Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Zusammenfassung

Die Unterscheidung von weiß und Beige Adipozyten aus Fettgewebe vaskulären Stammeltern trägt metabolische Verbesserungspotenzial bei Adipositas. Protokolle beschrieben für eine CD34 + CD31 + Endothelzellen losgelöst von menschlichen Fett und für eine spätere in-vitro- Erweiterung und Differenzierung in weiß und Beige Adipozyten. Mehrere downstream-Anwendungen werden diskutiert.

Zusammenfassung

Adipositas wird begleitet von einer umfangreichen Umbau des Fettgewebes in erster Linie über Adipocyte Hypertrophie. Extreme Adipocyte Wachstum führt ein schlechtes ansprechen auf Insulin, lokale Hypoxie und Entzündungen. Durch die Stimulierung der Differenzierung der funktionalen weiße Fettzellen aus Vorläuferzellen, radikale Hypertrophie der Adipocyte Bevölkerung verhindert werden kann und infolgedessen die metabolische Gesundheit des Fettgewebes verbessert werden kann, sowie eine Reduzierung der die Entzündung. Auch kann durch die Stimulierung einer Differenzierung der Adipozyten Beige/braun, der Ganzkörper-Energieaufwand erhöht werden, was zu Gewichtsverlust. Dieser Ansatz könnte die Entwicklung von Fettleibigkeit Komorbiditäten wie Diabetes Typ 2 und Herz-Kreislauf-Erkrankungen verhindern.

Dieses Papier beschreibt die Isolation, Erweiterung und Differenzierung der weiße und Beige Adipozyten aus einer Teilmenge von menschlichen Fettgewebe Endothelzellen, die die CD31 und CD34-Marker Co Ausdrücken. Die Methode ist relativ billig und nicht arbeitsintensiv. Es erfordert Zugang zu menschlichen Fettgewebe und das subkutane Depot eignet sich für die Probenahme. Für dieses Protokoll frisches Fettgewebe Proben aus krankhaft übergewichtigen Probanden [Body-mass-Index (BMI) > 35] werden während der bariatrischen Chirurgie Verfahren gesammelt. Mit einem sequentiellen Immunoseparation von den Stromazellen vaskulären Bruch, sind genügend Zellen von weniger als 2 – 3 g Fett hergestellt. Diese Zellen in Kultur über 10 – 14 Tage erweitert werden können, können kryokonserviert werden und behalten ihre Eigenschaften adipogenen mit bis zu 5 – 6 Durchgang passagierung. Die Zellen werden für 14 Tage mit einer adipogenen cocktail mit einer Kombination von Humaninsulin und PPARγ-Agonisten-Rosiglitazon behandelt.

Diese Methode kann verwendet werden, für den Erhalt der Nachweis der Konzept-Experimente an molekularen Mechanismen, die adipogenen Antworten in Endothelzellen Fettzellen zu fahren, oder für das screening von neuer Medikamenten, die die adipogenen verbessern können Antwort geleitet, entweder in Richtung weiß oder Beige/braun Adipocyte Unterscheidung. Mit kleinen subkutanen Biopsien, kann diese Methode zur Bildschirm aus non-Responder Probanden für klinische Studien zielte darauf ab, Beige/braun und weiße Fettzellen für die Behandlung von Adipositas und Komorbiditäten zu stimulieren.

Einleitung

Aktuelle Belege dafür, dass sowohl beim Menschen als auch bei Mäusen eine Teilmenge von Zellen, die ihren Wohnsitz in das Fettgewebe Gefäßsystem in entweder weiß oder Beige/braunen Fettzellen^1,2,3unterschieden werden kann. Der Phänotyp dieser Zellen ist ein Thema der Kontroverse, mit Nachweise für Endothelzellen, glatte Muskulatur/Pericyte oder ein Spektrum von intermediate Phänotypen^4,5,6,7. Der Umfang der Ausarbeitung dieser Methode war, das adipogenen Potenzial von CD34 + CD31 + Endothelzellen aus verschiedenen Fettdepots von übergewichtigen Menschen isoliert zu testen. Andere Studien in der Literatur konzentrieren sich auf das Potenzial der gesamten Stromazellen vaskulären Fraktion oder der bekannten Adipocyte Stammväter^2,8,9adipogenen. Da derzeit vorhandene Technologien speziell Fettgewebe Endothelzellen für Drug Delivery¹⁰ausrichten können, ist Verständnis das Potenzial solcher Zellen adipogenen unterziehen Induktion auf weißem oder beigem Adipozyten wichtig für zukünftige gezielte Therapien.

