Protokolle für die Prüfung der Toxizität von neuartigen Insektizide Chemikalien, Mücken

Zusammenfassung

Protokolle sind für die Bewertung der Toxizität von Chemikalien zu unreif und Erwachsene Mücken für Entwicklung als neue Klassen von Larviziden, Adulticides und Endectocides beschrieben. Die Protokolle ermöglichen Hochdurchsatz-Prüfung von mehreren Chemikalien bei Einzelpunkt-Dosis und anschließende Auswertung über Dosis-Antwort-Assay Toxizität auf Kontakt zu bestimmen oder Verschlucken.

Zusammenfassung

Neue Klassen von Insektiziden mit neuartigen Wirkmechanismen sind erforderlich, um Insektizide resistenten Populationen von Moskitos zu steuern, die Krankheiten wie Zika, Dengue-Fieber und Malaria übertragen. Assays für Rapid, werden Hochdurchsatz-Analysen der unformulated Roman Chemikalien gegen Moskitolarven und Erwachsene präsentiert. Wir beschreiben Protokolle für Punkt-Einzeldosis und Dosis-Antwort-Assays auszuwertende die Toxizität von niedermolekularer Chemikalien dem Aedes Aegypti Vektor von Zika, Dengue-Fieber und Gelbfieber, Malaria-Vektor, Anopheles Gambiae und der nördlichen Haus Mücke, Culex Quinquefasciatus auf Kontakt und durch Verschlucken. Als Beispiel haben wir die Toxizität von Amitriptylin, ein kleines Molekül Antagonist von G-Protein-gekoppelten-Rezeptoren, über Larven, Erwachsene aktuell und Erwachsenen Blut-Fütterung-Test ausgewertet. Die Protokolle stellen einen Ausgangspunkt um potenzielle Insektizid zu untersuchen. Ergebnisse werden im Rahmen von zusätzlichen Experimenten Produktanwendungen und Mechanismen für die Lieferung zu erkunden diskutiert.

Einleitung

Mücken übertragen die Erreger von Infektionskrankheiten, die menschliche Gesundheit weltweit auswirken¹. Die drei wichtigsten Moskito Gattungen die menschliche Gesundheit sind Aedes, Culexund Anopheles . Arten der Aedes -Mücken Vektor Arboviren, die Zika, Dengue-Fieber, Gelbfieber und Chikungunya-Fieber verursachen. Anopheles -Arten Vektor Malaria-Parasiten und Culex -Arten, West-Nil-Virus und filarial Nematoden²übertragen. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) hat die Beseitigung von zehn vernachlässigten tropischen Krankheiten (NTD) von 2020³ gefordert und Moskito-Kontrolle als die praktikabelste Strategie identifiziert. Insektizide sind mächtige Werkzeuge, um Mücken zu kontrollieren und reduzieren Krankheit Getriebe^4,5. Die Entstehung von Insektizid-resistente Moskito-Populationen droht aber die kontinuierliche Kontrolle der viele Krankheiten^6,7,8. Die innovativen Vector Control Consortium (IVCC) startete den ersten dedizierte Versuch, Ersatz Insektizide für Mosquito Control⁹entwickeln. Neue Insektizide mit neuartigen Wirkmechanismen (MoA) sind zu treffen, die Ziele und erreichen Seuchenbekämpfung erforderlich. Die Entdeckung und Entwicklung neuer Insektizid-Klassen mit Roman MoAs erfordern Gesamtorganismus Assays für schnelle, Hochdurchsatz-Analyse von Chemikalien und im Vergleich zu Industrie-Standards-¹⁰.

Mehrere Tests stehen die Schmutzabweisung und Toxizität von Insektiziden, Larven und Erwachsene Mücken zu bewerten, und einige eignen sich für die Bewertung von neuartigen formulierten oder unformulated Chemikalien. Die WHO Protokoll¹¹ ist ein Kontakt Assay verwendet, um Produkte gegen vierten Instar Larven zu testen. Veröffentlichte Studien beschreiben auch eine Vielzahl von Larven Assays verwendet, um die Toxizität von niedermolekularer Chemikalien für Larven von Aedes Aegypti, Anopheles Gambiae und Culex Quinquefasciatus^10,12, testen ^13,14,15,16. Die Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Flasche Bioassay dient zur Insektizid Widerstand im Feld gefangen Populationen von Erwachsenen Mücken über Auswertung von letale Konzentration (LC) und tödliche Zeit (LT) im Vergleich zu einem diagnostischen Standard Bewertung Dosis von einer kommerziellen Insektizid-¹⁷. Die WHO-Empfindlichkeitstest bietet einen anderen Ansatz um Insektizid Widerstand in erwachsene Mücken zu bewerten, wobei Mücken Insektizid imprägnierten Papier innen Glasfläschchen für 1 h ausgesetzt sind und Mortalität ist bei 24 h¹⁸bewertet. Anderen Assays sprühen Formulierungen in versiegelten Käfige und Rekord Moskito Zuschlag und Tod in der gewünschten Zeitpunkten¹⁹. Topische Anwendung auf der Moskito-Thorax wurde zur Potenz der verschiedenen Pestiziden²⁰zu bewerten. Die Liverpool Insekt Testing Einrichtung (LITE)²¹ beschäftigt Standard Operating Procedures, die Bioaktivität der Chemikalien auf erwachsene Mücken zu bewerten. Der LITE Erwachsenen aktuelle Test gilt ein kleines Volumen des Testprodukts für Thorax erwachsene Mücken mit Sterblichkeit erzielte bei 48 h. Der Test ermöglicht Quantifizierung der Dosis pro einzelnen Moskito²¹erhalten. Die LITE tarsal Assay wertet die Toxizität von Testprodukt erwachsene Mücken ruht auf einer chemisch behandelten Oberfläche und wird verwendet, um Chemikalien mit Entwicklungspotenzial als indoor residual Sprays (IRS) zu identifizieren oder die Verwendung in Insektizid behandelt Moskitonetze (ITN) Anopheles -Mücken zu steuern.

