Optimierung der Capture-Laser Mikrodissektion für die Isolierung der enterischen Ganglien aus menschlichem Gewebe Tiefkühlfrische

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist, hoher Integrität RNA-Proben von enterischen Ganglien isoliert von fixierten, frisch reseziert menschlichen Darmgewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Dieses Protokoll beinhaltet Probenvorbereitung Blitz eingefroren menschlichen Darmgewebe, Kryoschneiden, ethanolische Färbung und Dehydrierung, LCM, und RNA-Extraktion.

Zusammenfassung

Der Zweck dieser Methode ist, hoher Integrität RNA-Proben von enterischen Ganglien gesammelt von fixierten, frisch reseziert menschlichen Darmgewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Wir haben fünf Schritte im Workflow identifiziert, die entscheidend für den Erhalt der RNA-Isolate aus enterischen Ganglien mit ausreichend hoher Qualität und Quantität für RNA-Seq. Zuerst, muss bei der Vorbereitung von Darmgewebe jede Probe alle überschüssige Flüssigkeit durch Löschpapier vor der Abflachung der Darmhaut so weit wie möglich im unteren Bereich des großen Basis Formen entfernt haben. Proben werden dann schnell auf einen Brei aus Trockeneis und 2-Methylbutane eingefroren. Zweitens, wenn das Gewebe zu schneiden, ist es wichtig, Cryomolds zu positionieren, so dass Darmabschnitte das vollständige Flugzeug den Auerbach-Plexus parallel, damit die größte Fläche des enterischen Ganglien pro Folie nachgeben. Dritte, während LCM, Polyethylen Napthalate (PEN)-Membran Folien bieten die größte Geschwindigkeit und Flexibilität der ungleichmäßigen Formen der enterischen Ganglien zu umreißen, wenn Enterische Ganglien zu sammeln. Viertens, bieten für deutliche Visualisierung der enterischen Ganglien in Abschnitten, Ethanol-kompatiblen Farbstoffe wie Cresyl violett, ausgezeichnete Erhaltung der Integrität der RNA relativ wässrigen Farbstoffe. Zu guter Letzt für die Gewinnung von RNA aus aufgenommenen Ganglien beobachteten wir Unterschiede zwischen kommerziellen RNA-Extraktion-Kits, die überlegene RNA-Menge ergab und Qualität, beim DNA-Kontaminationen zu beseitigen. Optimierung dieser Faktoren in das aktuelle Protokoll stark beschleunigt den Workflow und enterischen Ganglien Proben mit außergewöhnlichen RNS-Qualität und Quantität ergibt.

Einleitung

Diese Methode soll qualitativ hochwertige RNA-Proben der enterischen Ganglien aus menschlichen intestinalen Gewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert, um ausreichende RNS-Qualität und Erträge für RNA Sequenzierung (RNA-Seq) bieten und mit frisch reseziert, fixierten, Blitz eingefroren menschlichen Darmgewebe verwendet werden soll.

Funktionelle Magen-Darm- und Darm-Motilität-Störungen betroffen einer von vier Menschen in den Vereinigten Staaten. Das Enterische Nervensystem (ENS), auch bekannt als die zweite Gehirn¹, ist oft in der Mitte dieser Störungen, wie es eine entscheidende Rolle im Darm Homöostase und Motilität spielt. Manipulation von Darm-Motilität wurde in der Regel auf chirurgische Resektion des aganglionären/noncontractile Gewebe, chronische ernährungsumstellung und/oder Medikamente eingeschränkt. Überraschend, bleibt das volle Transkriptom der Erwachsenen ENS sequenziert werden, stark begrenzen unsere Fähigkeit, Moleküle innerhalb der ENS zu identifizieren, die pharmazeutisch ausgerichtet oder in Stammzelltherapien genutzt werden können.

Es gibt relativ wenige Methoden zur Isolierung von RNA aus menschlichen enterischen Ganglien. Der erste Ansatz, Zelle Dissoziation², erfordert hohe Inkubation Temperaturen und langen Inkubationszeiten; sowohl von denen, die zur Förderung der RNA-Abbau und verändern die Transkriptom-^2,-³bekannt sind. Ein alternativer Ansatz, LCM, mehr zuverlässig das Transkriptom bewahrt und schützt die Integrität der RNA. Obwohl mehrere Studien LCM Ganglien von menschlichen Tiefkühlfrische Darmgewebe^4,5,6sammeln verwendet haben, diese Ansätze wurden entweder von Armen RNS-Qualität und Quantität behindert, waren sehr arbeitsintensiv, oder notwendige Änderung der Färbung oder RNA Extraktionstechniken in unseren Händen zu arbeiten. Andere LCM Protokolle entwickelt, die für die Erhaltung der RNA, die in LCM Produkt, die Handbücher zur Verfügung gestellt gefunden wurden, weitere Verbesserungen^7,8, sondern Anpassung war notwendig, angewandt auf die Isolation der enterischen Ganglien^{8, 9}. aus diesen Gründen entwickelten wir eine optimierte Protokoll basierend auf diese Ressourcen, die erhebliche Mengen an hoher Integrität RNA aus menschlichen enterischen Ganglien ergibt, hat einen relativ schnellen Workflow und konsistente Ergebnisse produziert, über eine große Anzahl der Proben.

