten.

2. Konstruktion des Digoxygenin-UTP-RNA-Sonden

1. Bereiten Sie die Nukleotid-Mischung durch die Kombination von 7,5 µL 100 mm UTP, 25 µL 10 mM Digoxygenin-UTP und 10 µL pro 100 mM ATP, GTP und CTP in einem 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.
2. Führen Sie in Vitro Transkription mit handelsüblichen T7 oder Sp6 RNA-Polymerase-Kits, mit 1 µL Nukleotid-Mix (Schritt 2.1) und 0,25 - 1 µg DNA-Vorlage. Das Volumen bis zu 20 µL mit Wasser zu bringen. Streichen Sie das Rohr zu kombinieren und Impuls-Spin. Inkubation bei 37 ° C für 2,5-3 h.
   Hinweis: Sonde Bau war erfolgreich mit verdaute Plasmid Konzentrationen so niedrig wie 7 ng/µL, aber typische Konzentrationen an diesem Schritt reichen von 15-25 ng/µL. Die Transkription Reaktion kann auch über Nacht bei 37 ° C inkubiert werden, aber dies erhöht sich nicht deutlich die RNA-Ausbeute.
3. Fügen Sie 1 µL DNase (2.000 Einheiten/µL) und bei 37 ° C für 10 min inkubieren. 10 min nicht überschreiten, oder das Enzym kann beginnen, erniedrigende RNA.
4. Fügen Sie 30 µL eiskalte 7,5-8 M Lithiumchlorid und 30 µL Nuklease-freie Kaltwasser, überstürzen sich die RNA. Streichen Sie das Rohr zu mischen. Lassen Sie Ausfällung von RNA über Nacht bei-20 ° c gehen
5. Sammeln Sie RNA durch Zentrifugation bei 17.000 x g für 20 min bei 4 ° C. Waschen Sie das Pellet einmal mit 1 mL frisch zubereitete 75 % Ethanol in Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Wasser zu, dann wiederholen Sie Zentrifugation.
6. Entfernen den überstand verwerfen, Invertieren Sie das Rohr auf einem sauberen Papiertuch und trocknen lassen für 10 min. Aufschwemmen das Pellet in Nuklease-freies Wasser. Wenn die Pellets leicht sichtbar ist, in 25 µL aufzuwirbeln. Wenn das Pellet sehr klein oder nicht sichtbar ist, Aufschwemmen in 15-20 µL. erhalten eine Schätzung der RNA-Konzentration durch Spektralphotometer.
   Hinweis: Typische RNA-Konzentrationen reichen von 200-500 ng/µL.

(3) Visualisierung der RNA-Sonden durch RNA Formaldehyd Gelelektrophorese RNA Reinheit bewerten

Achtung: Formaldehyd birgt die Gefahr eines Einatmen; Daher generiert die Lösungen für RNA Gelanalyse unter einem Abzug. Interkalation bromid ist karzinogenverdächtig; mit Vorsicht handhaben.

