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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir das Standardprotokoll für die Erkennung von β-Galaktosidase Aktivität in frühen ganze Maus-Embryonen und die Methode für die Paraffin-Schnitt und gegenfärbung. Dies ist ein einfaches und schnelles Verfahren, Genexpression während der Entwicklung zu überwachen, auch die Gewebeschnitte, angewendet werden können, Organe oder kultivierten Zellen.

Zusammenfassung

Die Escherichia coli LacZ gen, β-Galaktosidase wird weitgehend als Reporter für die Genexpression und als Tracer in Zell-Linie Studien verwendet. Die klassische histochemische Reaktion basiert auf der Hydrolyse des Substrats X-gal in Kombination mit Eisen und Eisen-Ionen, die einen unlöslichen blauen Niederschlag, das einfach produziert zu visualisieren. Daher dient β-Galaktosidase Aktivität als Marker für das Muster des Ausdrucks des Gens von Interesse, wie die Entwicklung verläuft. Hier beschreiben wir das Standardprotokoll für die Erkennung von β-Galaktosidase Aktivität in frühen ganze Maus-Embryonen und die nachfolgende Methode für Paraffin-Schnitt und gegenfärbung. Darüber hinaus ist ein Verfahren zur Klärung der ganzer Embryos zur Verfügung gestellt, um X-gal-Färbung in tiefere Regionen des Embryos besser zu visualisieren. Konsistente Ergebnisse erhält man durch die Durchführung dieses Verfahrens, obwohl Optimierung der Reaktionsbedingungen benötigt wird, um die Hintergrundaktivitäten zu minimieren. Einschränkungen in der Probe sollte betrachtet werden, insbesondere im Hinblick auf die Größe des Embryos in der ganze Berg Färbung. Unser Protokoll bietet eine sensible und eine zuverlässige Methode für β-Galaktosidase-Erkennung bei der Maus-Entwicklung, die den Kryostaten Abschnitte sowie ganze Organe weiter angewendet werden kann. So, die dynamische gen Expressionsmuster während der gesamten Entwicklung mithilfe dieses Protokolls in ganzen Embryonen leicht analysiert werden können, sondern auch detaillierte Ausdruck auf zellulärer Ebene nach Paraffin-Schnitt beurteilt werden kann.

Einleitung

Um spezifische gen Expressionsmuster zu beschreiben, ist die Verwendung von Reporter-Gene als Marker von Drosophila , Säugetiere von größter Bedeutung gewesen. In Experimenten mit transgenen und Knockout Tieren ist das bakterielle β-galaktosidase-Gen (LacZ) von Escherichia coli (E. Coli) eines der am weitesten verbreitete1,2,3, 4. β-Galaktosidase (β-gal) katalysiert die Hydrolyse von β-galactosiden (z. B. Laktose) in seine Monosaccharide (Glukose und Galaktose)5. Die am häufigsten verwendeten Substrat wird X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), ein Glykosid, das durch β-Galaktosidase geben Anlass zu 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole und Galactose hydrolysiert wird. Die erste ist in ein Dimer oxidiert, bei Verwendung in Kombination mit Kalium Ferri- und Ferro-Cyanid, produziert eine charakteristische unlöslich, blauer Farbe Niederschlag (Abbildung 1)6.

Das LacZ gen begonnen, als ein Reportergen vor über dreißig Jahren verwendet werden7,8. In der Regel LacZ eingefügt nachgeschaltet eine endogene Veranstalter an die Stelle der offenen Leserahmen, sodass es in Zelle und bakterielle Kultur, Zellen mit einem bestimmten Einsatz zu visualisieren sowie bei transgenen Tieren als Tracer von endogenen verwendet werden kann gen Expressionsmuster während Entwicklung9. In diesem Zusammenhang ist die Visualisierung der β-Galaktosidase Aktivität beträchtlich in Drosophila benutzt worden, um zu verstehen, die Entwicklungs- und zelluläre Prozesse aus einzelnen Zellen ganze Gewebe. Drosophila Genetik zugunsten die Generation stabile Linien, in denen eine modifizierte P-Element Konstrukt, enthält das Reportergen LacZ ist nach dem Zufallsprinzip Standorte im Genom eingefügt. So kann wenn unter dem Einfluss von Enhancer-Elemente platziert es seinen Ausdruck Gewebe gezielt, fahren, die die systematische Analyse der Expressionsmuster vieler Gene während den vergangenen zwei Jahrzehnten10erlaubt hat. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von transgenen Mäusen LacZ -gen-Expression zu überwachen auch Erkennung von Gen rekombinationsereignisse von Cre-LoxP vermittelte Rekombination und Lokalisierung der mutierten embryonalen Stammzellen Derivate in Chimären Analysen 11, erleichtert die Kontrolle des LacZ Ausdruck in bestimmten Geweben sowie wie zeitlich. Auch kann im ganzen Embryonen, Erkennung der β-Galaktosidase Aktivität differentielle Färbung Muster bei verschiedenen Intensitäten produzieren, die bequem in verschiedenen Entwicklungsstadien zu zeitliche Veränderungen in der Genexpression analysieren beobachtet werden können 8,12.