Die WHO und CDC-Assays haben Einschränkungen für die Prüfung von neuartiger, unformulated Chemikalien, und das Ziel der CDC Flasche Bioassay ist Bewertung der Empfindlichkeit über kurze Assay Zeiträume (zwei Stunden) anstatt Toxizität^22,23. Darüber hinaus Assays für die Bewertung der Toxizität von Chemikalien in der Blutmahlzeit geliefert und Potenzial für die Entwicklung von systemischen wirkenden Produkten (z.B. Endectocides) fehlen. Hier beschreiben wir Assays für die Prüfung der Mosquitocidal Aktivität des neuartigen Chemikalien, die in Wasser oder eine der verschiedenen organischen Lösungsmitteln gegen die Larven und Erwachsene von Aedes, Anopheles und Culexlöslich sind. Erstens zeigen wir einen Larvenstadium Assay zuvor durch unsere Gruppe^10,12,13,16beschrieben, durchgeführt und hier als (1) ein Bildschirm, um schnell mehrere Chemikalien an einem einzigen Punkt bewerten Dosis, (2) eine Dosis-Antwort-Assay die letale Konzentration (z. B. LC_50, LC₇₅ oder LC-₉₀) einer einzigen Chemie bestimmt. Anschließend beschreiben wir zwei Erwachsene Assays für die Bestimmung der letale Dosis (LD). Die erste davon ist eine Adaption des LITE-Protokolls für die Prüfung von topisch applizierten, neuartigen Chemikalien gegen die Erwachsenen Mücken im Vergleich zu einer positiven Kontrolle. Die zweite ist eine Fütterung Assay für die Bewertung von Chemikalien über die Blutmahlzeit systemisch geliefert.

Protokoll

Hinweis: Alle Stämme und Reagenzien für die Arbeit erforderlichen beschrieben in den folgenden Protokollen und Lieferanten sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.

(1) Kultur der Moskito Larven und Erwachsene

Hinweis: Insektizid anfällig Stämme von Mücken sind von der Malaria-Forschung und Reagenz Referenz Repository zur Verfügung. Empfohlene Sorten sind wie folgt: Liverpool (LVP) Stamm Aedes Aegypti , Anopheles Gambiae Kisumu (KISUMU1) Dehnung und Culex Quinquefasciatus Johannesburg (JHB) Belastung.

1. Kultur Moskitolarven aus Eiern in einer 12 h Tag/12 h Nacht Zyklus bei 28 ° C und 75-85 % relativer Luftfeuchtigkeit (RH) in Kunststoffschalen 25 x 40 cm (~ 400 Larven pro Fach) wie Nuss-²⁹beschrieben. Füttern Sie die Larven Boden Wüstenrennmaus (A. Aegypti und Jg. Gambiae) oder Fisch Flockenfutter (C. Quinquefasciatus). Für Larven Assays sammeln Sie Larven im dritten Larvenstadium (L3) Instar Stadium.
2. Hinten erwachsene Mücken aus Puppen, die übertragen wurden, Plastikbecher und innerhalb 20 L Kunststoff Käfige in einem Insectary unter den oben beschriebenen Bedingungen. Pflegen Sie Mücken auf 20 % Zuckerlösung wie²⁹an anderer Stelle beschrieben. Erwachsene über 3-5 Tage Post aufkommen zu sammeln.

2. Larven Kontakt Assay (Punkt Einzeldosis oder Dosis-Antwort-Assay)

Hinweis: Der Test kann durchgeführt werden mit Chemikalien, die löslich in Wasser oder Dimethyl Sulfoxid (DMSO), sind unter der Voraussetzung, dass die Endkonzentration von DMSO in Testgefäße 1 % nicht überschreitet. Alternative Lösungsmittel können eine Option sein, aber es ist ätherische zuerst bestätigen, dass die Endkonzentration keine verursacht mehr als 10 % Mortalität bei 72 h Post Exposition. Der Test kann als Einzel-Dosis oder Dosis-Antwort-Assay durchgeführt werden. Wenn Sie Letzteres durchführen, es empfiehlt sich, eine Reihe von Konzentrationen (mindestens fünf), testen über den erwarteten LC₅₀.