Verschiedene Gruppen berichteten die Kombination von CD31 und CD34-Marker als Surrogate, endotheliale Zellen aus menschlichen Fettgewebe^11,12,13zu isolieren. In der Regel erfolgt die Isolierung mit zwei aufeinander folgenden Schritten und eine positive Selektion mit magnetischen Beads. In diesem Bericht wurde Immunoseparation mit CD34 + magnetische Beads mit Plastikperlen CD31 kombiniert eingesetzt. Wir fanden diese Technik besser als die sequentielle magnetische Immunoseparation in Bezug auf die Erhaltung der typischen Kopfsteinpflaster endotheliale Morphologie. Darüber hinaus konnten wir erzeugen genügend Zellen für die Expansion und adipogenen Induktion ab weniger als 1 – 2 g Fett benötigt. Eine kleine Probe-Biopsie des subkutanen Fettgewebes ist genug, um die benötigte Menge an Zellen für downstream-Anwendungen zu produzieren. Dieser Aspekt ist potentiell wichtig, insbesondere dann, wenn diese Methode für das Screening für eine Reaktion auf adipogenen Induktion an Probanden genutzt wird.

Im Gegensatz zu anderen Systemen, die in der Literatur beschrieben, nutzt diese Methode nur zwei Zutaten zur adipogenen Einarbeitung von CD34 + CD31 + Zellen: einem PPARγ-Agonisten — Rosiglitazon – und Humaninsulin. Wichtig ist, fällt die Menge an Insulin verwendet in Normal/Hochton des zirkulierenden post-absorptive Insulin in Menschen¹⁴. Der Grad der Ansprechbarkeit auf Insulin von den Zellen in Vitro, gemessen durch Phosphorylierung von Akt, korreliert nicht mit ihrer Fähigkeit zur Reaktion auf die Induktion cocktail. Interessanterweise mit diesem Induktion cocktail und experimentellen Bedingungen, eine Mischung aus weiß und Beige/braunen Zellen stammen wie von der Größe und Anzahl der intrazellulären Lipid Tröpfchen und den Ausdruck von molekularen Markern bestimmt. Dieses einfache und kostengünstige Induktion Protokoll zusammen mit der quantitativen Erfassung des Phänotyps der Responder Zellen (weiße vs. Beige) ermöglicht ein Screening der Agents, die potenziell das Gleichgewicht der differenzierten Beige verändern können : weiße Fettzellen.

Diese Methode bietet auch einen translationalen Ansatz für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der angereizte des vaskulären endothelialen Vorläuferzellen im menschlichen Fettgewebe. Mit dieser speziellen Isolierung/Differenzierung Technik können Ermittler Verhören verantwortlich für angereizte in eine Teilmenge der vaskulären endothelialen Zellen aus verschiedenen Fettdepots in schlanke und übergewichtige Menschen verschiedene Wege.

Protokoll

Das institutionelle Review Board Committee an der Eastern Virginia Medical School genehmigte Forschung und Sammlung von menschlichen Fettgewebe Proben in der Studie verwendet. Informierter Zustimmung wurde von den Patienten gesammelt.