In diesem Artikel präsentieren wir ein Protokoll zur Genexpression durch X-gal visualisieren im ganzen Berg Gewebe in frühen Entwicklungsstadien von mäuseembryonen Färbung. Wir präsentieren diese histochemische Methode als eine hochempfindliche und kostengünstige Technik, die präzise Erkennung der markierten Zellen im ganzen Mount Proben oder auf zellulärer Ebene begünstigt, nachdem Paraffin Gewebe oder Embryonen eingebetteten. Die Methode ermöglicht die direkte Visualisierung der Färbung im Maus-Gewebe mit dem minimalen Hintergrund im Vergleich zu anderen Methoden13.

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Protokoll

Alle experimentelle Verfahren wurden vom Ausschuss für Ethik von Tierversuchen CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) und der Comunidad Autónoma de Madrid gewährleisten minimalen Tierleid genehmigt.

1. Sammlung von Embryonen von schwangeren Mäusen (von E8.5 bis E12.5)

  1. Schwangere Mäusen durch zervikale Dislokation oder CO2 -Inhalation zu opfern. Am Tag der ersten beobachtet vaginalen Stecker galt embryonalen Tag 0,5 (E0.5).
  2. Legen Sie das Tier in der Rückenlage auf das Saugkissen und reinigen Sie die Bauchhaut der Maus mit 70 % Ethanol.
    Hinweis: Sterilität ist in den folgenden Schritten nicht erforderlich.
  3. Kneifen Sie und heben Sie die Bauchhaut mit Maus-Zahn-Pinzette.
  4. Machen Sie einen Schnitt durch die Haut und die Bauchdecke, 2 bis 4 cm vertikal über der Mittellinie des Bauches mit einer chirurgischen Schere.
  5. Setzen Sie den Bauch und entfernen Sie die uterine Hörner von der Mutter mit Zange schneiden Blutgefäße entlang der inneren Krümmung des Uterus mit Chirurgische Schere.
  6. Entfernen Sie die Zeichenfolge von Embryonen und überträgt es auf einer Petrischale auf Eis mit 10 mL eiskaltes 0,01 M Phosphat-Puffer Kochsalzlösung pH-Wert 7,4 (PBS).
  7. Die Embryonen aus der Gebärmutter unter einem Stereomikroskop in einer Petrischale mit 10 mL frisches eiskaltem PBS sorgfältig zu sezieren. Fassen Sie die muskelwand mit Uhrmacher Pinzette die Fruchtblase aussetzen und dann reißen Sie die amniotische Membrane um die eingeschlossenen Embryo und der Dottersack mit den Spitzen der Zange zu entfernen.
  8. Sammle die stellt Embryonen von schwangeren Mäusen in frühen Stadien (von E8.5 bis E12.5) (Abbildung 2).
  9. Transfer der Embryonen nach ein frisches Gericht mit 10 mL kalten 1 X PBS mit gebogenen Pinzette oder für sehr kleine Embryonen (E8.5-E9.5), Kunststoff Transfer Pipetten verwenden, um die Proben ohne Embryo Schaden nehmen.
  10. Vor dem Start der Fixierung nehmen Sie eine embryonale Probe in einem Microcentrifuge Schlauch für die Genotypisierung indem Sie schneiden ein kleines Stück des Embryos oder die amniotische Membrane in die kleinste Embryonen (von E8.5 bis E9.5) mit der Uhrmacher Pinzette.
    Hinweis: LacZ Genotypisierung wird bestimmt durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Primer: vorwärts, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; umkehren, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.