In dieser Studie stellen wir Ihnen eine Übersicht über optimierte Abläufe, die die Isolation der RNA hoher Integrität von enterischen Ganglien aus resezierten menschlichen Darmgewebe bezogen zu erleichtern. Unsere Methode beinhaltet fünf wichtige Aspekte. Erste, frisch reseziert, unfixierte Darm Humanproben sollte getrimmt werden, um Größe, haben alle überschüssige Feuchtigkeit mit einem Labor-Gewebe entfernt und in einer großen Basis Form vor dem Blitz-einfrieren auf einer Aufschlämmung von Trockeneis und 2-Methylbutane (2 MB) abgeflacht. Zweite, histologische Abschnitte des Darmes sollte bereit sein, die vollständige Flugzeug Auerbach Plexus auf einer Folie zu erhalten, bietet eine große Nutzlast des enterischen Ganglien. Erfolg mit diesem Schritt ist weitgehend abhängig von der Vorbereitungsprozess Gewebe. Drittens erfordert die uneinheitliche Struktur der Ganglien in der ENS die Verwendung von Polyethylen Napthalate (PEN) Membran Folien⁶, die die größte Geschwindigkeit und Präzision bei der LCM anbieten. Vierte, Ethanol-kompatible Farbstoffe, wie z. B. Cresyl violett, sollten zur RNA Integrität zu bewahren, während der Färbung enterischen Ganglien. Dauern Sie, die RNA-Extraktion ist entscheidend für ein erfolgreiches Ergebnis mit RNA-Seq. Wir suchten einen RNA-Extraktion-Ansatz, der produziert hohen Integrität der RNA, RNA Erträge maximiert, wenn beginnend mit einer kleinen Sammlung von enterischen Ganglien, DNA-Verunreinigung beseitigt und behält so viele RNA-Spezies wie möglich.

Zusammengenommen, Optimierung dieser Faktoren in der vorliegenden Studie stark beschleunigt den Workflow und Proben der enterischen Ganglien mit außergewöhnlichen RNA Quantität und Qualität liefert. Ergebnisse wurden weitgehend unter eine ansehnliche Gruppe von Proben, die Konsistenz dieses Ansatzes angibt. Darüber hinaus haben wir diese Ansätze verwendet, um Dutzende von RNA-Proben von enterischen Ganglien erfolgreich zu sequenzieren. Die Strategien, die hier hervorgehoben können auch weitgehend angepasst werden, für die Durchführung von LCM von gewünschten Ganglien oder Kerne des peripheren und zentralen Nervensystems und andere Fälle, in denen die Isolierung der RNA von hoher Qualität.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Protokolle wurden von der Vanderbilt Universität institutionelle Review Board (IRB) genehmigt.