1. Beschriften Sie die Vertiefungen einer Gewebe klar 24-Well-Platte, wie in Abbildung 1dargestellt.
2. Bereiten Sie eine Stammlösung der Test Chemie in einem 1,5 mL-Tube.
   1. Jede Chemie mit Hilfe einer Analysenwaage wiegen, und je nach Löslichkeit Eigenschaften erneut aussetzen in sterilen DdH₂O, DMSO oder andere organische Lösungsmittel der Wahl (siehe Abbildung 2).
      Hinweis: Berechnungen sollte die Reinheit der Chemie berücksichtigt. Zum Beispiel für eine Chemie, die 99 % rein, lösen Sie 10,1 mg in 1.000 µL Aceton, eine 1 % ige Lösung zu erhalten auf. Seal mit Paraffin Film und Lagerung bei-20 ° C.
3. Die Endkonzentration von den Test-Chemie, die evaluiert werden und bereiten Verdünnungsreihen aus der Stammlösung entsprechend, mit den geeigneten Lösungsmittel zu bestimmen.
   Hinweis: Die Konzentration und das Volumen der Chemie und Lösungsmittel können berechnet werden mit der Formel C-₁* V₁= C₂* V₂ wo C₁= Konzentration der Probe 1, C₂= Konzentration der Probe 2, V₁= Volumen des Probe 1 und V₂= Volumen der Probe 2. Sehen Sie in Abbildung 2 und Tabelle 1dargestellten Beispielberechnungen.
   1. Bereiten Sie eine 10 mM-Stammlösung und Verdünnungsreihen, wie erforderlich, um die gewünschte Testkonzentrationen (Tabelle 1 b) zu erhalten.
4. Mit einer weite Bohrung Kunststoff Transferpipette übertragen Sie fünf L3-Larven zu dem Brunnen einer Gewebekultur-Test-Platte; L3-Larven sind erkennbar durch Länge (~ 2,5-3,5 mm) und Kopf Kapsel Breite ~ 0,025 mm²⁴. Sanft entfernen Sie das Wasser mit einer 1-mL-Pipette und ersetzen Sie durch die gewünschte Lautstärke des DdH₂O (siehe unten). Wiederholung zu n = 4 Technische Wiederholungen pro Behandlung (d. h. 20 Larven pro Behandlung).
5. Fügen Sie das entsprechende Volumen der Test Chemie zu jedem der vier replizieren Brunnen in der 24-Well-Testplatte und schwenken Sie sanft die Platte, um sicherzustellen, gleichmäßige Durchmischung der Chemie. Legen Sie die Platte in einer Test- oder Wachstum Kammer unter gleichbleibenden Bedingungen (z.B. 25 ° C und ~ 75-85 % RH wird empfohlen und ein 12 h Licht/12 h dunklen Zyklus wenn möglich).
   Hinweis: Für die Reproduzierbarkeit zwischen Experimente, sicherzustellen Sie, dass nachfolgende Tests unter gleichen Umweltbedingungen durchgeführt werden.
6. Notieren Sie die Anzahl der Toten/non-responsive Larven in jede Vertiefung bei 30 min, 1, 1,5, 2, 3, 24, 48 und 72 h nach Exposition (oder alternativer Zeitpunkte) auf dem Spielberichtsbogen (Tabelle 2). Tippen Sie sanft auf die Seite der Platte. Wenn keine Bewegung festgestellt wird, berühren Sie sanft die Larve mit einem sterilen Zahnstocher. Partitur-Larven, die nicht reagieren, um klopfen/Touch als "tot".
   Hinweis: Andere morphologische und Verhaltensstörungen Phänotypen können beobachtet werden und aufgezeichnet werden können.
7. Richtige Kontrolle Mortalität mit modifizierten Abbott Formel, falls gewünscht, wie folgt:
   Sterblichkeit (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
   wobei X = Prozent Sterblichkeit in den behandelten Probe und Y = Prozent Sterblichkeit im Steuerelement.
8. Ergebnisse als Histogramm oder logarithmischen Kurve mit Software Wahl z. B. Grafik-Pad Prisma 6 oder ähnliche Grafik, und letale Konzentration (LC) Werte relativ zum Steuerelement zu berechnen.
9. Wiederholen den Test über einen separaten Stapel von Mücken zu n = 3 oder mehr biologische Wiederholungen.

3. Erwachsene topische Assay (Punkt Einzeldosis oder Dosis-Antwort-Assay)

Hinweis: Die Erwachsenen topische Assay wird mit Aceton als Lösungsmittel durchgeführt. Alternative Lösungsmittel können eine Option sein, aber es ist ätherische zuerst bestätigen, dass die Endkonzentration keine verursacht mehr als 10 % Mortalität bei 48 h Post Exposition. Der Test kann durchgeführt werden, als eine einzelne Dosis oder Dosis-Antwort-Assay und wird verwendet, um die letalen Dosis (LD) zu bestimmen. Wenn Sie Letzteres durchführen, es empfiehlt sich, eine Reihe von Konzentrationen (mindestens fünf), testen über den erwarteten LD-₅₀.