1. Bereiten Sie eine 1 % Formaldehyd-Agarose-Gel, wie zuvor^{24 beschrieben} und warf das Gel in einer Gel-Box frei von RNases. Nach dem Abkühlen, füllen Sie die Gel-Box mit 1 x Puffer (1 X MOPS bei pH 7,0, 5 % Formaldehyd) laufen.
2. Bereiten Sie den Probenpuffer (5 µL 400 mg/mL Interkalation Bromid, 20 µL 10 x MOPS, 35 µL Formaldehyd und 100 µL Formamid). Kombinieren Sie 2 µL RNA-Sonde (Schritt 2.6) mit 8 µL Probenpuffer. Bei 70 ° C für 10 min inkubieren.
3. Bereiten Sie RNA laden Puffer durch die Kombination von 5 mL 50 % Glyzerin, 1 mL 10 % Formaldehyd 40 mg Bromophenol blue, 40 mg Xylol Cyanol und 20 µL 0,5 M EDTA (pH 7,5). Nach dem Gebrauch speichern dieser Puffer bei-20 ° C.
4. 3 µL Puffer laden die RNS-Probe aus Schritt 3.2 hinzufügen und mischen. Halten Sie Probenröhrchen auf Eis.
5. Laden Sie das gesamte Probenvolumen aus Schritt 3.4 in das Gel. Laden Sie eine Aliquote einsträngige RNA Leiter neben um RNA Größe zu überprüfen. Führen Sie das Gel bei 100 V oder senken Sie, bis der blaue Farbstoff ca. 75 % der Weg nach unten das Gel wandert. Visualisierung der RNS unter UV-Licht mit einem Gel-imaging-System.
   Hinweis: Eine gute Qualität-RNA-Sonde sollte als diskrete Band mit einer Mobilität, die entsprechend der erwarteten Größe der Sonde (Abbildung 2, Spur 1) angezeigt. Wenn die Sonde als diffus und schmierig Band (Abbildung 2Lane 2) erscheint, dies sollte nicht verwendet werden.

4. kreuzen Sie Darm Sammlung und Fixierung

1. Sammeln Sie Ixodes Scapularis Nymphen, die genährt haben bei Mäusen nach der Zeit Points of Interest.
   Hinweis: Für die Zwecke dieser Technik gefüttert Zecken am besten für 48 oder 72 h Arbeit.
2. Zerlegen Sie den Darm von der Zecke in MEMFA (Tabelle 1) auf einen Glasobjektträger Mikroskop Dissektion, Vermeidung von Schäden an der Orgel so weit wie möglich. Setzen Sie ein Häkchen auf einen sauberen Objektträger in 20-30 µL des MEMFA. Mit ein paar sterile High-Carbon Stahl Klinge #11 Stück des Kopfes am Scutum der Zecke aus dem Körper der Zecke. Drücken Sie sanft den Körper, um den Darm Divertikel und Speicheldrüsen, die Körper Nagelhaut schieben. Die Speicheldrüsen und den Darm zu trennen und Schaufel den Mut auf der Rasierklinge.
3. Sammeln Sie Mut in einem 1,5 mL Röhrchen mit 500 µL MEMFA. Inkubieren Sie das Rohr bei Raumtemperatur mit sanftes Schaukeln für 1 Stunde oder über Nacht bei 4 ° C.
   Hinweis: Speicheldrüsen der Zecke kann auch seziert und ebenso fixiert und gefärbt.
4. Entwässern Sie das Gewebe durch Waschen sanft 3 Mal mit 1 mL eiskaltes 100 % Ethanol. Lassen Sie den Mut, die natürlich auf den Grund des Rohres zwischen jedem Waschgang sinken, Zentrifugation das Gewebe beschädigen. Halten Sie für die langfristige Lagerung die Proben in 100 % igem Ethanol bei-20 ° C.

5. Bau von Mesh Probe Körbe und 24 Wohlen Korbträger

1. Schneiden Sie die Böden von 2 mL oder 5 mL Snap-Top Zentrifuge Röhren mit einer beheizten einschneidig Rasierklinge auf ein Skalpell.
   Achtung: Die Klinge möglicherweise müssen Sie mehrmals aufgewärmt werden, bevor der Schnitt abgeschlossen ist.
2. Schneiden Sie Quadrate von 110 µm-Nylon-Mesh etwas größer als die neue Röhre Öffnung. Binden Sie das Netz auf den Boden des Rohres durch zusammendrücken sie leicht auf einer heißen Platte auf mittlerer Hitze bis eine gute Abdichtung vorgenommen wird. Lassen Sie abkühlen, sicherzustellen Sie, dass keine Lücken zwischen dem Netz und den Schlauch, und schneiden Sie überschüssiges Gewebe an den Rändern.
3. Löcher in den Deckel von einer 24-Well-Platte geschnitten, so dass die Lippe der Probe Korb gemacht im Schritt 5.2 am Loch sitzen und nicht durchfallen, nachgeben ein Setup, wo werden die Böden der Körbe Probe ganz in den Vertiefungen sitzen, wenn sie in platziert werden, die Löcher in der Abdeckung.
4. Verwenden Sie diese angepassten korbträger Körbe mit relativer Leichtigkeit für die Gesamtheit der in Situ Hybridisierung Protokoll von einer Platte auf einen anderen übertragen. Verwenden Sie zwei 24-Well-Platten, so dass während einer Inkubation stattfindet, die andere Platte für die nächste Wäsche bereit ist.