1. Vorbereitung vor der Ankunft der Gewebe

1. Richtige IRB Genehmigung einholen und mit menschliche Organ Spende Agenturen frisch reseziert, unfixierten Darmgewebe von Spendern zu erhalten, die alle Forschung für das Studium erforderlichen Kriterien zu koordinieren.
   Hinweis: Dieses Protokoll kann für Mäuse und andere Nager-Modelle angepasst werden.
   1. Sofort nach Resektion eines jeden Darm Segments, spülen Sie gründlich das Lumen mit gekühlten PBS oder Gewebe-Speichermedium luminalen Restmaterialien oder Kot zu entfernen.
   2. Tauchen Sie nach der Spülung und Verwerfen von Abfall in eine geeignete Biohazard Behälter das Gewebe in ausreichendem Umfang Gewebe-Speichermedium (z. B. 3-bis 5-Mal das Volumen der Darmgewebe) und speichern in individuell beschriften, wasserdicht Kunststoff Container, eingetaucht in Eis oder gekühlt bis zur Verwendung).
   3. Bearbeiten Sie das Gewebe innerhalb von 18-26 Stunden ab dem Zeitpunkt der Sammlung zu erheblichen RNA-Abbau zu verhindern.
      Hinweis: Abhängig von der Sauberkeit des Darm-Segments und Lagerung, können unsere vorgeschlagenen Frist verlängern möglich.
2. Alle benötigte Materialien für menschliches Gewebe Sammlung im voraus vorzubereiten, wie in diesem Protokoll angegeben (siehe die Tabelle der Materialien für detailliertere Produktinformationen). Stellen Sie sicher, dass alle erforderlichen persönlichen Schutzausrüstungen zu allen Zeiten getragen wird.
3. Bereiten Sie Trockeneis Eimer zusammen mit einer Trockeneis-Gülle, wie in Abbildung 1dargestellt.
   1. Zerquetschen Sie genug Trockeneis um 4 standard kreisförmige Eiswürfelbehälter und eine rechteckige Eisbehälter füllen. Der standard Eimer sollte man klein (11 x 21 cm) Labor Gewebe platziert an der Oberfläche des Trockeneises. Verwenden Sie nach Möglichkeit neue, ungeöffnete Kisten mit Labor Gewebe.
   2. Machen Sie eine Trockeneis-Gülle durch powderizing 2 L von Trockeneis in einen sauberen rechteckige Eisbehälter.
   3. Fügen Sie vorgekühlt 2 MB bis zur Oberfläche des Trockeneises. Leicht zu mischen und Glätten der Gülle mit einer Pipette Tip Box Abdeckung in Form Oberfläche der Gülle in einem Kanal umgeben von größeren Stücken von Trockeneis entlang der Seiten des rechteckigen Eimers.
   4. Legen Sie mehrere dünne Blöcke Trockeneis an den Rändern der Eiskübel mehr schnelles Gefrieren zu fördern. Es sollte Platz für ≥4 Basis Formen passen locker in Trockeneis Gülle Eimer zu einem bestimmten Zeitpunkt vorhanden sein.
      1. Optional gefüllt Stack den Eiskübel innerhalb einer anderen rechteckigen Eiskübel ¼ mit Trockeneis. Diese Positionierung hilft, die Trockeneis-Gülle besser zu isolieren und verhindert die Notwendigkeit für häufige Anpassungen von Trockeneis und 2 MB während des Verfahrens.
   5. Positionieren Sie die Trockeneis Eimer in einer Montagelinie in der folgenden Reihenfolge: (1) Trockeneis Gülle Eimer, 2) Labor Gewebe-Dry Eiskübel, 3 & 4) normal trocken Eis Eimer, 5) rechteckige Trockeneis Eimer (Abb. 1A).

2. Vorbereitung des menschlichen Darmgewebe Blitz eingefroren

Hinweis: Der gesamte Vorgang dauert zwischen 45-80 min pro Darm Segment, je nach Qualität der Darmgewebe. Wir empfehlen auch Qualitätskontrolle Probenahmen zur Beurteilung der RNS-Qualität und Histologie vor dem Fortfahren mit LCM.