2. Fixierung von Mäuseembryonen

  1. Übertragen Sie jeder Embryo in einem 2 mL Microcentrifuge Schlauch mit einer runden Basis, enthält 1 mL 1 X PBS.
    Hinweis: Führen Sie alle Schritte im Protokoll dieser Röhren unter Rühren mit einem rollenden Shaker.
  2. Waschen Sie die Embryonen mit 1 X PBS-Puffer für 1 min bei Raumtemperatur, das restliche Blut zu beseitigen. Einsatz Kunststoff Transfer Pipetten, Flüssigkeiten in den Rohren zu ändern.
  3. Befestigen Sie den Embryo in 1 mL 0,125 % Glutaraldehyd auf Eis.
    Hinweis: Die Zeit der Befestigung hängt von der Größe des Embryos: 20 min für E8.5-E9.5 Embryonen, 30 min für E10.5 Embryonen und 1 h für E12.5 Embryonen.
  4. Entfernen Sie das Fixiermittel zu und waschen Sie die Embryonen in 1 X PBS zweimal für 10 min bei Raumtemperatur vor der Verarbeitung der Probenmaterials für X-gal-Färbung.

(3) ganze Mount β-Galaktosidase Histochemie von Mäuseembryonen

  1. Bereiten Sie X-Gal spülen Puffer und X-Gal-Färbelösung vor Beginn des Verfahrens (siehe Tabelle 1 und Tabelle der Materialien). Verwenden Sie ein Wildtyp (WT) stellt Embryonen als Negativkontrollen für die enzymatische Reaktion.
  2. Inkubieren Sie die Embryonen im X-Gal spülen Puffer für 10 min bei Raumtemperatur (Abbildung 2).
  3. Inkubieren Sie die Embryonen in X-Gal-Färbelösung 2 h über Nacht bei 37 ° C, vor Licht geschützt werden. Überwachen Sie die Farbreaktion in regelmäßigen Abständen über einen sezierenden Mikroskop bis ausreichender Intensität der Blaufärbung ohne den Hintergrund des Embryos beobachtet wird. Halten Sie den pH-Wert der Lösung zwischen 8 und 9, Hintergrund während der ganzen Färbung zu reduzieren. Wenn die Färbelösung Licht zu drehen beginnt, ersetzen sie durch frisches Substrat-Lösung, die enzymatische Reaktion zu verlängern.
  4. Die Reaktion zu stoppen, wenn das gewünschte Signal entsteht durch Waschen Embryonen in einem Microcentrifuge Schlauch mit 1 mL 1 X PBS zweimal für 10 min bei Raumtemperatur.
  5. Transferieren Sie die gefärbte Embryonen zu 1 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) zu beheben, neu für 1 h bei 4 ° c über Nacht
    Hinweis: Embryonen können gespeichert werden, bei 4 % PFA/PBS für längere Zeit bei 4 ° C oder für Schnitt sofort verarbeitet werden können. Dieser endgültige Fixierung-Schritt ist entscheidend für den langfristigen Erhalt des Musters Färbung.
  6. Waschen Sie die Embryonen in 1 mL 1 X PBS zweimal für 10 min bei Raumtemperatur.
  7. Option 1: Deaktivieren Sie Embryonen durch Eintauchen in eine Reihe von Lösungen mit steigenden Konzentrationen des Glycerins (20 %, 40 %, 60 % und 80 % Glycerin in 1 X PBS) für 1 h bei Raumtemperatur in jeder Lösung.
    Hinweis: Waschen Embryonen in 80 % Glycerin für längere Zeit, sogar Tage, bis sie gelöscht werden, und dann Sie sie in 80 % Glycerin bei 4 ° C bei diesem Schritt (Abbildung 2 speichern). Eine sehr kleine Menge von Natrium-azid Ora Kristall von Thymol hinzufügen die Embryonen, die bei 4 ° C in Glycerin oder 1 X gespeichert wird PBS empfohlen, um Schimmelbildung zu verhindern. Nach der Reinigung, können ganze Berg Embryonen verwendet werden, für das Fotografieren (Schritt 4).
  8. Option 2: Prozess Embryonen für Paraffin einbetten und Schneiden mit einem Mikrotom (Abbildung 2). Dokumentieren Sie das Muster des Ausdrucks im ganzen gefärbten Embryonen vor schneiden (Schritte 4 und 5).