6. in Situ Hybridisierung: Tag 1 (Timing: 4-5 Std.)

1. Transfer-Mut, beschriftet Probe Körbe, getrennt durch versuchsbedingung und RNA-Sonde bestimmt.
   Hinweis: Flecken von mindestens 5 Mut pro Zustand, um natürliche Unterschiede zwischen den Wiederholungen zu berücksichtigen.
2. Rehydrieren Sie die Proben vorsichtig, um zu vermeiden, Einführung von Luftblasen in das Gewebe durch die schrittweise Erhöhung des Verhältnisses von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % nichtionische Tenside (PTw; Tabelle 1) zu Ethanol in den Waschungen.
   Hinweis: Schließe alle wäscht in 24 Wohlen korbträger bei Raumtemperatur mit sanften Agitation, sofern nicht anders angegeben. Aliquoten 500-600 µL Waschlösungen in jede Vertiefung des Inhabers so, dass die Eingeweide in jedem Korb vollständig eingetaucht sind. Bereiten Sie alle Lösungen mit DEPC-behandeltem Wasser, RNA-Abbau zu verhindern.
   1. Gewaschen Sie die Proben für 5 min in 500 µL 100 % igem Ethanol werden.
   2. Bereiten Sie mindestens 500 µL pro Probe Korb von 75 %, 50 % und 25 % Ethanol in PTw. rehydrieren die Proben durch Waschen für 5 min in jeder Umzug von der höchsten ethanolkonzentration auf den niedrigsten Ethanol-Lösung.
   3. Waschen Sie die Proben 4 mal 5 min in PTw.
3. Permeabilize der Proben mit Proteinase K (10 µg/mL) in 5 min PTw.
4. Bereiten Sie das Gewebe für die Hybridisierung mit der RNA-Sonden.
   1. Waschen Sie die Proben zweimal wie in 6.2 in 24 Wohlen korbträger bei Raumtemperatur mit sanften Agitation für 5 min in 500 µL Triethanolamin Puffer (0,1 M, pH 7.0-8.0) (Tabelle 1) weiterhin die Proben in einem Amin-freie Umgebung beschrieben.
   2. Behandeln Sie die Proben zweimal mit 500 µL 0.25 % Essigsäureanhydrid in Triethanolamin Puffer (0,1 M, pH 7.0-8.0) für 5 min, dann waschen Sie die Proben zweimal in PTw für 5 min.
      Hinweis: Die Essigsäureanhydrid acetylates freie Amine um positive Ladung, der ist entscheidend für verhindern elektrostatische Wechselwirkungen unspezifische und spezifische Bindung der Sonde zu mRNA zu neutralisieren.
   3. Befestigen Sie den Mut für 20 min mit 500 µL 4 % Paraformaldehyd in PTw, dann waschen Sie 5 Mal für 5 min in PTw.
   4. Prehybridize durch Inkubation der Proben in 500 µL Hybridisierung Puffer /in 24 Wohlen korbträger in der 24-well-Platte (Tabelle 1) 1,5-2,5 Stunden bei 60 ° C mit sanften Agitation im Wasserbad schütteln. Speichern des Hybridisierung Puffers verwendet für den prehybridization Schritt zur Wiederverwendung in der Tag-2-Protokoll (Schritt 7.1).
   5. Bereiten Sie Sonde Hybridisierung Lösungen durch RNA-Sonden in Hybridisierung Puffer, eine Endkonzentration von 1 µg/mL zu verdünnen.  Inkubieren Sie Proben mit Sonde Hybridisierung Lösungen in der 24-Well korbträger bei 60 ° C mit sanften Agitation über Nacht in einem schütteln Wasserbad (Tabelle 2). Die Abdeckplatte tragen die korbträger behaglich mit Alufolie um Verdunstung der Hybridisierung Lösung zu verhindern.