1. Einem großen Tablett mit nassem Eis füllen und chirurgische Schneidebretter auf Trockeneis zu platzieren.
2. In diesem Setup chill einen 500-mL und 100 mL Becher zum Speichern der Gewebe und gestutzten Segmente in Cold Storage-Lösung. Pre-chill Basis Formen auf die Schneidebretter, so dass sie bereit sind, Gewebe zu erhalten.
3. Gießen Sie nach Erhalt frischer Darmgewebe den Medien, in denen das Gewebe transportiert wird, und in die vorgekühlt Becher zu behalten. Lassen Sie etwas Platz in diesen Becher für die Zwischenlagerung von Darmgewebe und gestutzten Segmente, die in den nachfolgenden Schritten zubereitet werden.
4. Schneiden Sie das Darm Segment auf eine Länge von ca. 20 cm, bietet reichlich Gewebe (40-60 cm²) RNA für downstream-Anwendungen zu generieren und Qualitätskontrolle Proben. Je nach Gewebe Integrität ist die RNA Isolierung für downstream-Processing mit einer viel kleineren Länge (z.B. 5 cm des Darmes) erreichen durchführbar.
5. Trim entfernt Fett und Bindegewebe aus dem Darm mit einer chirurgischen Schere. Restwert adipösen entlang der Darm Darmhaut beeinträchtigt die Fähigkeit, Gewebe in den nachfolgenden Schritten vollständig glätten. Schneiden Sie sorgfältig das Gewebe, um zu vermeiden, nicking der Darmhaut während der Entfernung von Fett und Bindegewebe, die strukturell beschädigen den Auerbach-Plexus oder machen das äußere des Gewebes ungleichmäßig für Schneiden glätten können.
6. Machen Sie einen längs-schnitt über die gesamte Länge der intestinalen Probe, vorzugsweise auf dem Gelände des mesenterialen Anlage.
7. Sezieren Sie entfernt und verwerfen Sie die Tenia coli aus dem Dickdarm zu, so dass es leichter, flacht nach von Verspannungen befreit.
8. Spreizen der Darm-Schleimhaut-Seite nach unten auf ein gekühltes Schneidebrett und 1,25 cm breiten Streifen aus die volle Länge des Gewebes.
   Hinweis: Darmgewebe erweitert oft nach dem Stutzen, damit dieser Größe entsprechend angepasst werden sollte.
9. Temporär zu speichern die Streifen in gekühltem Gewebe-Storage-Lösung.
   Hinweis: Wir verwenden Belzer UW-Cold Storage-Lösung, denn es eine lange Haltbarkeit hat, relativ kostengünstig ist und kann bei Raumtemperatur bis benötigt gespeichert werden.
10. Entfernen Sie einen Gewebe Streifen aus der Kühllagerung Projektmappe und schneiden Sie es in Segmente ~1.5-2 cm lang.
11. Beflecken Sie schnell die intestinale Segmente auf einen Stapel von Labor-Tücher, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und verhindern die Bildung von Eiskristallen entlang der Darm Darmhaut beim Blitz-gefrieren. Wenn Gewebe nicht ausreichend getrocknet ist, wird es schwierig, qualitativ hochwertige Teile aus den Auerbach-Plexus zu erhalten sein.
12. Legen Sie die verlaufene Darm Stücke Schleimhaut-Seite bis auf eine vorgekühlt, groß, Einweg Kunststoff Basis-Formenbau (37 x 24 x 5 mm).
13. Glätten Sie sorgfältig jedes Segment indem leicht dehnen das Gewebe über der Oberfläche der Basis Form und mit gebogenen Pinzette sanft nach unten drücken und vertreiben keine Luftblasen, die unter die Darmhaut aufgefangen werden können. Beachten Sie, dass das Gewebe während der Abflachung erweitert. Bei Bedarf trimmen Sie die Segmente und schneiden Sie die restlichen Proben in einer kleineren Größe.
    Hinweis: Wenn das Gewebe überdehnt ist, wird dies den Auerbach-Plexus verzerren. Nachdem alle Luftblasen entfernt werden, bewerten Sie die Dicke der Probe vor dem Einfrieren. Wenn nötig, die Ränder der Probe nach innen drücken, bis die Darm Probe seiner originale Dicke Ansätze.
14. Legen Sie die geladene Basis Form auf die Oberfläche des Trockeneises, 2 MB Gülle. Das Gewebe sollte innerhalb 30-60 s, je nach Größe und Dicke des Segments Darm komplett einfrieren.
15. Trocknen Sie den Boden der base Form, passives 2 MB zu entfernen, durch schnell reiben die Basis Form auf das Labor Gewebe bereits in der zweiten Eimer mit Trockeneis gekühlt.
16. Übertragen Sie die getrocknete Probe auf die dritte Wanne mit Trockeneis und unter der Oberfläche des Trockeneises zu begraben Sie, bis es gewickelt werden kann.
17. Schnell beobachten der Unterseite der Basis Form vor dem Einwickeln, um die Qualität der Probenvorbereitung zu untersuchen. Notieren Sie sich alle Proben, die nicht erscheinen flach oder haben große Luftblasen, da diese für Kryoschneiden und LCM vermieden werden sollte.
18. Wickeln Sie die Probe in Pre gekennzeichneten Aluminiumfolie, die auf Trockeneis in einen Eimer gelegt wird, so dass Umhüllung des Gewebes auftritt, während vollständig gefroren gehalten.
19. Wickeln Sie die Probe mit einer Schicht aus Plastikfolie, um Gewebe Dehydrierung während der Lagerung bei-80 ° c zu minimieren
20. Speichern Sie Proben in die rechteckige Eimer, bis sie bereit sind, in der Tiefkühltruhe verschoben werden.
21. Pre-label und Pre-chill Gefrierschrank Boxen bei-80 ° C für die unmittelbare Lagerung der Proben nach der Entnahme.
22. Nehmen Sie einen kleinen Teil des Gewebes aus jeder Darm Segment zur Beurteilung der Integrität der RNA vor Durchführung von LCM.
    1. Pre-Label ein 2-mL-RNase-freies Rohr für jedes Segment mit ≥500 µL Lyse Puffer gefüllt. Wir empfehlen die Verwendung von RNA-Extraktion Kit "D", in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
    2. Eine kleine (2 x 2 mm) Stück des Darms in einem standard Gewebe Mikro-Homogenisator (20-40 s, bis keine Klumpen Gewebe bleiben) zu homogenisieren. Dann sofort Einfrieren der RNS lysate auf Trockeneis und Store bei-80 ° C bis Sie fortfahren mit RNA-Extraktion.
    3. Optional einige Abschnitte in Gewebe Einfrieren Medium (TFM) als Back-Up einbetten. Bereiten Sie Gewebeschnitte in genau der gleichen Weise in diesem Abschnitt beschriebenen vor, aber Tauchen Sie Proben in TFM innerhalb der Basis Form vor dem Blitz-einfrieren.