1. Bestimmen Sie die Anzahl der Erwachsenen weiblichen Mücken erforderlich, um den Test auszuführen.
   Hinweis: Ein Punkt-Dosis-Assay mit einem einzigen Chemie erfordert ein Minimum von 90 Mücken (30 für die positive Kontrolle, 30 für die Aceton-nur negativ-Kontrolle und 30 für die Test-Chemie).
2. Kultur 3 bis 5 Tage alte Erwachsene weibliche Stechmücken und verschieben in eine separate 20 mL-Kunststoff-Eimer mit einer Absauganlage (Abbildung 3).
3. Beschriften Sie 9 oz Pappbecher mit den Namen und die Konzentration der Chemie Test. 10 x 10 cm Mesh Plätzen und Gummibänder für jede Tasse beiseite (siehe Abbildung 4).
4. Wählen Sie eine vorhandene Insektizid als Positivkontrolle (z. B. das synthetische Pyrethroid, Bifenthrin) und bereiten Sie eine Stammlösung 1 % (10 µg/µL) in Aceton.
   Hinweis: Berechnungen sollte die Reinheit der Chemie berücksichtigt. Zum Beispiel für eine Chemie, die 99 % rein, lösen Sie 10,1 mg in 1.000 µL Aceton, eine 1 % ige Lösung zu erhalten auf. Seal mit Paraffin Film und Lagerung bei-20 ° C.
5. Nach dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben, bereiten Sie eine Stammlösung der Chemie Test.
   Hinweis: Viele Test-Chemikalien sind sehr labil, und Lösungen erfolgen vorzugsweise frisch jedes Mal die Bioassay durchgeführt wird.
6. Bereiten Sie Verdünnungsreihen der Positivkontrolle vor und testen Sie Chemikalien aus Stammlösungen wie in Abbildung 5 mit 20 mL Glasfläschchen mit Aceton vorher gespült.
7. Eine Spritze, 1 mL Glas mit Aceton reinigen, füllen Sie mit Aceton und sichern in der Mikro-Applikator so angepasst, dass ein Volumen von 0,25 µL liefern.
8. Arbeiten in Batches von zehn, 3 - 5 - Tage alten Erwachsene weibliche Stechmücken aus Käfigen mit einem Sauger zu entfernen und für bis zu 5 min bei 4 ° C im Kühlschrank oder auf Eis zu betäuben. Als nächstes übertragen Sie Mücken in eine Petrischale und Ort für bis zu 10 min auf Eis.
9. Arbeiten schnell, ein einzelnes Weibchen mit einer feinen Pinzette entfernen und 0,25 µL der Testlösung auf der dorsalen Thorax mit der Spritze Mikro-Applikator anwenden. Bestätigen Sie, dass der Chemie durch Beobachtung mit einem sezierenden Mikroskop jede Mücke sicherzustellen erhält das entsprechende Volumen der Test Chemie.
10. Übertragen Sie die Mücke auf einen beschrifteten Pappbecher ruht auf Eis, und wiederholen Sie neun Mal zu n = 10 behandelten Mücken. Versiegeln Sie die Mücken in die Tasse mit einem quadratischen Gitter gesichert mit einem Gummiband und Transfer zu einer Kunststoff-Wanne oder Wachstum Kammer unter gleichbleibenden Bedingungen von 28 ° C und 75-85 % RH (auf einem 12 h Tag/12 h Nachtzyklus vorzuziehen ist).
11. Wiederholen Sie den obigen Versuch zweimal zu n = 3 Technische Wiederholungen (d. h. 30 Mücken gesamt) pro Behandlung oder Kontrolle-Gruppe.
12. Wiederholen Sie die Schritte 3,7-3.10 zuerst mit der Test-Chemie und dann die positive Kontrolle.
    Hinweis: Ein anderes nützliches Steuerelement einschließen, wenn ausreichende Mücken zur Verfügung stehen ist eine "leere" 30 narkotisierten Mücken, die nicht entweder Test Chemie oder Lösungsmittel erhalten.
13. Notieren Sie die Anzahl der "Toten/non-responsive" Mücken in 30 min, 60 min, 2, 24 und 48 h nach Exposition (oder alternativer Zeitpunkte) mit Notenblatt (Tabelle 3). Mücken der Gäste, wie "Toten/non-responsive" Wenn sie Mangel an Bewegung zeigen, definiert als die Verlegung auf einer Seite oder auf dem Rücken und mit der Unfähigkeit, zu fliegen.
14. Falls gewünscht, für Kontrolle Sterblichkeit mit modifizierten Abbott Formel wie folgt zu korrigieren:
    Sterblichkeit (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
    wobei X = Prozent Sterblichkeit in den behandelten Probe und Y = Prozent Sterblichkeit im Steuerelement.
15. Ergebnisse als ein Histogramm oder eine exponentielle Kurve anzeigen. Berechnen Sie für eine Dosis-Antwort-Assay die LD₅₀, LD₇₅ oder LD₉₀ Wert für die Test-Chemie relativ zum Steuerelement.
16. Wiederholen Sie den Test mindestens zweimal mit separaten Chargen von Moskitos zu n = 3 oder mehr biologische Wiederholungen.

(4) Erwachsene Blut-Fütterung Assay (Punkt Einzeldosis oder Dosis-Antwort-Assay)

1. Sammeln rund 150 4-5-Tage alte Erwachsene weibliche Stechmücken und Transfer zu einem separaten Käfig. Wiederholen Sie, um 6 Käfige zu erhalten, wenn eine Dosis-Antwort-Test durchführen. Entfernen Sie die Quelle von Zucker 1-24 h vor der Fütterung Assay.
2. Vorbereiten einer Stammlösung der Chemie wie oben beschrieben, die Reinheit der Chemie (eine typische Stammlösung ist 80 mM in Wasser oder Salz Puffer) entfallen, und anschließend bereiten Verdünnungsreihen im Wasserspeicher je nach Bedarf.
3. Fügen Sie 40 µL der einzelnen Verdünnungen bis 960 µL Defibrinated Kaninchen Blut auf die gewünschte Testkonzentration zu erhalten. Zuweisen Sie einer Aufgabeeinheit Barrierefolie und mit einem Gummiring verschließen. Übertragen Sie 1 mL Blut zu, per Pipette und befestigen Sie die Aufgabeeinheit ein Heizelement.
4. Sanft gemacht Tupfer die Membran Oberfläche mit frisch 10 % Milchsäurelösung und Ort der Vorschubeinheit in den Käfig des erwachsenen Mücken. Decken Sie den Käfig mit einem dunklen Tuch oder schwarzen Müllsack und lassen Sie Mücken, eine Stunde lang zu ernähren.
5. Wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.4 für den Rest der Testlösungen und die Negativkontrolle (nur für Blut).
6. Platzieren Sie nach Abschluss der Fütterung Eimer bei 4 ° C im Kühlschrank für 5 min um Mücken zu betäuben. Entfernen Sie männliche Mücken und weibliche Mücken nicht gefüttert, und zählen Sie und die Gesamtzahl der gefüttert und teilweise gefüttert Mücken durch Untersuchung des Abdomens.
7. Behalten Sie teilweise und voll gefüttert weibliche Stechmücken, mit dem Ziel, für ein Minimum von 50 Blut gefüttert Mücken pro Dosis.
8. Übertragen Sie Eimer auf einer Kunststoff-Wanne oder Wachstum Kammer unter gleichbleibenden Bedingungen von 28 ° C und 75-85 % RH (auf einem 12 h Tag/12 h Nachtzyklus vorzuziehen ist).
9. Zeichnen Sie die Gesamtzahl der Toten/non-responsive Mücken auf 0,5, 1, 1,5, 2, 24, 48 und 72 h (oder alternativen Zeitpunkten wie gewünscht) über die Punktzahl Blatt (Tabelle 4).
10. Stellen Sie auf den dritten Tag Post Blut füttern einen Eierbecher in den Käfig und sammeln Sie Eier über einen Zeitraum von 72 h. Die insgesamt Anzahl der Eier pro Behandlung unter dem sezierenden Mikroskop hergestellt.
11. Berechnen Sie die prozentuale Mortalität und Fruchtbarkeit in Abhängigkeit von der Gesamtzahl der fed Mücken für jede Behandlungsgruppe und der Kontrolle. Für Kontrolle Sterblichkeit mit modifizierten Abbott Formel, bei Bedarf zu korrigieren.
12. Anzeigedaten Toxizität und Fruchtbarkeit als Histogramm Plot oder exponentielle Kurve (wenn eine Dosis-Antwort-Assay) mit Software der Wahl. Wenn Sie eine Dosis-Antwort-Test durchführen, berechnen Sie die LD₅₀, LD₇₅ oder LD₉₀ Wert für die Test-Chemie relativ zum Steuerelement.
13. Wiederholen Sie den Test mindestens zweimal mit separaten Chargen von Moskitos zu n = 3 oder mehr biologische Wiederholungen.