7. in Situ Hybridisierung: Tag 2 (Timing: 4,5-5,5 h)

1. Entfernen Sie die Proben aus der Sonde Hybridisierung Lösungen und legen Sie sie in den reservierten Hybridisierung Puffer vom Vortag. Bei 60 ° C mit sanften Agitation für 3 min inkubieren.
   Hinweis: Sonde Hybridisierung Lösungen können bei-20 ° C zur Wiederverwendung bis zu 3 Mal gespeichert werden.
2. Bereiten Sie 2 x Kochsalzlösung-Natrium-Citrat-Puffer (SSC) durch Verdünnung 20 X SSC in DEPC-behandeltem Wasser (Tabelle 1). Waschen Sie die Proben zweimal für 3 min mit 2 x SSC, dann 3 Mal für 20 min mit 2 X SSC bei 60 ° C, alle Spuren von Sonde und Hybridisierung Puffer zu entfernen.
3. Behandeln mit RNase ein (20 µg/mL) und RNase T₁ (10 µg/mL) 2 x SSC für 30 min bei 37 ° C zu entfernen, einzelne gestrandet vertritt freie RNA-Sonde hybridisiert RNA.
4. Waschen, einmal mit 2 X SSC für 10 min bei Raumtemperatur. Bereiten Sie 0,2 X SSC durch Verdünnung 2 X SSC in DEPC-behandeltem Wasser, dann waschen Sie zweimal mit 0,2 X SSC für 30 min bei 60 ° C, überschüssige RNases zu entfernen.
5. Waschen Sie zweimal mit 500 µL Puffer Maleic Acid (MAB; Tabelle 1) für 10 Minuten.
6. Inkubieren Sie Proben mit blockiert Lösung (2 % blocking Reagenz in MAB) für 1,5-2 h.
   Hinweis: Das blockierende Reagenz kann schwierig zu lösen sein; sanfte Erwärmung hilft Auflösung.
7. Ersetzen Sie die blockierende Lösung mit Anti-Digoxigenin alkalische Phosphatase konjugiert 500 µL Antikörper bei einem 1:3,000 Verdünnung in blocking-Lösung und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur für ca. 4 h oder bei 4 ° C.

8. in Situ Hybridisierung: Tag3 (Timing: 6 h, Übernachtung)

1. Waschen Sie die Proben mindestens 5 mal 30 min mit 500 µL MAB, überschüssige Antikörper zu entfernen.
   Hinweis: Diese Waschungen sind flexibel und können verlängert werden, um 1-2 h, oder 3-4 Wäschen können für eine Übernachtung zu waschen bei 4 ° C mit minimalen Auswirkungen auf die Wirksamkeit ersetzt werden.
2. Waschen Sie zweimal für 5 min mit alkalischer Phosphatase-Puffer, pH 9,5 (AP-Puffer; ( Tabelle 1).
3. Beginnen Sie die Farbreaktion, indem der letzten Wäsche mit 500 µL des chromogenen Substrates für alkalische Phosphatase (Table of Materials). Decken Sie Probenteller mit Alufolie ab und gehen lassen Sie, die Färbung bei Raumtemperatur für 3 - 5 h oder über Nacht bei 4 ° c gehen Sie Überwachen Sie die Färbung Reaktion in regelmäßigen Abständen durch Anzeigen des Gewebes unter dem sezierenden Mikroskop um overstaining zu vermeiden.
   Hinweis: Wenn die Färbung abgeschlossen ist, ein lila Farbton ist von Auge in der Antisense-sondiert Proben unter dem Mikroskop erkannt, aber das Gewebe darf nicht zu sehr dunkel geworden. Färbung kann geht sehr langsam bei 4 ° C und bis zu 20-24 Uhr.
4. Die Farbreaktion durch Waschen für 5 min in 500 µL MAB stoppen, dann das Gewebe über Nacht in Bouins Lösung zu beheben.
   Achtung: Behandeln Sie die Bouins Lösung in einer Dampfhaube; Es ist eine ätzende Karzinogen.

