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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Eine einfache, vielseitige und preisgünstige in-vitro- Hydrokultur-System wurde erfolgreich optimiert und ermöglichen umfangreiche Experimente unter sterilen Bedingungen. Dieses System erleichtert die Anwendung von Chemikalien in einer Lösung und deren effiziente Absorption von Wurzeln für molekularen, biochemischen und physiologischen Studien.

Zusammenfassung

Eine Vielzahl von Studien in Pflanzenbiologie werden mit hydroponischen Kulturen durchgeführt. In dieser Arbeit wird ein in-vitro- Hydroponische Wachstum System für die Bewertung der Pflanze Reaktionen auf Chemikalien und anderen Stoffen von Interesse vorgestellt. Dieses System ist höchst effizient in homogenen und gesunde Setzlinge der C3 und C4 Modell Spezies Arabidopsis Thaliana und Setaria Viridis, bzw. zu erhalten. Der sterile Anbau vermeidet Algen und Mikroorganismen Kontamination, die limitierende Faktoren für Anlage normales Wachstum und Entwicklung in Hydrokultur bekannt sind. Darüber hinaus ist dieses System skalierbar, ermöglicht die Ernte von Pflanzenmaterial in großem Maßstab mit kleinere mechanische Schäden als auch die Ernte der einzelnen Teile einer Pflanze, falls gewünscht. Ein detailliertes Protokoll zeigt, dass dieses System verfügt über eine einfache und kostengünstige Montage, da sie Pipette Racks als wichtigste Plattform verwendet für den Anbau von Pflanzen, steht zur Verfügung. Die Durchführbarkeit dieses Systems war mit Arabidopsis Sämlinge zur Beurteilung der Wirkung des Medikaments AZD-8055, eine chemische das Ziel von Rapamycin (TOR)-Kinase-Inhibitor validiert. TOR-Hemmung wurde effizient so früh wie 30 min nach einer AZD-8055-Behandlung in Wurzeln und Triebe erkannt. Darüber hinaus angezeigt AZD-8055-behandelten Pflanzen den erwarteten Stärke-Überschuss-Phänotyp. Wir diese Hydrokultur-System als eine ideale Methode für Pflanzenforscher mit dem Ziel, die Wirkung der Pflanze Induktoren oder Inhibitoren, sowie zu überwachen, bewerten metabolischen Flüsse mit Isotopen-Kennzeichnung Verbindungen, die in der Regel erfordert die Verwendung von teuren vorgeschlagen Reagenzien.

Einleitung

Die Vorteile der Verwendung von Hydrokultur Pflanzen haben in der Produktion von großen und einheitliche Pflanzen ermöglichen reproduzierbare Experimente1,2,3weithin anerkannt. In diesem System kann die Zusammensetzung der Nährlösung ordnungsgemäß kontrolliert und recycelt alle Stufen von Wachstum und Entwicklung. Darüber hinaus sind Wurzeln nicht abiotischen Belastungen ausgesetzt, wie im Boden gewachsen Pflanzen, wie Nährstoff Hunger und Wasser-Mangel4auftreten können. Als Pflanzen hydroponisch vorliegende morphologische und physiologische Eigenschaften ziemlich ähnlich denen in Erde kultiviert hat dieses System im großen und ganzen in der Forschung tätig weil es erlaubt, die Überwachung der Wurzel/Sprosswachstum und ihre Ernte ohne Verletzungen2,5.

Aufgrund der Möglichkeit der Änderung der Zusammensetzung und Konzentration von der Nährlösung der Großteil der Forschung mit Hydrokultur Bedingungen durchgeführt wurde, um die Funktionen von Mikro- und Makronährstoffen1,3 charakterisieren ,6,7,8. Allerdings hat dieses System erwies sich als sehr nützlich, um ein breites Anwendungsspektrum in Pflanzenbiologie, wie die Funktionen von Hormonen und Chemikalien in Pflanzen aufzuklären. Zum Beispiel wurden die Entdeckung des Strigolactones als eine neue Klasse von Hormonen9 und der beschleunigten Wachstums Phänotyp ausgelöst durch Brassinosteroid Anwendung10 Hydrokultur Bedingungen durchgeführt. Darüber hinaus ermöglicht dieses System Experimente mit beschrifteten Isotope (z.B., 14N /15N und 13CO2)11,12 , deren Eingliederung in Proteinen und Metaboliten zu bewerten durch Massenspektrometrie.