Ergebnisse

Abbildung 6 zeigt die prozentuale Mortalität von L3 Ae. Aegypti nach Exposition gegenüber fünf Dosen von Dopamin-Rezeptor-Antagonisten, Amitriptylin im Vergleich zu Wasser nur (negative) Kontrolle auf 24, 48 und 72 h. In diesem Beispiel an den Zeitpunkten jeweils erhobenen Daten zeigen eine typische logarithmische Kurve und offenbaren eine dosisabhängige Wirkung von Amitriptylin auf larval Sterblichkeit. Der LC₅₀ Wert sinkt über den zeitlichen Verlauf des Experiments und kann anhand der 72 h-Daten (d. h. Mittelpunkt der logarithmischen Kurve) berechnet werden.

Abbildung 7 zeigt die prozentuale Mortalität von 3 - 5 Tage alte adulte Weibchen Ae. Aegypti nach Exposition gegenüber einer 400 µM-Dosis (10 µg/µL) von Dopamin-Rezeptor-Antagonisten, Amitriptylin und im Vergleich zu den synthetischen Pyrethroid Bifenthrin-positiv-Kontrolle (technischer Qualität; 500 Pg/µL), Aceton nur negativ-Kontrolle und unbehandelten Mücken (leer). In diesem Beispiel verursachen Amitriptylin und Bifenthrin erhebliche Erwachsenensterblichkeit bezogen auf die negativ-Kontrolle. Beachten Sie, dass Erwachsenensterblichkeit verringert sich im Laufe der Zeit vermutlich durch metabolische Entgiftung des Test-Chemikalien.

Abbildung 8 zeigt der Prozent Sterblichkeit (linke y-Achse) 3 bis 5 Tage alte Erwachsenfrau Ae. Aegypti gefüttert eine Blutmahlzeit behandelt mit einem der vier Dosen von Dopamin-Rezeptor-Antagonisten, Amitriptylin und der Fruchtbarkeit (Rechte y-Achse; durchschnittliche Ei Graf / weibliche) für die ersten Gonotrophic Zyklus Post Belichtung im Vergleich zu steuern Moskitos (Blut gefüttert nur; negative Kontrolle). Die Daten zeigen, dass es keinen signifikanten Einfluss von Amitriptylin auf Erwachsenensterblichkeit relativ zum Steuerelement zeigen aber, dass Amitriptylin erhöht Fruchtbarkeit bei der höchsten Dosis (400 µM).

Abbildung 1 . Aufbau der Larven Dosis-Antwort-Assay. Bild zeigt den Aufbau des larvalen Dosis Antwort Assays mit Aedes Aegypti L3-Larven in 24-Well-Platte durchgeführt.

Abbildung 2 . Schematischen Verfahren für Satz (A) Einzelpunkt-Dosis oder (B) Dosis Antwort Larven Assay in 24-Well-Platte angezeigt. Nach Überführung der fünf L3-Larven, Brunnen überschüssiges Wasser sanft per Pipette entfernt und ersetzt mit frischen, sterilen DdH₂O. Als nächstes sind Lager Verdünnungsreihen der Chemie Test vorbereitet und zu einem Endvolumen von 1 mL/Brunnen hinzugefügt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 . Kultur der erwachsenen Mücken. Bild zeigt 20 L Kunststoff-Eimer zur Kultur der erwachsenen Mücken und Nutzungsbedingungen eine Absauganlage Mücken. entfernen

Abbildung 4 . Erwachsenen topische Assay durchgeführt mit 4-5 Tage alt weiblich Aedes Aegypti. Nach der Behandlung mit Chemie oder Lösungsmittel, Erwachsene Mücken sind in Pappbecher platziert und für die Dauer des Tests in einer Prüfkammer übertragen.

Abbildung 5 . Lager und Verdünnungsreihen. Schematische Darstellung zeigt das Verfahren zur Vorbereitung der Lager (A) und (B) serielle Testlösungen für die Erwachsenen aktuell-Assay. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6 . Repräsentative Daten aus einen Larven Kontakt Dosis-Antwort-Assay. Repräsentative Daten aus einer larvalen Kontakt Dosis-Antwort Test zeigt Prozent Sterblichkeit von Aedes Aegypti L3 Larven nach Exposition gegenüber den Dopamin-Rezeptor-Antagonisten, Amitriptylin bei 24, 48 und 72 h. Jeder Datenpunkt repräsentiert bedeuten in µM ± SEM Daten repräsentieren n = 3 biologische repliziert.