4. Fotografie der ganze Berg Embryonen

  1. Ganzen Berg gebeizt Embryonen vor dem Schneiden zu fotografieren, übertragen Sie sie auf einer Petrischale vorbereitet mit einer Grundfläche von verfestigt 1-2 % Agarose in 1 X PBS.
  2. Decken Sie den Embryo komplett mit 10 mL 1 X PBS in der Agarose-beschichtete Gerichte, Dehydrierung und Reflexion beim Fotografieren durch die Flüssigkeit zu verhindern.
  3. Den Embryo mitten in 1 X PBS mit Pinzette zu orientieren. Machen Sie für ältere Embryonen (E10.5-E12.5) ein kleines Loch in der Agarose mit Zangen, platzieren und positionieren Sie die Probe innerhalb es in verschiedenen Winkeln und der frei schwebenden beim Fotografieren zu vermeiden.
  4. Legen Sie die Schale auf der Bühne Stereomikroskop mit übertragen (unter Stufe) Licht. Wechsel zwischen "dunkel-Feld" und "Hellfeld" Anpassungen, legen Sie die gewünschte Beleuchtung beim Fotografieren und die Lichtdurchlässigkeit der Probe zu optimieren.
    Hinweis: Verwenden Sie Fiber optic Beleuchtung für späteren Zeitpunkt Embryonen Reflexion an der Oberfläche des Embryos zu vermeiden. Beim Fotografieren von gerodeter Embryos das gleiche Verfahren aber übertragen Sie sie auf einer Petrischale mit 100 % Glycerin und tauche sie ein vollständig.