In Anbetracht der Bedeutung dieses Systems in der Pflanzenforschung, eine hohe Anzahl von hydroponischen Kulturen wurde in den letzten Jahren, einschließlich Systeme, mit denen (i) die Übertragung der Sämlinge aus Platten auf Hydrokultur Container3, 13; (Ii) Rockwool, die Zugang zu den frühen Stadien der Wurzel Entwicklung2,14,15begrenzt; (Iii) Polyethylen-Granulat als Schwimmkörper, wodurch die einheitliche Anwendung der kleinen Moleküle/Behandlungen schwierig16; oder (iv) eine reduzierte Anzahl von Pflanzen9,17. Das Volumen der Hydrokultur Panzer beschrieben in vielen dieser Protokolle sind in der Regel groß (kleine Volumen von 1-5 L, bis zu 32 L)18, die die Anwendung von Chemikalien extrem teuer macht. Obwohl einige Studien eine Hydrokultur unter aseptischen Bedingungen8,beschreiben ist19, die Montage des Systems in der Regel ziemlich mühsam, bestehend aus die perfekte Abstimmung von Nylon Maschen in Kunststoff oder Glas Container5,8,17,20.

Wegen der Bedeutung als Modellpflanze Arabidopsis Thaliana wurden die Mehrheit der Hydroponik-Systeme für diese Arten1,2,8,14,18, entwickelt. 19 , 20. Dennoch gibt es einige Studien, die die Hydroponische Wachstum Berichtsfunktionen anderer Pflanzenarten mit eine Vorbehandlung der Samen ihre Keimfähigkeit zu verbessern und Synchronisation Preise in-vitro-8,16 . Um im großen Maßstab zu arbeiten, entwickelten wir ein Protokoll für eine einfache und kostengünstige Wartung Hydrokultur-System, mit dem sterile Bedingungen für den Anbau von Pflanzen, darunter A. Thaliana und andere Arten, wie der Rasen Setaria kann einrichten Viridis. Die hier beschriebene Methode eignet sich für verschiedene Experimente, wie das Wachstum des Keimlings maximiert, synchronisiert und leicht überwacht werden kann. Dieses System hat viele Vorteile wie: (i) die Montage ist unkompliziert und seiner Komponenten wiederverwendet werden; (Ii) es ermöglicht die einfache Anwendung von verschiedenen Chemikalien in das flüssige Medium; (Iii) die Sämlinge Keimen und wachsen direkt in das Kulturmedium ohne die Notwendigkeit der Übertragung der Hydrokultur-System; (iv) das schießen und Wurzel Entwicklung/Wachstum eng überwacht werden können und die Keimlinge geerntet werden, ohne Schäden; und (V) es macht es möglich, auf einer großen Skala arbeiten Aufrechterhaltung der physiologischen Bedingungen.

Protokoll

1. Vorbereitung von flüssigen und festen Nährmedien

  1. Bereiten Sie ein flüssiges Medium mit Hälfte-Stärke Murashige und Skoog (MS) Medium mit Vitaminen [0,0125 mg/L von cobalt(II) chlorid Pentahydrat, 0,0125 mg/L Sulfat-Pentahydrat Kupfer(II), 18,35 mg/L Eisen Natrium Ethylenediaminetetraacetate, 3,10 mg/L Borsäure, Kaliumjodid, 8,45 mg/L Mangan 0,415 mg/L Sulfat Monohydrat, 0,125 mg/L Natrium Molybdat Dihydrat, 4,30 mg/L von Zinksulfat-Heptahydrat, 166,01 mg/L Kalzium-Chlorid, 85 mg/L Kalium Dihydrogen Phosphat, 950 mg/L Kaliumnitrat, 90,27 mg/L Magnesium-Sulfat, 825 mg/L von Ammoniumnitrat, 1 mg/L von Glycin, 50 mg/L von Myo-Inositol, 0,25 mg/L von Nikotinsäure, 0,25 mg/L von Pyridoxin Hydrochlorid und 0,05 mg/L von Thiamin Hydrochlorid] ergänzt mit 0,25 g/L MES, und passen Sie den pH-Wert auf 5,8 mit 10 M KOH.
  2. Fügen Sie 10 g/L Agar, ein halb-Stärke MS-Solid Medium zu machen. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min vor dem Gebrauch des Mediums.