Abbildung 7 . Repräsentative Daten aus einer topischen Dosis für Erwachsene Antwort Assay. Repräsentative Daten aus einer topischen Dosis für Erwachsene Antwort Assay zeigt Toxizität von Dopamin-Rezeptor-Antagonisten, Amitriptylin (10 µg/µL), 3-5 Tage alten weiblichen Gelbfiebermücke im Vergleich zu den synthetischen Pyrethroid, Bifenthrin (500 Pg/µL) positive Kontrolle) und der negativen Kontrolle (Aceton Fahrzeug nur) 2, 24 und 48 Stunden. Darstellung von Daten n = 3 biologische repliziert. Fehlerbalken zeigen SEM

Abbildung 8 . Repräsentative Daten von einem Erwachsenen Verschlucken Assay. Repräsentative Daten von einem Erwachsenen Verschlucken Assay zeigt Toxizität der Dopamin-Rezeptor-Antagonisten, Amitriptylin in 400 µM, 100 µM und 200 µM Dosis auf 3-5 Tage alten Erwachsenen weiblichen Gelbfiebermücke und Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit (ausgedrückt als die durchschnittlichen gesamten Ei gelten Sie pro Weibchen über den ersten Gonotrophic-Zyklus). Darstellung von Daten n = 3 biologische Wiederholungen ± SEM

A. Einzelpunkt-Dosis-Assays mit drei Chemikalien
Chemie	Konzentration (400 ähm)
Amitriptylin	80 mM Lager: 2 mg Amitriptylin X 98 % (Reinheit des Pulvers) X 0,001 g / 1 mg X 1 Mol 313,86 g X 1 L/0,08 Mol X 106 µL/L = 78.06 µL Wasser.
	Serielle Verdünnungen: Verdünnen Sie Lager 1:2 mit DdH2O und dann 1:4 bis 10 mM zu erreichen. 40 µL 10 mM Lager hinzu kommt gut mit 960 µL DdH20, eine Endkonzentration von 400 µM/gut zu erreichen.  Bereiten Sie serielle Verdünnungen von 10 mM Lager 1:2, 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mM und 0,625 mM Bestände zu erreichen.
CIS-(Z)-Flupenthixol	80 mM Lager: 2 mg des Cis (Z) Flupenthixol X 98 % (Reinheit des Pulvers) X 0,001 g / 1 mg X 1 Mol/507.44-g-Cis (Z) Flupenthixol X 1 L/0.08 Mol X 106 µL/L = 48.28 µL Wasser.
	Serielle Verdünnungen: Wie oben.
Amitraz	80 mM Lager: 2 mg von Amitraz X 0,001 g / 1 mg X 1 Mol/293,4 g Amitraz X 1 L/0.08 Mol X 106 µL/1 L = 85.21 µL DMSO (Hinweis: Amitraz ist nur löslich in DMSO).
	Serielle Verdünnungen: Wie oben.
B. Dosis-Antwort-assay
Chemie	Dosis 1	Dosis 2	Dosis 3	Dosis 4	Dosis 5
	400 ΜM	200 ΜM	100 ΜM	50 ΜM	25 ΜM
z. B. Amitriptylin, Cis-(Z)-Flupenthixol oder Amitraz	40 ΜL	40 ΜL	40 ΜL	40 ΜL	40 ΜL
	10 mM Lager	5 mM Lager	2,5 mM Lager	1,25 mM Lager	0,625 mM Lager

Tabelle 1. Beispielrechnungen für Aedes Aegypti L3 Larven (A) einzelne Punkt Dosis Assay und (B) Dosis-Antwort-Assay.

Tabelle 2: Beispiel Bewertungsbogen verwendet, um Daten aus der Moskito Larven Dosis Antwort Test. Steuerung, nur mit Wasser oder Wasser mit 1 % DMSO oder andere Lösungsmittel nur. Typische Dosierungen verwendet, um niedermolekulare Antagonist Chemikalien wie Amitriptylin testen sind 25 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM und 400 µM.

Erwachsenen Mücke (3-5 Tage alt) topische Assay
Datum eingeleitet:
Ermittler:
Art/Sorte:
Assay Typ: Einzelpunkt-Dosis/Wirkungs
A. Sterblichkeit (No. tote Mücken)
Zeit (Stunden)	Dosis 1	Dosis 2	Dosis 3	Dosis 4	Dosis 5	Steuerung
0,5
1
1.5
2
2.5
B. Prozent Sterblichkeit
Zeit (Stunden)	Dosis 1	Dosis 2	Dosis 3	Dosis 4	Dosis 5	Steuerung
0,5
1
1.5
2
2.5

Tabelle 3. Beispiel Notenblatt verwendet, um Daten aus der Dosis für Erwachsene topische Reaktion Test.

Erwachsenen Mücke (3-5 Tage alt) Einnahme Assay
Datum eingeleitet:
Ermittler:
Art/Sorte:
Assay Typ: Einzelpunkt-Dosis/Wirkungs
A. Zahl gefüttert Mücken
	Dosis 1	Dosis 2	Dosis 3	Dosis 4	Dosis 5	Steuerung
Gefüttert
Nicht Fed
gesamt
% Fed
% Nicht Fed
B. Mortalität (No. tote Mücken)
Zeit (Stunden)	Dosis 1	Dosis 2	Dosis 3	Dosis 4	Dosis 5	Steuerung
2
24
48
72
C. Prozent Sterblichkeit
Zeit (Stunden)	Dosis 1	Dosis 2	Dosis 3	Dosis 4	Dosis 5	Steuerung
2
24
48
72

Tabelle 4. Beispiel Bewertungsbogen verwendet, um Daten von Erwachsenen Blut-Fütterung Assays. Typische Dosierungen verwendet, um niedermolekulare Antagonist Chemikalien wie Amitriptylin testen sind 400 µM, 200 µM, 50 µM und 100 µM.