(3) Kryoschneiden

1. Bereiten Sie vor Kryoschneiden alle benötigten Materialien zum Beizen und Austrocknung und übertragen Sie die gewünschte Gewebeproben von-80 ° C Gefrierschrank in einen Eimer mit Trockeneis.
2. Vorbereiten der Kryostat für die Verwendung durch Einstellung auf die optimale Temperatur (-18 bis-22 ° C) und Abwischen der Oberflächen mit 100 % Ethanol und Behandlung der Klinge und Pinsel Tablett mit RNase Dekontaminationslösung.
3. Um die Probe an das Futter am besten zu halten, verwenden Sie die folgende Vorgehensweise.
   1. Legen Sie Zangen in Trockeneis für mindestens 30 s vor dem Auspacken der intestinalen Probe und stellen Sie es an der Oberfläche des Trockeneis Darmhaut-Side-Up.
   2. Gießen Sie einen 3-5 mm-Hügel aus Gewebe Einfrieren Medium (TFM) auf einem großen Kryostat Probenhalter und sofort übertragen Sie die intestinale Probe Darmhaut Seite nach oben auf die TFM.
   3. Übertragen Sie schnell Probenhalter Trockeneis und Deckel mit pulverisierte Trockeneis nach Abzug der TFM die Probe für 2-5 s bei Raumtemperatur einhalten. Sicherstellen Sie, dass die TFM unterhalb der Ebene der Auerbach-Plexus bleibt.
      Hinweis: Im Idealfall die äußere Oberfläche der Darmschleimhaut vollständig die TFM haften an bevor die TFM beginnt zu frieren ohne Auftauen der Probe.
4. Probenhalter in den Kryostaten Objektkopf montieren und Ausrichten der Probekörpers mit der Kryostat Klinge, so dass das Flugzeug den Auerbach-Plexus parallel zu dem Schneidmesser.
5. Legen Sie die Stationspunkte Dicke auf der Kryostat bis 8 µm. Die perfekt Ausrichten der Probekörpers soll die größte mögliche Fläche von Auerbach Plexus auf jeder Folie zu erhalten. Diese Dicke empfiehlt sich im Allgemeinen für Mensch und Nagetier Gewebe, sondern kann eingestellt werden, je nach Bedarf.
6. Schnitt durch die Darmhaut und längs-Muskel bis zum Erreichen der Auerbach-Plexus.
   1. Um den Auerbach-Plexus zu finden, montieren Sie einen Probe-Abschnitt auf einer Folie zu und Flecken Sie Abschnitt mit einer wässrigen Farbstoff, z. B. 1 % Cresyl violett oder Toluidin blau usw..
   2. Lesen Sie den Abschnitt unter einem Lichtmikroskop bei 40-2000 X Vergrößerung, die Verbindung zwischen der Längs- und kreisförmige Muskelschichten zu identifizieren. Mikroskop-Parameter sind in der Tabelle der Materialienzur Verfügung gestellt. Zu Beginn der Schnitt wird die Darmhaut durch die Anwesenheit von Bindegewebe gekennzeichnet. Einige verbleibende mesenterialen Fett kann auch entlang der Darmhaut vorhanden sein. Dann beginnt ein Blatt von der äußeren longitudinale Muskelschicht. Sobald die Grenze zwischen der Längs- und kreisförmige Muskelschichten erreicht ist, wird ein Teil des enterischen Ganglien beobachtet werden.
      Hinweis: In den nächsten mehrere Abschnitten den Auerbach-Plexus sehr offensichtlich, mit großen Schwaden von Ganglien anwesend innerhalb eines einzelnen Abschnitts (Abbildung 2C) werden. Wenn das Gewebe zu Beginn der Schnitt nicht ganz flach ist, wird nur ein Teil der Ganglien vorhanden in den einzelnen Abschnitten zu einem bestimmten Zeitpunkt sein. Manchmal müssen die intestinale Probe eine von Natur aus ungleichmäßigen Auerbach-Plexus, trotz des Gewebes erscheinen vollkommen flach. Dies gilt insbesondere für Zwölffingerdarm Proben. Erfahrungsgemäß können diese Proben mit LCM, Verarbeitung wesentlich länger nehmen aber ausreichend RNA kann in einem einzigen Tag Sitzung gesammelt werden. Die genaue Lage von den Auerbach-Plexus variiert erheblich zwischen Proben, basierend auf das Gewebe und deren Vorbereitung vor dem Einfrieren.
7. Beginnen Sie, sammeln Schnittserien für LCM, mit optimalen Sammlungen bietet die größte Anzahl von Neuronen und Glia pro Folie. Je nach Oberfläche der Probe können mehrere Abschnitte auf einer einzelnen Folie Stift-Membran kombiniert werden.
8. Montieren Sie die Abschnitte auf Stift Membran Folien, kurz in den Kryostaten für 5-10 s gekühlt. Bei der Montage sollte das Gewebe nur leicht schmelzen maximal RNA Integrität bewahren.

(4) Färbung

Hinweis: Eine Übersicht über die Färbung Prozess, siehe Tabelle 1. Alle Lösungen sind im standard 50 mL konische Röhrchen bereit. Behandlung von der Außenseite der Rohre mit RNase Dekontaminationslösung erscheint nicht zur Ergebnisverbesserung (Daten nicht gezeigt).