1. Vorbereitung der Puffer, Medien und Instrumente

1. Bereiten Sie eine Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered Lösung (KRBBS): 135 mM Natriumchlorid, Kaliumchlorid 5 mM, 1 mM-Magnesium-Sulfat, 0,4 mM Kalium Phosphat Diabas-, 5,5 mM Glukose, 1 mM Adenosin, 0,01 % Antibiotikum/antimykotische Mix (50 µg/mL Penicillin, 50 µg/mL Streptomycin, 30 µg/mL von Gentamicin, 15 ng/mL Amphotericin) und 10 mM HEPES (pH = 7,4). Diese Lösung wird jeweils für die Gewebe-Sammlung und die Verdauung frisch zubereitet.
2. Bereiten Sie eine frische Kollagenase-Lösung: 1 mg/mL der Kollagenbildung, Typ 1, in KRBSS; machen Sie 3 mL/g Fett. Vorwärmen der Kollagenase-Lösung bei 37 ° C in einem Wasserbad vor der Gewebe-Verdauung.
3. Bereiten Sie einen CD34 Zelle Isolation Puffer: 2 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 mM EDTA in sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
4. Bereiten Sie angereizte Medien: DMEM/F12, 5 % FBS, 50 µg/mL Penicillin/Streptomycin, 1,25 µL/mL von Humaninsulin (5 µg/mL oder 144 mU/mL) und 0,36 µL/mL von 2,8 mM Rosiglitazon (1 µM).
5. Bereiten Sie eine 0,3 % Öl Rot O (ORO) Stammlösung (Gewicht/Volumen) durch Auflösen von 0,3 g Oro in 100 mL Isopropanol.

2. adipösen Stromazellen vaskulären Bruchteil Isolation

Hinweis: Die Studie umfasste eine Cross-Sectional Kohorte von krankhaft übergewichtige Typ-2-Diabetiker (T2D) und nicht-diabetischen Themen, im Alter von 18 bis 65 Jahren, in der adipositaschirurgie am Sentara Metabolic und Gewicht-Verlust-OP-Zentrum (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Ausschlusskriterien enthalten eine autoimmune-Erkrankung Typ 1 Diabetes Mellitus, einschließlich der Bedingungen erfordern chronische immunsuppressive Therapie, entzündungshemmende Medikamente, Thiazolinendiones, aktiver Tabakkonsum, chronische oder akute Infektionen oder eine Geschichte der Bösartigkeit innerhalb der letzten 12 Monate behandelt. T2D wurde definiert als eine Fastende plasmaglukose von 126 mg/dL oder höher, ein Glukose von 200 mg/dL oder mehr nach eine 2 h-Glukose-Toleranz-test oder dem Einsatz von antidiabetischen Medikamente.

1. Sammeln Sie menschliche omentalis (OM) und subkutanem Fettgewebe (SC) (AT) von menschlichen Themen in der adipositaschirurgie.
2. Halten Sie den OM und SC AT in separaten Ampullen mit Hank es gepufferte Salzlösung mit 50 µg/mL von Penicillin/Streptomycin bei Raumtemperatur unmittelbar nach Entnahme von Gewebe.