(5) Paraffin einbetten und Schneiden von X-gal gebeizt Embryonen

  1. Paraffin Wachs einbetten
    1. Entfernen Sie die X-gal gebeizt Embryonen von 4 ° C (Schritt 3.5) zu und waschen Sie sie mit 1 mL 1 X PBS dreimal um die Überschreitung des fixiermittels zu beseitigen.
    2. Übertragen Sie jedes Embryo eine Histologie-Kassette mit Pinzette.
    3. Legen Sie die Kassetten mit den Embryonen in ein Becherglas und dann austrocknen, indem man sie durch eine abgestufte Ethanol-Reihe bei Raumtemperatur: 70 % Ethanol, einmal für 30 min; 96 % Ethanol, zweimal für jeweils 30 min.; 100 % Ethanol, zweimal für jeweils 30 min..
      Hinweis: Embryonen können für eine unbestimmte Zeit bei 4 ° C bis der Dehydrierung beginnen in 70 % igem Ethanol gespeichert werden.
    4. Inkubieren Sie die ganze Kassette in Isopropanol für 30 min bei Raumtemperatur.
    5. Übertragen Sie durch die Verwendung einer Pinzette die Kassetten zu einem Glas Färbung Trog mit vorgewärmten Isopropanol und im Ofen bei 60 ° C für 30 min lassen.
    6. Legen Sie die Kassetten in ein neues Glas Färbung Trog mit einer Mischung aus 50 % Isopropanol / 50 % Paraffinwachs geschmolzen und für 4 h in einem 60 ° C Ofen verlassen.
    7. Inkubieren Sie die Kassetten mit den Embryonen mit zwei Änderungen von geschmolzenem Paraffinwachs, 30 min bei 60 ° C.
    8. Am Ende des letzten Paraffin waschen Öffnen der Kassette und jedes Embryo eine separate Gewebe einbetten Form, um die Probe unter einem Stereomikroskop zu übertragen.
    9. Füllen Sie den Brunnen mit geschmolzenem Paraffinwachs bei 60 ° C. Verwenden Sie beheizte Zangen halten das Wachs geschmolzen und vorsichtig den Embryo in der Form orientieren.
      Hinweis: Die korrekte Ausrichtung der Probe ist ein entscheidender Schritt für den Embryo in der gewünschten Fläche schneiden.
    10. Bevor Paraffin in der Kokille erstarrt, legen Sie eine Kassette ohne Deckel oben auf dem Block und füllen Sie es mit geschmolzenem Paraffinwachs. Lassen Sie das restliche Wachs Abkühlen bis über Nacht bei Raumtemperatur erstarrt.
    11. Sobald das Paraffin vollständig erstarrt ist, entfernen Sie den massiven Block aus der Form und speichern Sie der Paraffin-Blöcke bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C bis14-Schnitt.
  2. Paraffin-Schnitt
    1. Richten Sie das Blade am Mikrotom und 5-7 µm Dicke eingerichtet. 5.2.2. kühlen Sie paraffinblock auf dem Eis ab und schneiden Sie es um einen Würfel oder eine Pyramide zu produzieren.
    2. Das Mikrotom-Inhaber zuordnen Sie den Block mithilfe eine kleine Menge geschmolzenes Wachs.
    3. Die Block für den optimalen Schnitt zu orientieren. Abschnitt der Paraffin-Blöcke in 5-7 µm dicke Scheiben bei Raumtemperatur mit standard Mikrotom.
    4. Mit einem feinen Pinsel, legen Sie die Abschnitte in einem Wasserbad bei Raumtemperatur für Manipulation und Scheiben auswählen.
    5. Abschnitte aus dem Wasserbad mit einem Mikroskop-Objektträger abholen und in einem Wasserbad bei 42 ° C für stretching überführen.
    6. Abschnitte aus dem Wasserbad nehmen und vorsichtig auf Adhäsion Objektträger legen.
    7. Trocknen Sie die Folien auch in einem Ofen bei 37 ° C über Nacht zu den Abschnitten vollständig einzuhalten, andernfalls können sie verloren gehen während der Färbung.
      Hinweis: Bewahren Sie die Folien bei 4 ° C bis Färbung Verfahren ab.
  3. 4.wenn und X-Gal-gefärbten Paraffin Abschnitte Gegenfärbung
    1. Legen Sie die Folien auf einem Objektträger Tablett in einem Ofen bei 60 ° C für mindestens 45 Minuten, das Paraffinwachs flüssiger zu machen.
    2. Übertragen Sie die Folien auf einem Gestell und Glas Färbung Gerichte verwenden, um die folgenden Schritte ausführen: Tauchen Sie die Zahnstange in die färbeküvetten mit Alkoholen der abnehmenden Konzentrationen für komplette Paraffin entfernen und Hydratation des Gewebes: Isopropanol für 5 min bei 60 ° C; Isopropanol für 3 min; 100 % Ethanol für 2 min; 96 % Ethanol für 1 min; 70 % Ethanol für 1 min bei Raumtemperatur.
    3. Spülen Sie Abschnitte in destilliertem Wasser zweimal, um sicherzustellen, dass es keine Alkohol-Rückstände gibt.
    4. Gegenfärbung Abschnitte mit einem Fleck (z.B. Nuclear-schnell rot-Lösung) für 5 min (in der Regel zwischen 3-8 min) bei Raumtemperatur (Abbildung 2).
      Hinweis: Diese Färbung hilft, um allgemeine Gewebestruktur in den Abschnitten zu offenbaren.
    5. Nach dem Färben, waschen Sie die Folien in destilliertem Wasser für 1 min und überprüfen Sie Abschnitt Färbung im Mikroskop zu.
      Hinweis: Wenn die gewünschte Färbung zu schwach ist, Abschnitte gegenfärbung wieder für eine längere Zeit.
    6. Abschnitte in der folgenden Serie mit steigenden Konzentrationen von Ethanol zu entwässern: zwei Wäschen in 95 % igem Ethanol für 2 min, zwei wäscht in 100 % igem Ethanol für 2 min, und um zu vermeiden, löst die blaue Farbe ausfällt, nur eine schnelle Wäsche in Xylol.
    7. Entfernen Sie die Folien aus dem Rack eins nach dem anderen, und legen Sie sie auf ein Stück Papier. Dann schieben Sie Mount und Deckglas mit einem synthetischen, dauerhafte Montage Medium.
      Hinweis: Xylol Produkt ist ein brennbarer deren Dämpfe ärgerlich und schädlich für die menschliche Gesundheit und für Wasserorganismen sind. Es muss innerhalb einer Kapuze manipuliert werden und erfordert den Einsatz der richtigen Schutzausrüstung.

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Ergebnisse

Hier zeigen wir die Ergebnisse aus der Anwendung der standard-Protokoll für die β-Galaktosidase histochemische Reaktion mit X-gal als das Substrat im ganzen mausembryonen (Abbildung 1 und Abbildung 2). Mithilfe dieses Protokolls untersuchen wir Membran Typ 4-Matrix-Metalloproteinase (Mt4-Mmp) Ausdruck in unterschiedlichen embryonalen Entwicklungsstadien (E9.5, E11.5 und E12.5) mit Mt4-Mmp mutierte Mäuse, die die LacZ-Reporter ...