1. Vorbereiten einer gesättigten Lösung von 4 % Cresyl violett in 95 % igem Ethanol mindestens einen Tag im voraus und vollständig neu Cresyl violett vor dem Laden der Spritze auszusetzen.
   Hinweis: Die Konzentration von Ethanol müssen für effektive Färbung, gesenkt werden wie im Diskussion Abschnitt beschrieben. Wir haben nicht geprüft, ob die Integrität der RNA mit 50 % oder 75 % Ethanol während der Färbung deutlich reduziert werden. Cresyl violett ist lichtempfindlich und sollte daher vor Licht geschützt werden.
2. Nach der Montage Teile der Auerbach Plexus auf der Folie, Tauchen sofort die Folie in einem konischen Fläschchen von 95 % Ethanol (vorher bei-20 ° C gekühlt) für 30 s.
   1. Wenn die Abschnitte nicht voll und ganz auf die Folie im vorherigen Schritt befolgten, leicht warm unten auf der Folie mit einer behandschuhten Hand (ein Labor abwischen sollte platziert zwischen der Folie und Handschuh), für die vollständige Einhaltung vor dem Eintauchen in 95 % igem Ethanol. Diese Lösung kann für mindestens 3-6 Folien wiederverwendet werden, ohne Verringerung der RNA Integrität.
3. Legen Sie die Folie nach oben auf ein Labor abwischen, platziert auf einem vorbehandelt, RNase-freie Container⁸.
4. Pre-fill eine 3-mL-Spritze mit 4 % Cresyl violett und befestigen Sie einen 0,2 µm Spritze Filter.
   Hinweis: Es wird empfohlen, Cellulose-Acetat-Filter.
5. 6-10 Tropfen Fleck direkt auf das Gewebe Abschnitte⁸ und inkubieren Sie für 10-30 s, oder bis Sie ausreichend Farbstoff wird beibehalten, wenn de-gebeizt. Während der Färbung, sanft drehen des Folie Containers per hand, um sicherzustellen, dass die Gewebeschnitte mit beize gleichmäßig überzogen sind.
6. Gießen Sie den Fleck und de-Fleck sofort die Folie in einer Durchstechflasche von 75 % Ethanol. Immer wieder Tauchen Sie die Folie bis die überschüssige Farbe vor allem aus der Probe sickerte hat. Dies kann zwischen 10-20 s dauern.
7. Schließen Sie de-Färbung durch immer wieder Eintauchen der Probe in ein Fläschchen mit 95 % igem Ethanol für 10 S. Submerge Probe wiederholt, bis alle überschüssigen Fleck entfernt wurde.
   1. Nach Bedarf zu optimieren, die Färbung der Ganglien, ändern Sie die destaining Dauer. Wenn zu viel Fleck entfernt wird, die Probe wird auch transparent und es möglicherweise schwierig zu visualisieren
      Hinweis: Diese Färbung Protokoll wurde optimiert, basierend auf mehreren Veröffentlichungen^5,8,10,11 die Änderung erforderlich, bevor zufriedenstellende Ergebnisse erzielt wurden. Daher sollte die Konzentration von Ethanol in den Farbstoff und während das destaining Verfahren geändert werden, wenn nötig, um ein optimales Ergebnis zu erhalten.

(5) Dehydratation

1. Sofort Tauchen Sie die Folie in 100 % igem Ethanol 2-3 Mal, für eine Gesamtmenge von 10-20 s.
2. Tauchen Sie die Folie in wasserfreien 100 % Ethanol mindestens 30 s. Wie wasserfreiem Ethanol sehr hygroskopisch ist, Hinzufügen der Durchstechflasche mit 100 % igem Ethanol vor Beginn des Verfahrens, absorbiert Wasser entfernen und somit vollständig Austrocknen der Probe⁵Molekularsiebe (8 bis 12 Maschen).
3. Immer wieder Tauchen Sie die Folie in Xylol für 15-20 s. Dieser Schritt entfernt vollständig die Schicht von Ethanol auf der Folie. Die Rohre der Xylol, um überschüssige Ethanol und Wasser-Moleküle⁵vollständig zu adsorbieren fügen Sie Molekularsiebe vor der Zeit hinzu.
   Achtung: Xylen gelten als reizend auf die Augen und der oberen Atemwege und sollte in einem chemischen Abzug verwendet werden.
4. Tauchen Sie die Folie in Xylol (mit Molekularsieben, 8-12 Maschen) für mindestens 10 Minuten.
   Hinweis: Eine kurze Pause kann nach diesem Schritt genommen werden, wenn nötig. Proben können für 4-5 Stunden ohne nachteilige Auswirkungen zu beflecken, LCM oder RNA Ertrag/Integrität in Xylol gelassen werden.
5. Bereiten Sie optional, individuell zu diesem Zeitpunkt mehrere zusätzliche Folien. Wenn eine zweite Runde der Folien vorbereiten nach Abschluss der LCM auf allen vorbereiteten Folien, kann das Gewebe in der Kryostat müssen nachgearbeitet werden, durch Austrocknung der Gewebeoberfläche. Bis zu vier Abschnitte müssen verworfen werden, bevor nutzbare Abschnitte gesammelt werden können.