3. Sorgfältig reinigen und Entfernen von fibrotische und eingebrannte Abschnitten des Gewebes mit 70 % Ethanol tupfte Scheren und Pinzetten, wenn die Probe im Labor nach der Extraktion des Gewebes kommt.
4. Das Fettgewebe wiegen und It in 5 g (oder weniger) aliquoten für die Kollagenase Verdauung zu partitionieren.
5. Hacken Sie fein 5 g des AT in 5 mL einer Kollagenase-Lösung in einem Funkeln Fläschchen bei Raumtemperatur, mit zwei Paar der Schere.
6. Das Hackfleisch / Gewebe für insgesamt 15 mL eine zusätzliche 10 mL der Kollagenase-Lösung hinzufügen.
7. Die Proben für 1 h bei 37 ° C in einem Wasserbad mit kontinuierlichen schütteln zu verdauen.
8. Schneiden Sie die Spitze aus einer 20 mL Spritze zu einem stumpfen Ende.
9. Schneiden Sie ein Quadrat von 9 x 9 cm von einem Netz von 250 µm und schieben Sie es auf halbem Weg in ein 50 mL konische Röhrchen mit dem stumpfen Ende Spritze.
10. Gießen Sie die Proben in die 20 mL Spritze mit stumpfen Ende und den Filter durch die 250 µm-Nylon-Netzgewebe in das 50 mL konische Röhrchen, Adipozyten und Stromazellen vaskuläre Zellen von unverdauten Gewebe zu trennen.
    Hinweis: Verwenden Sie mehr als 5 g AT pro 50 mL konische Rohr, nicht, wie das Netz durch überschüssige fibrotische unverdaute Material verstopft wird.
11. Das Funkeln Fläschchen mit 10 mL KRBBS waschen Sie aus und Gießen Sie ihn durch den Filter verbleibenden Zellen gesammelt.
12. Inkubieren Sie die gefilterten Proben für 5 min bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, um die Adipozyten zu schweben an der Oberseite des Rohres und einige der Stromazellen vaskulären Zellen sich auf der Unterseite des Rohres zu ermöglichen.
13. Nutzen Sie eine 20 mL Spritze und ein 20 x 6 in pipettieren Nadel die Stromale vaskulären Bruch-Schicht zu entfernen und auf einem sauberen 50 mL konische Rohr übertragen.
14. Fügen Sie 10 mL KRBBS und lassen Sie die Proben zu sitzen auf der Bank für 5 min bei Raumtemperatur.
15. Wiederholen Sie die Schritte 2.12 – 2.14 zweimal.
    Hinweis: Diese Schritte werden sichergestellt, dass keine der Stromazellen vaskulären Zellen mit der schwimmenden Adipozyten Verunreinigung.
16. Halten Sie die Stromale vaskulären Brüche aus beiden Depots auf dem Eis für die Weiterverarbeitung, wie in den folgenden Schritten beschrieben.
    Hinweis: Lassen Sie die Zellen nicht auf Eis für mehr als 1 h, da dies auf die Zellviabilität auswirken kann. Die Adipozyten können in flüssigem Stickstoff für die Langzeitspeicherung Blitz eingefroren oder frisch für Experimente verwendet.