9. in Situ Hybridisierung: Tag 4 (Timing: 3-3,5 h)

1. Bereiten Sie mindestens 7 mL pro Probe Korb 1 X SSC durch Verdünnung 20 X SSC in DEPC-behandeltem Wasser. Entfernen Sie die Bouins Lösung durch Waschen der Proben 4 bis 6 Mal mit 70 % Ethanol in 1 X SSC bis das Gewebe nicht mehr gelb ist.
2. Bereiten Sie 500 µL pro Probe Korb von 75 %, 50 % und 25 % Ethanol Lösungen in 1 X SSC. Waschen Sie die Proben 5 min in jeder Lösung Verschieben von höchsten ethanolkonzentration auf niedrigsten das Gewebe zu rehydrieren. Waschen zweimal für 5 min jeweils in 1 X SSC.
3. 90 min auf einem Leuchtkasten in einer Dampfhaube Proben in das Bleichmittel-Lösung (Tabelle 1) inkubieren.
   Hinweis: Dieser Schritt erlaubt Pigmentierung in den Proben oder Färbung von Bouins Lösung entfernt werden und erhöht die Sonde Signal für die übersichtliche Visualisierung.
4. Waschen Sie die Proben zweimal mit 500 µL 1 X SSC für 5 Minuten.
5. Die Eingeweide mit minimalen Schäden durch Umdrehen des Probe-Korbes in einen Brunnen einen neuen 24-Well-Platte zu verlagern und Waschen mit 70 % Ethanol durch den Netz-Boden mit einer transferpipette. Aufbewahren Sie bei-20 ° C, bei Bedarf.
6. Um eine Übersicht über die Färbung Muster von mehreren Proben, wie in Abbildung 3, pflegen Sie die Eingeweide in 70 % igem Ethanol in der 24-Well-Platte und Sicht mit jedem Hellfeld Mikroskop. Zu einzelnen Mut unter dem Hellfeld Mikroskop zu untersuchen, wie in Abbildung 4, Abbildung 5gezeigt, und Abbildung 6, montieren Sie die Eingeweide in 100 % Glycerin unter Deckgläsern. Mit einem Spatel aus Kunststoff, um sanft das Gewebe mit minimalen Schäden zu manipulieren.
   Hinweis: Die hohe Viskosität des Glycerins schützt das Gewebe vor Schäden durch Kompression und ermöglicht die sorgfältige Positionierung der Divertikel so, dass das Gewebe optimal bei höheren Vergrößerungen angezeigt werden kann.
7. Aufnahmen auf dem Mikroskop mit Mikroskop bestimmtes Image Capture-Software (Table of Materials) und als TIFF-Bilder zu einem generischen Bildbearbeitungs-Software exportieren. Zur Quantifizierung der relativen Färbung Unterschiede zwischen experimentelle Behandlungen herunterladen Sie eine generische Bildanalyse-Software (Table of Materials). Öffnen Sie das Bild in der Analysesoftware und verwenden Sie die Anweisungen in der Software zur Messung Pixel Intensität der Färbung und Histogramm Grundstücke der Färbung zu berechnen.