(6) Laser Capture Microdissection (LCM)

1. Entfernen Sie die Folie von Xylol und trocknen Sie es in einem chemischen Abzug für mindestens 1 min. einfügen eine Patrone von LCM Caps in der LCM Mikroskoptisch. Laden Sie die Folie auf die Bühne und erwerben ein Übersichtsbild der Folie.
2. Geben Sie den gewünschten Standort für LCM und laden Sie eine Kappe auf der Folie.
3. Richten Sie den Infrarot (IR) Laser und passen Sie ihre Kraft und Dauer um 20-30 µm Durchmesser erfassen vor Ort machen.
4. Suchen Sie die ultravioletten (UV) Laser und legen Sie eine geeignete Schnittgeschwindigkeit und Intensität.
5. Skizzieren Sie die gewünschten Ganglien zu erhebenden mit LCM Software, achten Sie darauf, innerhalb der Grenzen des Bereichs Sammlerstücke auf der Kappe (dargestellt in der Dia-Übersicht über das Software-Programm als ein grüner Kreis) bleiben.
6. Passen Sie in jedem der Spuren die IR-Spots so, dass es mindestens eine IR spot jeder 100-500 µm.
7. Drücken Sie IR/UV-Schnitt mit der Sammlung von allen markierten Ganglien vorzugehen.
8. Nach Abschluss Sammlungen sind die Kappe an einen neuen Speicherort verschieben und wiederholen Sie die Einziehung von Forderungen oder prüfen Sie LCM GAP an der QC-Station zu, wenn die Kappe ausreichend gefüllt ist, mit Ganglien (oder bis die empfohlenen Frist von 60-80 Minuten erreicht ist).
9. Wenn Schmutz auf die Kappe vorhanden sind, wischen Sie es mit einem feinen Spitzen Pinsel, der mit RNase Dekontaminationslösung vorbehandelt, mit Nuklease-freies Wasser gespült, und wurde vollständig getrocknet.
10. Sorgfältig prüfen die Kappe mit dem Auge oder mit Vergrößerung unter dem Hellfeld-Mikroskop um alle Ablagerungen zu gewährleisten wurde entfernt. Wenn der Schmutz durch Einsatz von vorbehandelten Pinsel entfernt werden kann, verwenden Sie eine feine PIPETTENSPITZE (RNase-freie) entfernt den Schmutz kratzen.
11. Sichern Sie die Kappe auf eine 0,5 mL Microfuge Rohr gefüllt mit 230 µL RNA Lysis Buffer (Puffer RLT von RNA-Extraktion Kit "B", mit β-Mercaptoethanol hinzugefügt in einer Konzentration von 10 µL/mL).
12. Invertieren Sie der Kappe, kurz Wirbel und bei Zimmertemperatur 30 min inkubieren.
13. Zentrifugieren Sie bei ≥ 5.000 x g für 5 min und übertragen Sie dann die Microfuge trocken Ice tube.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. RNA Lysates können bei-80 ° C ohne einen wesentlichen Einfluss auf RNA-Abbau für mindestens 1 Woche gespeichert werden. RNA Isolierung am selben Tag erfolgt, dann kühlen Sie die Proben auf Eis, bis sie bereit sind für die Extraktion.
14. Führen Sie alle weiteren Sammlungen innerhalb der empfohlenen maximalen Frist von 80-90 min nach dem Entfernen der Folie von Xylol. Da die trockene Abschnitte Luftfeuchtigkeit ausgesetzt sind, können allmählich RNases reaktiviert werden. Einschränkung des Zeitraums der kann solche Effekte minimieren und maximal die Integrität der RNA.