(2) hydroponic System Montage

Hinweis: Diese Schritte sorgfältig befolgt werden um die hydroponic System zu bauen.

  1. Materiellen Sterilisation
    1. Verpacken Sie in den Autoklaven Tasche die PIPETTENSPITZE Racks (ohne Deckel), die als Minitanks verwendet werden. Autoklaven der Racks bei 121 ° C für 20 min, 15 Psi.
      Hinweis: Das Polypropylen Pipette Tipp Rack wir verwendet hatten folgenden Dimensionen: 120 mm (Länge) x 89 mm (Breite) x 55 mm (Höhe). Die Pipette Spitze flache Oberfläche muss einen Bereich für den Zusatz von Kulturmedium aufweisen. Andere Tipp-Racks verwendet werden (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: Während die Montage des hydroponischen Systems ist es notwendig, eine laminare Strömung Haube, verwenden die gereinigt und mit 70 % igem Ethanol vor dem Gebrauch desinfiziert werden müssen. Der Experimentator muss einen Laborkittel zu tragen, waschen Sie ihre Hände und ausgesetzt Haut und mit 70 % Ethanol zu desinfizieren. Handschuhe sind optional, mit Ausnahme der Zulassungsantrag.
    2. Reinigen Sie alle Zubehörteile, die beschriebenen (Einweg-Kunststoff-Boxen, Klebeband, Pipetten, Scheren und Pinzetten) mit 70 % Ethanol vor dem Betreten der Laminar-Flow-Haube. Wenn die Haube erlaubt, schalten Sie das UV-Licht für 10 min vor der Montage der Hydrokulturen-Systems um den Arbeitsbereich dekontaminiert zu halten.
  2. Minitank Montage
    1. Versiegeln Sie die Oberfläche der Pipettenspitze flach mit Klebeband (Abbildung 1 b). Wenn möglich, lassen Sie es unter UV-Licht für 10 Minuten.
    2. 180 µL geschmolzene solide MS Kulturmedium (leicht warm) hinzu kommt jeder gut mit einer Mehrkanal-Pipette (Abbildung 1).
      Hinweis: Wenn Sie viele Panzer vorbereiten, verwenden Sie eine Herdplatte um zu verhindern, dass die MS Medium erstarren.
    3. Lassen Sie das Medium vollständig (für ca. 30 min) zu festigen.
      Hinweis: Zur Zeit der Erstarrung kann das UV-Licht eingeschaltet werden.
    4. Füllen Sie die Pipette Tipp Rack komplett mit flüssigem MS Kulturmedium (Abbildung 1) und stellen Sie sicher, es ist ein enger Kontakt zwischen der festen und flüssigen Medien.
    5. Entfernen der Klebebänder der oberen Oberfläche des flachen Pipettenspitze und sorgfältig auf das Gestell passt. Hydrokultur-System ist jetzt bereit, die sterilisierten Samen zu empfangen.

3. Samen Sterilisation

  1. Legen Sie 500 Arabidopsis Samen in einem 1,5 mL reaktionscup. Verwenden Sie möglichst viele mikroröhrchen nach Bedarf entsprechend der Anzahl der Pflanzen für das Experiment benötigt.
  2. Waschen Sie die Samen mit 70 % Ethanol, 2 min mit einer sanften Bewegung. Lassen Sie die Samen niederzulassen, dann entfernen Sie vorsichtig das Ethanol.
  3. Fügen Sie 1 mL einer 10 % Natriumhypochlorit-Lösung mit 2 µL Polysorbat 20 Reinigungsmittel. Schütteln Sie der Lösung für 5 min. entfernen die Lösung sorgfältig.
  4. Spülen Sie die Samen mit sterilem destilliertem Wasser, bis alles, was die Bleichmittel Rückstände vollständig ist (ca. 5 X) entfernt.
    Hinweis: Nach der Oberfläche Sterilisation, die Samen wurden in sterilem destilliertem Wasser eingetaucht und geschichtet bei 4 ° C im Dunkeln für 5D um die Keimung zu synchronisieren.
    Hinweis: Samen von Setaria Viridis (Beitritt A10.1) wurden preincubated in konzentrierter Schwefelsäure für 15 min (, die physische Keimruhe zu brechen), in sterilem destilliertem Wasser gründlich gewaschen und dann mit einer 5 % igen Natriumhypochlorit-Lösung disinfested 0,1 % Polysorbat 20 für 5 min mit einer sanften Bewegung21enthalten. Die verbleibenden Schritte der Sterilisation waren identisch mit denen für Arabidopsis Samen beschrieben.