Ergebnisse

Die Messung und Einschätzung der Qualität der RNA-Sonden sind kritische vor Beginn der Färbung. In-vitro- Transkription Effizienz hängt in hohem Maße auf die Menge und Qualität der DNA-Vorlage. Wir visualisieren routinemäßig die RNA-Sonden auf einem Formaldehyd-Gel zur Überprüfung der Reinheit und Menge der Sonde durch die Transkription Reaktionen erzeugt. Die Sonden erscheint als helles, diskrete Banden (Abbildung 2). Photometrische Messun...

Diskussion

Dies ist die erste Verwendung einer vollständig-hängen in Situ Hybridisierung (WMISH)-Technik, die Mikrobiota ein Arthropoden Vektor von Krankheitserregern zu studieren. Unser Protokoll wurde von einem zur Entwicklung von Drosophila und Frosch-Embryonen^25,26Untersuchung angepasst. Vollständig-hängen RNA in Situ Hybridisierung wurde routinemäßig verwendet, um gen Transkripte räumlich zu lokalisieren und zeitlich^2...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron	Amazon	03-110/47
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360
Digoxygenin-11-UTP	Roche	1209256910
dNTP	New England Biolabs	N0447S
DNAse I(RNAse-free)	New England Biolabs	M0303S
HiScribe SP6 RNA synthesis kit	New England Biolabs	E2070S
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England Biolabs	E2040S
Water, RNase-free, DEPC-treated	American Bioanalytical	AB02128-00500
EDTA, 0.5M, pH 8.0	American Bioanalytical	AB00502-01000
Formaldehyde, 37%	JT Baker	2106-01
Formamide	American Bioanalytical	AB00600-00500
EGTA	Sigma Aldrich	E-4378
DPBS, 10X	Gibco	14300-075
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379-25ML
Proteinase K	Sigma Aldrich	3115879001
Triethanolamine HCl	Sigma Aldrich	T1502-100G
Acetic anhydride	Sigma Aldrich	320102-100ML
Paraformaldehyde	ThermoScientific/Pierce	28906
SSC, 20X	American Bioanalytical	AB13156-01000
RNA from torula yeast	Sigma Aldrich	R3629-5G
Heparin, sodium salt	Sigma Aldrich	H3393-10KU
Denhardt's Solution, 50X	Sigma Aldrich	D2532-5ML
CHAPS hydrate	Sigma Aldrich	C3023-1G
RNase A	Sigma Aldrich	10109142001
RNase T1	ThermoScientific	EN0541
Maleic acid	Sigma Aldrich	M0375-100G
Blocking reagent	Sigma Aldrich	11096176001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments	Sigma Aldrich	11093274910
Levamisol hydrochloride	Sigma Aldrich	31742-250MG
Chromogenic substrate for alkaline phosphatase	Sigma Aldrich	11442074001
Bouin's solution	Sigma Aldrich	HT10132-1L
Hydrogen peroxide	Mallinkrodt Baker, Inc	2186-01
Single stranded RNA ladder	Ambion -Millenium	AM7151
#11 High-Carbon steel blades	C and A Scientific Premiere	#11-9411
Thermocycler	BioRad, CA	1851148
Spectrophotometer	ThermoScientific	NanoDrop 2000C
Orbital shaker	VWR	DS-500E Digital Orbital shaker
Shaking water bath	BELLCO Glass, Inc	Hot Shaker-7746-12110
Gel  documentation system	BioRad	Gel Doc XR+ Gel documentation system
Bright-field Microscope	Nikon	NikonSM2745T
Bright-field Microscope	Zeiss	AXIO Scope.A1
Dissection microscope	Zeiss	STEMI 2000-C
Light box	VWR	102097-658
PCR purification kit	Qiagen	28104
Image capture software	Zeiss	Zen lite
Image editing software	Adobe	Adobe Photoshop CS4 version 11.0
Image analysis software	National Institutes of Health	ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
Automation compatible instrumentation	Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).	Intavis, Biolane HT1.16v