(7) RNA-Isolierung

1. RNA-Extraktion einen RNase-freie Arbeitsplatz vorbereiten.
2. Bereiten Sie alle Rohre und Reagenzien gemäß dem Handbuch für die RNA-Extraktion-Kit.
   Hinweis: Zwar gibt es viele Kits für RNA Isolierung nach LCM, hatten wir viel Erfolg mit dem RNA-Extraktion Kit "B", in der Materialliste aufgeführt. Siehe Abbildung 5 für einen Side-by-Side-Vergleich der RNA-Extraktion-Reagenzien.
3. -80 ° C Gefrierschrank Proben entnehmen und schnell Auftauen im Wasserbad 37 ° C.
4. Vortex aufgetaut sofort Proben für 2-3 s die Guanidinium-Thiocyanat-Salze gleichmäßig zu verteilen.
5. Verbinden Sie jede Probe mit ein gleiches Volumen von 70 % Ethanol. Bündeln Sie 2 oder mehr Lysates zusammen, falls erforderlich, um eine ausreichende RNA-Konzentration zu erreichen.
6. Gehen Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers in der Bedienungsanleitung für die RNA-Extraktion mit dem Protokoll optimiert für Microdissected Proben.
7. Eluieren Sie RNA im letzten Schritt in die empfohlene Mindestmenge von Nuklease-freies Wasser (14 µL).
8. Nach RNA Isolierung bereits beschriftet aliquoten 1-2 µL RNA von jeder Probe in ein neues RNase-freies Rohr für Qualität Bewertung/Qualitätskontrolle mit einem Mikrofluidik-Gerät, die geringe Mengen an RNA, z. B. einem Bioanalyzer visualisieren kann. Aliquoten eine zusätzliche 1 µL in ein separates Rohr für die Quantifizierung mit einem hochempfindlichen RNA Quantifizierung Kit.
   1. Diese Schritte nach Bedarf anpassen, um eine ausreichende Menge an RNA für nachgelagerte Analyse zu erhalten, (zB., pool eine größere Anzahl von LCM Kappen vor RNA-Extraktion).
9. Shop-RNA bei-80 ° C bis genügend Proben für nachgelagerte Analyse.

Ergebnisse

Wir haben einige Verbesserungen an vorhandenen Protokolle, mit denen die relativ schnelle Erfassung der enterischen Ganglien aus menschlichen Darm Proben mit LCM, Erfüllung der Standards für RNA-Seq. Erstens haben wir optimiert das schnelle Einfrieren von Darmgewebe Segmente in großen Basis Formen an der Oberfläche der Gülle von Trockeneis in 2 MB (Abbildung 1B) platziert. Der beste Erfolg bei Kryoschneiden und anschließende LCM wurde d...

Diskussion

Dieses Verfahren ermöglicht die effiziente Sammlung von zahlreichen enterischen Ganglien als Quelle abzuleiten RNA für RNA-Seq. Hier haben wir die Prozesse gemäß bestehender Protokolle gleichzeitig maximal RNA Integrität beschleunigt. Da alle Schritte in diesem Verfahren voneinander abhängig sind, ist es wichtig, dass alle Probleme aus dem Beginn der Studie beseitigt werden und dass alle Proben so ähnlich zueinander wie möglich, bereit sind, zuverlässige RNA-FF zu erhalten

Von Beginn ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral-buffered formalin	Sigma	HT501128-4L
2-Methylbutane	Fisher	O3551-4
3-mL syringe	BD	309628
50-mL conical tubes, polypropylene	Corning	05-526B
Base molds 37x24x5mm, disposable	Electron Microscopy Sciences	5025511
Belzer UW  Cold Storage Solution	Bridge to Life	N.A.
CapSure Macro LCM caps	Arcturus, ThermoFisher	LCM0211
Cling Wrap, Press’n Seal	Glad	N.A.
Cresyl Violet Acetate	Acros Organics	AC405760025
Cutting Board	Electron Microscopy Sciences	63308
Ethanol, 190-proof	Pharmco-AAPER	111000190
Ethanol, 200-proof	Pharmco-AAPER	111000200
Glass Microscope slides	Fisher	12-550-343
Gloves, extended cuff	Microflex	19010144
Gowns, surgical-disposable	Kimberly-Clark	19-088-2116
Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan)	Nalgene	1335920B
Kimwipes (large)	Kimberly-Clark	34120
Kimwipes (small)	Kimberly-Clark	34133
Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT)	ThermoFisher	N.A.
Leica Cryostat Chuck, large,  40 mm	Southeast Pathology Instrument Service	N.A.
Light Microscope	Olympus	CX43
Microscope objective (20X)	Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17	N.A.
Microscope objective (10X)	Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-	N.A.
Molecular Sieves	Acros Organics	AC197255000
Nuclease-free water	Ambion	AM9937
PicoPure RNA extraction kit	Applied Biosystems	12204-01
Pellet Pestle	Kimble Kontes	4621973
PEN membrane LCM slides	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
RNase-free tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12400
RNaseZAP	Sigma	Sigma-R2020
RNA Extraction Kit "A" (PicoPure)	Applied Biosystems	12204-01
RNA Extraction Kit "B" (RNeasy  Micro kit)	Qiagen	74004
RNA Extraction Method "C" (TRIzol)	Invitrogen	15596-026
RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit)	Qiagen	74134
Splash Shield, disposable faceshield	Fisher	17-310
Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp"	Fine Science Tools	14002-14
Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm)	Nalgene	190-2520
Tissue Freezing Medium	General Data Healthcare	TFM-5
Xylenes	Fisher	X3P1GAL