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Diskussion

Das E. Coli LacZ gen hat als Reporter im Studium der Gen-Expression-Muster aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit und einfache Erkennung verbreitet. Dieses Protokoll beschreibt eine klassische Methode zur Erkennung von β-gal Ausdruck basiert auf einer enzymatischen Reaktion, das einfach und schnell sowie kostengünstig durchführen. Diese Methode kann auch ohne große Änderungen im ganzen Berg Embryonen, intakt Organe, Kryostat Gewebeschnitte oder kultivierten Zellen angewendet werden.

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierendes finanzielles Interesse haben.

Danksagungen

Wir möchten die histopathologische Service für ihre technische Unterstützung an das Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) bedanken. Wir danken auch Dr. Motoharu Seiki freundlicherweise die Mt4-MmpLacZ -Mäuse und Dr. Alicia G. Arroyo für unser Projekt zu unterstützen und ihre kritische Lektüre des Manuskripts. Wir wünschen Peter Bonney für Korrekturlesen dieses Artikels danken. Diese Arbeit wurde von Universidad Europea de Madrid durch ein Stipendium (# 2017UEM01), C.S.C unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
2-PropanolSIGMA-ALDRICH24137-1L-R
AgaroseSCHARLAU50004/ LE3Q2014
Aqueous mounting mediumVECTOR LABSH-5501
Synthetic mounting mediaMERCK100579
96% EthanolPROLABO20824365
99.9% Ethanol absoluteSCHARLAUET00021000
50% Glutaraldehyde solutionSIGMA-ALDRICHG6403-100ml
85% GlycerolMERCK104094
99.9% GlycerolSIGMA-ALDRICHG5516
Magnesium chloride hexahydrateSIGMA-ALDRICH63064
Nonionic surfactant (Nonidet P-40)SIGMA-ALDRICH542334
Nuclear Fast Red counterstainSIGMA-ALDRICHN3020
Paraffin pastillesMERCK111609
ParaformaldehydeSIGMA-ALDRICH158127-500g
Phosphate buffered saline (tablets)SIGMA-ALDRICHP4417-50TAB
Potassium ferrocyanateMERCK1049840500
Potassium ferrocyanideMERCK1049731000
Sodium azideSIGMA-ALDRICHS8032
Sodium deoxycholateSIGMA-ALDRICH30970
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateSIGMA-ALDRICH106346
Sodium phosphate dibasic dihydrateSIGMA-ALDRICH71638
ThymolSIGMA-ALDRICHT0501
Tris hydrochloride (Tris HCl)SIGMA-ALDRICH10812846001 (Roche)
X-GALVENN NOVAR-0004-1000
XyleneVWR CHEMICALSVWRC28973.363
EQUIPMENT
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mmSAKURA4566
Rotatory MicrotomeLeicaRM2235
CassettesOxford TradeOT-10-9046
Microscope Cover Glasses 24x60 mmVWRECN631-1575
Microscope slidesThermo Scientific, MENZEL-GLÄSERAGAA000001#12E
Adhesion microscope slidesThermo Scientific, MENZEL-GLÄSERJ1820AMNZ
Flotation Water bathLeicaHI1210
Disposable Low Profile Microtome BladesFeatherUDM-R35
Paraffin ovenJ.R. SELECTA2000205
Wax Paraffin dispenserJ.R. SELECTA4000490
StereomicroscopeLeicaDM500
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mLSIGMA-ALDRICHT2795
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mLSIGMA-ALDRICHT9661
Orbital shakerIKA LabortechnikHS250 BASIC
Stirring Hot PlateBibbyHB502
Vortex ShakerIKA LabortechnikMS1
Laboratory scaleGRAMFH-2000
Precision scaleSartoriusISO9001
pHmeterCrisonBasic 20
Optic fiberOptechPL2000

Referenzen

  1. Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
  2. Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182(1994).
  3. Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
  4. Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
  5. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  6. Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
  7. Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
  8. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  9. Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767(2017).
  10. Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
  11. Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
  12. Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
  13. Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
  14. Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797(2011).
  15. Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
  16. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  17. Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
  18. Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
  19. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
  20. Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
  21. Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
  22. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
  23. Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
  24. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  25. Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
  26. Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
  27. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
  28. Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937(2013).
  29. Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
  30. Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
  31. Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
  32. Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
  33. Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
  34. Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
  35. Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
  36. Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
  37. Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
  38. Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
  39. Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
  40. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  41. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  42. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  43. Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
  44. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).

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