(4) Seed-Anwendung

  1. Schneiden Sie leicht der Extremität von 200 µL Tipp mit Hilfe von einem sterilen Skalpell.
  2. Pipette die Arabidopsis -Samen in festen Nährmedium auf der oberen Fläche der Pipettenspitze flach. Achten Sie darauf, dass das Medium nicht aus der Wohnung lösen kann; andernfalls die Samen schattiert und die Sämlinge wachsen nicht richtig (Abbildung 1E).
    Hinweis: Verwenden Sie eine sterile Pinzette für Setaria Samen (mit dem Embryo nach oben positioniert).
  3. Speichern Sie so viele Minitanks wie möglich innerhalb einer Einweg-Kunststoff-Box, eine hohe Luftfeuchtigkeit und die Umgebung frei von Mikroorganismen (Abbildung 1F) halten.
  4. Der Einweg-Kunststoff-Box, sorgfältig mit Klebeband zur Vermeidung von Kontaminationen zu versiegeln.
  5. Legen Sie die Hydroponische Systeme in ein Wachstum Kammer mit den geeigneten Wachstumsbedingungen für die Anlage von Interesse.
    Hinweis: In dieser Arbeit wurden die folgenden Bedingungen verwendet: 75 % Luftfeuchtigkeit und 150 µmol m-2 s-1 Bestrahlungsstärke und äquatorialer Bedingungen von 12 h Licht (21 ° C) / 12 h dunkel (19 ° C) für Arabidopsisoder 300 µmol m-2 s-1 Bestrahlungsstärke und 12 h Licht (28 ° C) / 12 h dunkel (25 ° C) für Setaria (Abbildung 1 und 1 H).

(5) Validierung die Verwendung von diesem Hydroponic System Target of Rapamycin-Kinase hemmen

Hinweis: Diese Hydrokultur-System wurde ursprünglich entwickelt, um die Verwaltung von Chemikalien zu Pflanzen, zu erleichtern, sind im Allgemeinen sehr teuer in groß angelegten Experimenten angewendet werden. Als ein Proof of Concept wurde die ATP-kompetitiver Inhibitor AZD-8055, das bekannt ist, gezielt die ATP-Bindungsstelle des TOR Protein Kinase22, eingesetzt, um die Unterdrückung der TOR-Aktivität in Sämlinge von A. Thaliana Columbia-0 (folgen Die Nottingham Arabidopsis Lager Zentrum, NASC-ID: N22681). Das verwendete Protokoll wird hier kurz beschrieben.