3. Isolation von Fettgewebe Endothelzellen

1. Drehen Sie sich die Stromale vaskulären Brüche (SVF) mit 500 X g für 5 min bei 4 ° C.
2. Entfernen Sie die Proben aus der Zentrifuge und der Überstand Gießen Sie vorsichtig ab; halten Sie die Tablette mit der SVF-Zellen.
3. Sanft Aufschwemmen der Zelle Pellets in 5 mL PBS.
   Hinweis: Wenn mehr als 5 g eines AT-Depots in mehrere Aliquote verarbeitet wurde (siehe Punkt 2.4), bündeln Sie die Zelle Pellets zusammen.
4. Drehen Sie die Proben bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C.
5. Entfernen des Überstands, Aufschwemmen der Zellen in 1 mL PBS und die Zellen zu zählen.
   Hinweis: Hier wurde ein automatische Zelle Zähler für Zellzählung verwendet. Die Zellviabilität wurde durch eine Mischung von 12 µL Zellsuspension mit 12 µL einer Acridin Orange/Propidium Jodid (AO/PI) Lösung erzielt (siehe Tabelle der Materialien). Die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Gramm AT für jedes Depot ist: (a) OM-Depot: 1,69 x 10⁵ ± 4,51 x 10⁴; (b) SC-Depot: 1,24 x 10⁵ ± 6,45 x 10⁴. Die Lebensfähigkeit der Zellen von beiden Depots war > 90 %.
6. Pellet-Proben bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C.
   Hinweis: Ein CD34 Immunomagnetic Auswahl Protokoll (siehe Tabelle der Materialien) wurde für Schritte 3,7 – 3.15 angepasst.
7. Das Pellet in 100 µL CD34 Isolierung Puffer aufzuwirbeln.
   Hinweis: Die gesamte zellenzahlen erfordern die folgenden Resuspension Bände: (a) < 2 x 10⁷ Zellen: Aufschwemmen das Pellet in 100 µL; (b) 2 x 10⁸– 5 x 10⁸ Zellen: das Pellet in 1 mL aufzuwirbeln. In Schritten 3,9 – 3.16, waren die Mengen der verwendeten Reagenzien für verkleinert < 2 x 10⁷ Zellen.
8. Fügen Sie 10 µL CD34 cocktail und inkubieren Sie die Probe für 15 min bei Raumtemperatur.
9. Fügen Sie 5 µL des magnetischen Beads und inkubieren Sie die Probe für 10 min bei Raumtemperatur.
10. Jede Probe 2,5 mL CD34 Isolierung Puffer hinzu, und legen Sie die Proben in den Magneten für 5 min bei Raumtemperatur.
11. Invertieren den Magnet für 5 s, aus der Isolation-Puffer zu gießen.
12. Die Proben vom Magneten zu entfernen, und wiederholen Sie die Schritte 3.10 und 3.11 4 X.
13. Entfernen Sie den Schlauch vom Magneten und 2 mL CD34 Isolierung Puffer.
14. Pellet-Zellen bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C.
15. Aufschwemmen Sie der Zelle Pellets in 1 mL CD34 Isolierung Puffer und zählen Sie die Zellen zu.
    Hinweis: Hier ist die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Gramm AT: (a) OM-Depot: 4,75 x 10⁴ ± 3,36 x 10⁴; (b) SC-Depot: 1,06 x 10⁴ ± 9,53 x 10³. Ein CD31 Kunststoff Immunobead-Protokoll wurde für Schritte 3.16 – 3,34 angepasst (siehe Tabelle der Materialien).
16. Pellet-Zellen bei 500 X g für 5 min und das Pellet in 250 µL Puffer B und 250 µL Waschpuffer aufzuwirbeln.
17. Aufschwemmen Sie gründlich CD31 Perlen durch aufschütteln der Röhre.
18. Fügen Sie 20 µL CD31 Perlen.
    Hinweis: Aufgrund der Ergebniszelle zählt > 1 x 10⁶, das Volumen war nach Vorgaben des Herstellers verkleinert.
19. Inkubieren Sie die Probe mit Schaukeln für 30 min bei Raumtemperatur.
20. Legen Sie ein Sieb auf einen sterilen 50 mL konische Rohr.
    Hinweis: Die größere Öffnung des Siebes muss oben sein.
21. Hinzugeben Sie vor der Zelle Trennung 1 mL Waschpuffer auf das Sieb equilibrate. Übernehmen Sie die Mischung unter Schritt 3.16 in das Sieb erzeugt.
22. Waschen Sie das Sieb mit 5 mL Waschpuffer in einer kreisförmigen Bewegung für ein Gesamtvolumen von 20 mL. Legen Sie den Stecker auf einer sterilen 50 mL konische Rohr und schließen Sie den Luer-Lock.
23. Legen Sie das Sieb auf den Stecker. Fügen Sie 1 mL Waschpuffer entlang der Mauer des Siebes. Fügen Sie 1 mL der aktivierten Puffer D entlang der Mauer des Siebes. Die Probe sanft Wirbeln und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
24. Fügen Sie 1 mL Waschpuffer. Die Perlen trennen Sie der Zellen durch pipettieren nach oben und unten 10 X.
    Hinweis: Vermeiden Sie Luftblasen erzeugen.
25. Öffnen Sie das Luer-Lock und lassen Sie die freistehenden Zellen in der 50 mL konische Rohr fließen. Waschen Sie das Sieb 10 X mit 1 mL Waschpuffer jedes Mal.
26. Entsorgen Sie den Anschluss und Sieb und Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL komplette EGM-2 Medien für Kultur.
    Hinweis: Die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Gramm AT an dieser Stelle ist: (a) OM-Depot: 5,92 x 10³ ± 4.27 x 10³; (b) SC-Depot: 4.12 x 10³ ± 2,1 x 10³. Die Lebensfähigkeit der Zellen von beiden Depots lag bei über 90 %.