Diskussion

Insektizide sind mächtige Werkzeuge zur Bekämpfung von Moskitos übertragenen Krankheiten wie Malaria²⁵, Dengue-Fieber und Zika²⁶. Umfangreiche Insektizideinsatz produzierte Moskito-Populationen sind resistent gegen chemische Bekämpfung, führend zu die Entwicklung von Insektizid Widerstand, der gilt als die größte Bedrohung für Seuchenbekämpfung fortgesetzt. Im letzte Jahrzehnt hat einen dramatischen Anstieg der Populationen von Anopheles spp. beständig gegen synthetische Pyrethroide (SPs) verwendet in Moskitonetze in Afrika⁷gesehen. Populationen von Aedes Albopictus, Überträger von Dengue-Fieber und Zika, worden in Florida und New Jersey, die Organophosphate⁶resistent sind berichtet. In ähnlicher Weise wurde Widerstand gegen DDT und Pyrethroide in Populationen von Anopheles und Aedes spp. in Kolumbien^27,28dokumentiert. Besteht dringender Bedarf, entwickeln neue Larviziden und Adulticides, die an verschiedenen Orthosteric binden oder allosterische Websites von bekannten molekulare Targets oder stören die neue Ziele (z. B. neuartige MoA Chemikalien)^29,30 und haben Sie minimale Auswirkungen auf die Umwelt. Es steigt auch Anerkennung für das Potenzial um Endectocides für Moskito Kontrolle^31,32,33.

Um der rasanten Entwicklung solcher Produkte zu erleichtern, beschreiben wir eine Reihe von Protokollen, die entworfen, um die Toxizität von niedermolekularer Chemikalien Moskitolarven und Erwachsene über zwei Lieferrouten - Kontakt und Einnahme zu bewerten. Protokolle wie das WHO-Empfindlichkeitstest und CDC Flasche Assays sind im allgemeinen Gebrauch für die Bewertung der Toxizität und Ölabweisung vorhandene Insektizide Formulierungen^1,2. Aber diese Assays haben Beschränkungen für Analysen der unformulated neuartige chemische Einheiten (NCEs) und sind nicht geeignet, um große Anzahl von Chemikalien in gemäßigten oder hohen Durchsatz zu testen.

Hier beschreiben wir einen standard Larven Assay um schnell NCEs Einzelpunkt-Dosis zu bewerten, die für Hochdurchsatz Analysen skaliert werden können. Wir beschreiben auch eine Adaption von einem Assay entwickelt von der LITE²¹ , die Kontakt Toxizität von niedermolekularer Chemikalien erwachsene Mücken zu bewerten. Wir beschreiben einen Einnahme-Test zur Bewertung der Toxizität von NCEs geliefert über die Blutmahlzeit, Erwachsene weiblichen Stechmücken und erforschen potenzielle Endectocide. Diese Larven und Erwachsenen Assays können bei einer Reihe von Dosen durchgeführt werden, um LC und LD-Werte zu bestimmen, und Larven und Erwachsenen Kontakt Assays im Vergleich zu einem oder mehreren vorhandenen chemischen Formulierungen durchgeführt werden können. Die Erwachsenen topische Assay ermöglicht auch die Berechnung von LD Werte pro einzelnen Moskito. Die Protokolle können mit Arten der Aedes, Anopheles und Culex^16,29 durchgeführt werden und könnte geändert werden, um Platz für die biologischen Besonderheiten einer Spezies, falls gewünscht. Nach unserer Erfahrung Mosquitocidal Chemikalien weisen in der Regel breite Wirkung auf diese drei Gattungen^16,29, aber Wert zur Beurteilung der Spezies Selektivität vorhanden ist.

Die Assays sind ein Ausgangspunkt mehrere Chemikalien für Insektizide Aktivität schnell auf den Bildschirm. Diese Chemikalien, die Toxizität in einem oder mehreren Tests aufweisen konnte für weitere Analysen über sekundäre und tertiäre Assays ausgewählt werden. Beispiele hierfür sind die LITE tarsal-Assay und Zucker füttern Assays^34,35. Die Auswahl der zusätzlichen Assays richtet sich in der Regel nach Überlegungen rund um erwarteten Markt- und Anwendung, mit Ergebnissen, die Einblicke zu Produkt Lieferarten. In die repräsentativen Ergebnisse hier gezeigten erforschen wir die Toxizität von Amitriptylin, ein Antagonist von Säugetieren und Wirbellosen Dopamin-Rezeptoren, die für potenzielle als Roman MoA Insektizid^10,12, bewertet wurden ^{13 , 16}. Amitriptylin ausgestellt Toxizität für Larven und Erwachsene von Ae. Aegytpi μg Bereich vorschlagen larvicidal und Adulticidal Tätigkeit sowie eine Begründung für eine Auseinandersetzung mit einem Amitriptylin-basierte chemische Serie zu identifizieren Analoga mit hoher Potenz. Keine signifikante Auswirkung auf Sterblichkeit oder Fruchtbarkeit verzeichneten Ae. Aegypti Amitriptylin in der Blutmahlzeit ausgesetzt. Während die Stabilität der Chemie in Defibrinated Blut und wirksame Dosis erhalten pro Mücke nicht bekannt ist, nennenswerte Einschränkungen des Assays, legen die Daten nahe, dass Amitriptylin und andere GPCR-aktive Verbindungen wenig Potenzial als Endectocides, bei zumindest in unformulated Zustand.