  1. Wachsen Sie Samen hydroponisch bis Bühne 1,04 nach dem BBCH skalieren23 (für etwa 11 d) unter den klimatischen Bedingungen, die oben beschriebenen. Ersetzen die Nährlösung, entweder mit frischen Medium mit 0,05 % DMSO (Kontrolle), 2 µM AZD-8055 (TOR-Inhibitor) verdünnt in DMSO oder ohne Behandlung (Mock), am Ende der Nacht (EN).
  2. Einige Sämlinge zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung zu ernten und in Wurzeln und Triebe zu trennen. Die Proben in flüssigem Stickstoff eingefroren, zu einem feinen Pulver in einer Roboter-Mühle zu mahlen (siehe Tabelle der Materialien), und das Pulver bei-80 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.
  3. Immunoblot gegen phosphorylierten und nicht phosphoryliert Formen der 40er Jahre ribosomale Protein S6 (RPS6) nach Dobrenel Et al. 24.
  4. Bleichen intakt Sämlinge für Probe Depigmentierung, in destilliertem Wasser zu waschen, tauche sie ein in eine Jod-Lösung für 5 min25und fotografieren die Sämlinge in ein Stereomikroskop (0,63 X Ziel, 20 X Annäherung und 7,5 X Größe) für eine qualitative Beurteilung des Stärkegehalts.
  5. Quantifizierung der Stärke nach der enzymatischen Abbau und Messung der freigesetzten Glucose spektralphotometrisch indem man es zur Reduktion von NADP+ an NADPH26,27.
  6. Führen Sie eine total RNA-Extraktion, eine cDNA-Synthese und quantitative RT-PCR-Assays wie beschrieben von Caldana Et al. 28 , die Expression von Genen im Zusammenhang mit verschiedenen Arten von Belastungen zu bewerten.
  7. Optional, wachsen Sie Sämlinge auf einem Gartenbau Substrat in plastiktöpfen mit einer 0,1 L Fassungsvermögen unter ähnlichen klimatischen Bedingungen [60 % Luftfeuchtigkeit, 150 µmol m-2 s-1 der Bestrahlungsstärke und äquatorialer Bedingungen von 12 h Licht (21 ° C) / 12 h dunkel (19 ° C [)] um diese mit Setzlingen hydroponisch vergleichen.
    Hinweis: Die Zielgene für die Gen-Expression-Assays verwendet wurden ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), und TPS5 (At4g17770) und deren Ausdruck Niveaus wurden normalisiert, beschäftigt die Delta-Ct Methode29 mit ACT2 (At3g18780) oder PDF2 (At4g04890) als die interne Referenz-Gene, vorausgesetzt 100 % der PCR-Amplifikation Effizienz über alle Proben. Die Oligonukleotid-Paare für die quantitative PCR verwendet wurden: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG) und PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).

Ergebnisse

TOR-Kinase ist ein wichtiger Regulator, der Nährstoff- und Förderung der Zellproliferation und Wachstum in allen Eukaryoten Signalisierung integriert. Bemühungen, TOR-Funktionen in Pflanzen aufzuklären beinhalten die Generation der Arabidopsis transgenen Linien mit TOR bedingte Unterdrückung durch RNA-Interferenz oder künstliche MicroRNA28,30,31, Angesichts den Embryo tödliche Ph?...

Diskussion

Diese optimierte Hydrokultur Struktur ermöglicht die erfolgreiche in-vitro- Kultur von Pflanzen. Die Samen keimen gut auf festem Medium an der Pipette Spitze flache Oberfläche, ein erheblicher Gewinn im Vergleich zu Systemen, wo die Samen mit der Nährlösung getränkt sind. Ein großer Vorteil dieses Systems ist, dass während der Sämling-Entwicklung, Wurzeln direkt in Kontakt mit dem flüssigen Medium ohne die Notwendigkeit der Übertragung. Darüber hinaus kann chemischer Behandlung leicht in das flüssige...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Forschungsgemeinschaft von São Paulo (FAPESP; Gewähren Sie 12/19561-0) und der Max-Planck-Gesellschaft. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14-3/10407), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), und Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) sind dankbar für die Stipendien. Die Autoren danken für die großzügige Bereitstellung von Antikörpern gegen RPS6 Christian Meyer vom Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, Frankreich). Die Autoren danken RTV UNICAMP und Ed Paulo Aparecido de Souza Manoel für ihre technische Unterstützung während der Audio aufzeichnen.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
EthanolMerck100983
Sodium hypochlorite solutionSigma-Aldrich425044
Polysorbate 20  Sigma-AldrichP2287
Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins Duchefa BiochemieM0222
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrateDuchefa BiochemieM1503
Agar Sigma-AldrichA7921
Potassium hydroxideSigma-Aldrich484016
Laminar flow hoodTelstarBH-100
HotplateARECF20510011
Growth chamberWeiss TechnikHGC 1514
Glass Petri dish (150 mm x 25 mm)Uniglass189.006
200 μL pipette tip racks KasviK8-200-5 *
300 μL multichannel pipetteEppendorf3122000060
300 μL pipette tipsEppendorf30073088
200 μL pipette Eppendorf3120000054
200 μL pipette tipsEppendorf30000870
ScissorsTramontina25912/108
TweezerABC Instrumentos702915
Scalpel bladeSigma-AldrichS2771
Adhesive transparent tape (45mm x 50m)Scotch 3M5803
Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H)Maxipac32771

Referenzen

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