(4) Induktion von angereizte in isolierten Endothelzellen

1. Wachsen Sie die Zellen in Zellkultur behandelt 6-Well-Platten mit kompletten EGM-2 Medien in einem 37 ° C, 5 % CO₂ Inkubator. Ersetzen Sie die Medien alle 3 – 4 Tage, bis die Zellen Zusammenfluss von 80 – 90 % erreichen.
   Hinweis: Die Verdoppelung der Bevölkerung ist zwischen 2 – 3 Tage.
2. Erweitern Sie die Zellen durch Ausplattieren sie auf 100 mm Petrischalen und Teilen der Zellen 1:3 einmal. Zu diesem Zeitpunkt sind die Zellen auf Durchgang 2.
3. Die Anzahl der Zellen unter Verwendung einer automatischen Zelle entgegenzuwirken (siehe Tabelle der Materialien).
4. Ca. 100 – 200.000 Samenzellen in 6-Well-Platten, die doppelte Brunnen für jedes Depot und Kultur, die sie in völliger EGM-2 Medien für 2 Tage zu gewährleisten.
5. Aus jedem Wachstumsmedien Aspirieren und ersetzen Sie es mit 2 mL DMEM/F12 mit 5 % FBS und 50 µg/mL von Penicillin/Streptomycin zur Bekämpfung Zellen und ersetzen Sie es mit 2 mL angereizte Medien (siehe Punkt 1.4) für die Behandlung der Zellen.
6. Inkubation der Zellen bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO₂ Inkubator für 13 Tage austauschen der jeweiligen Medien alle 3 bis 4 Tage.
   Hinweis: Zellen fangen an, nach 4 Tagen Behandlung Lipide ansammeln.
7. Durchführung von ORO und Nil rote Färbung nach veröffentlichten Methoden^15–17.
8. Um Zellen für eine RNA-Extraktion zu isolieren, entfernen Sie das Medium aus dem 6-Well Induktionsplatten und waschen Sie ihn mit 1 mL sterile PBS.
9. Fügen Sie 350 µL einer Guanidium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Lösung (siehe Tabelle der Materialien), jeweils gut und bei 5 – 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
10. Kratzen Sie die Zellen aus der Platte mit einem Schaber Zelle und übertragen Sie die Zellen zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
    Hinweis: Die Proben können im RNA-Gewinnung und Weiterverarbeitung zu einem späteren Zeitpunkt-80 ° C Gefrierschrank gelagert werden.
11. Die Proben unter Verwendung einer angepassten RNA-Extraktion mRNA entziehen (siehe Tabelle der Materialien)-Protokoll.
12. Führen Sie eine Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur Bewertung der Genexpression mit folgenden Sonden: Adiponectin, UCP-1, und CIDEA (siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Hier, RT-PCR-Verfahren wurden durchgeführt mit den folgenden standard-Protokoll: Denaturierung (95 ° C; 15 s), Glühen und Erweiterung (60 ° C, 1 min) für 40 Zyklen. Die Proben, die Gene mit C_T -Werte > 35 galten nicht nachweisbar.

Ergebnisse

Unser Protokoll bezweckt eine in-vitro- Ansatz zur adipogenen Potenzial von CD34 + CD31 + vaskuläre Zellen aus verschiedenen Depots von menschlichen Fettgewebe zu bestimmen. Abbildung 1Azeigt ein vereinfachtes Flussdiagramm-Diagramm. Der erste Schritt durch eine positive Selektion von CD34 Ausdruck Zellen führt zu > 95 % CD34 + Zellen in der Bevölkerung der frisch isolierten Zellen (Abbildung 1A). Wichtiger ist, ist d...

Diskussion

Im Mittelpunkt dieses Papiers ist es, eine Methodik für die Isolierung, Expansion und adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelzellen von viszeralen und subkutanen Depots von menschlichen Fettgewebe zur Verfügung zu stellen.

Methoden sind berichtet worden, für die Isolierung von Endothelzellen aus verschiedenen vaskulären Betten von Nagetieren oder Menschen, bei denen in erster Linie Techniken mit CD31 Antikörper eindringmittel beschriftet oder gekoppelt mit magnetischen Beads