Vorkehrungen treffen, um biologische Unterschiede zwischen den Proben zu begrenzen sind unerlässlich. Alle Tests sollten unter normalen Bedingungen von Temperatur und Luftfeuchtigkeit, vorzugsweise in einer Kammer Insekt Wachstum durchgeführt werden, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Es ist zwingend notwendig, um die Standardisierung von Verfahren für das scoring phänotypischen Endpunkte, da diese sehr subjektiv, führt zu deutlichen Unterschieden in Daten von verschiedenen Laborpersonal aufgezeichnet werden können. Die Larven Assay eignet sich am besten zur Bewertung von Chemikalien, die in Wasser löslich sind, obwohl der Assay erfolgen kann, wenn die Endkonzentration ist weniger als 1 % pro Bohrloch mit organischen Lösungsmitteln wie DMSO. Wir erkennen mehrere Einschränkungen für die Erwachsenen topische Assay. Erstens ist es notwendig, schnell zu arbeiten, bei der Vorbereitung von Verdünnungsreihen und Dosen zu liefern, da der Träger (Aceton) sehr volatil ist und Verdampfung Variation in Höhe von Chemie produzieren kann geliefert. Zweitens sollte darauf geachtet werden, die Geltungsdauer der Narkose zu beschränken, da dies zur Sterblichkeit beitragen kann. Anzumerken ist, dass Lösungsmittel wie Aceton einen schnellen "Knock-down"-Effekt in der ersten mehrstündigen des aktuellen Tests produzieren können, die nicht mit Effekten aufgrund der Chemie Test verwechselt werden sollte. Wir stellen fest, dass das Volumen der Moskito-Blut-Mahlzeit zwischen Individuen, erschwert eine Bewertung der Dosis erhalten pro Erwachsener in der Erwachsenen Einnahme Test variiert. Zu guter Letzt sollte Assay-Daten nicht in Fällen gilt, wenn die Mortalität in der negativen Kontrolle 10 % übersteigt.

Produkte, die synergistisch wirken werden zunehmend anerkannt, ihr Potenzial zu erweitern das Dienstprogramm von bestehenden Produkten und ermöglichen eine Kontrolle der Insektizide resistente Schädlinge Bevölkerung^15,16,36. Larven-Assays wurden zur Synergismus zwischen dem Formamidine-Pestizid, Amitraz und eine Vielzahl von Chemikalien, die Wirbellosen Octopamin Rezeptoren^14,15stören zu untersuchen. Die Larven Assay und Erwachsenen topische Assay beschrieben eignen sich für additive oder synergistische Effekte zwischen Kombinationen von Chemikalien Test auswerten. Wir stellen fest, dass jeder der hier beschriebenen drei Assays Synergisten wie Piperonyl Butoxide (PBO) integriert werden können.

Die oben beschriebenen Tests bieten eine standardisierte Versuchsreihen zur Auswertung von unformulated, kleinen Molekül Medikamente gegen aquatische und terrestrische Mücke Lebensstadien. Diese Tests sind speziell für Toxizität zu bewerten und bieten mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Tests gemeinsam nutzen. Wichtig ist, die Assays sind Automatisierung zugänglich und können im industriellen Maßstab zur Bewertung von Tausenden von Testverbindungen ermöglichen durchgeführt werden. Schließlich Bereich hält die Entwicklung von Produkten, die über neue MoAs handeln, auch durch Unterbrechung der neue molekulare Targets und biochemischen Bahnen, es wird entscheidend sein, mehrere phänotypische Endpunkte zusätzlich zu denen z. B. Mortalität zu erzielen und Paralyse. Die oben genannten Tests erlauben solche Untersuchungen, wodurch es einen Schritt in Richtung Insektizide hochinnovative Technologien von morgen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insecticide susceptible mosquito strains	Malaria Research and Reagent Reference Repository	https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain
Acetone	Mallinckrodt Chemical	CAS 67-64-1	Use for dilutions and control
Amitraz	Sigma-Aldrich	CAS 33089-61-1	Requires dilution in DMSO
Amitriptyline	Sigma-Aldrich	CAS: 549-18-8	Can be diluted in acetone
Bifenthrin	Sigma-Aldrich	CAS: 51529-01-2	Synthetic pyrethorid used as positive control
Cis-(Z)-flupenthixol	Sigma-Aldrich	CAS: 51529-01-2	Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors
Defibrinated rabbit blood	Hemostat	DRB0100	Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding
Dimethylsulphoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	MKBF2985	Organic solvent used to disolve amitraz
Hemotek membrane feeding system	Hemotek Ltd	Serial no. 1303	Used for feeding mosquitoes
Micro-applicator	Burkard Manufacturing Co.	-	Tool needed for topical application experiments
24-well cell culture plate with lid	Corning Incorporated	3526	-
Advantage rubber bands	Alliance Rubber Co.	-	Used to seal the paper cups
Glass syringe (1 ml)	Becton Dickinson and Co.	512004	Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic
Disposable scintillation vials (20 ml)	Fisher Scientific	74505-20	Glass vials prevent evaporation
Tulle fabric, white	Walmart	-	-
Paper cups	Dixie Consumer Products LLC.	PF15675/13D	Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays
Petri dishes (150 mm)	Corning Life Sciences	-	Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M	Used to sort larvae
Stereo microscope	Olympus	SZ6045	Used to score larval assays and perform micro-applications
Tweezers (fine)	Fontax	-	Used to handle adult mosquitoes