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Large Equipment
Biosafety Cabinet	Nuaire	nu-425-400
Cell Culture Incubator	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
Water Bath	Forma Scientific	2568	Reciprocal Shaker
RT-PCR Machine	BIO-RAD	CFX96-C1000
Electrophoresis Box	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 Cell
Transblot Box	BIO-RAD	Mini Trans-Blot Cell
Electrophoresis Power Supply	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Blot Reader	LI-COR	Odyssey	Near Infrared
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Tabletop Centrifuge	Eppendorf	MiniSpin Plus
Fluorescent Microscope	Olympus	BX50
Inverted Microscope	Nikon	TMS
KRBSS Buffer
HEPES	Research Products International	H75030
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	746398
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Acros Organics	410950010
Adenosine	Acros Organics	164040250
Bovine Serum Albumin	GE Healthcare Bio-Sciences	SH30574.02
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	15070063
Tissue Digestion
20 mL Syringe	Global Medical	67-2020
Nylon Mesh, 250 µm	Sefar	03-250/50
Pipetting Needles	Popper	7934
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Tissue Forceps	George Tiemann & Co	160-20
Collagenase, Type I	Worthington Biochemical	LS004196
Petri Dishes, 100 mm	USA Scientific	5666-4160	TC Treated
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
Conical Tubes, 15 mL	Nest Scientific	601052
Conical Tubes, 50 mL	Nalgene	3119-0050
Scintillation Vials	Kimble	74505-20	Tissue Dicing
Cell Isolation
Cellometer	Nexcelom	Auto 2000
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Cellometer Viability Stain	Nexcelom	CS2-0106-5mL	Acridine Orange/Propidium Iodine
Anti-CD34 Magnetic Beads	StemCell Technologies	18056	Kit
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
Anti-CD31 Plastic Beads	pluriSelect USA	19-03100-10
pluriSelect 10x Wash Buffer	pluriSelect USA	60-00080-10
pluriSelect Connector Ring	pluriSelect USA	41-50000-03
pluriSelect Detachment Buffer	pluriSelect USA	60-00046-12
pluriSelect Incubation Buffer	pluriSelect USA	60-00060-12
pluriSelect S Cell Strainer	pluriSelect USA	43-50030-03
Cell Culture
6-well Plates	USA Scientific	CC7682-7506	TC Treated
4-well chambered slides	Corning Life Sciences	354559	Fibronectin coated
4-well chambered slides	Thermo-Fisher Scientific	154526PK	Uncoated glass
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)	Sciencell Research Laboratories	7200	Primary cell line
Endothelial Cell Media (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Complete Kit
DMEM/F12 Basal Media	Thermo-Fisher Scientific	11320082
Fetal Bovine Serum (FBS)	Rocky Mountain Biologicals	FBS-BBT
Insulin	Lilly	U-100	Humalog
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Cell Analysis
Oil Red O Dye	Sigma-Aldrich	O0625	Prepared in isopropanol
96 well plates	USA Scientific	1837-9600
96 well PCR plates	Genesee Scientific	24-300
RNA Extraction	Zymo Research	R2072	Kit
cDNA Synthesis	BIO-RAD	1708841	Supermix
JumpStart PCR Polymerase	Sigma-Aldrich	D9307-250UN	Hot start, with PCR Buffer N
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M8787-5ML	3 mM final in PCR reaction
dNTPs	Promega	U1515
TaqMan AdipoQ	Thermo-Fisher Scientific	Hs00605917_m1
TaqMan CIDEA	Thermo-Fisher Scientific	Hs00154455_m1
TaqMan RPL27	Thermo-Fisher Scientific	Hs03044961_g1
TaqMan UCP1	Thermo-Fisher Scientific	Hs00222453_m1
BCA Assay	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT	Kit
Bis-acrylamide	BIO-RAD	1610146	40% stock solution
Ammonium Persulfate	BIO-RAD	1610700
TEMED	BIO-RAD	1610800
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Glycine	BIO-RAD	1610718
Sodium Dodecal Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Fisher Scientific	S311-100
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B8026
Blot Membrane	EMD Millipore	IPFL00010
Methanol	Fisher Scientific	A452-SK4
Odyssey Blocking Buffer, Tris	LI-COR	927-50000
Anti-AKT antibody	Cell Signaling Technology	2920S	Mouse monoclonal
Anti-pAKT antibody	Cell Signaling Technology	9271S	Rabbit polyclonal
Anti-UCP1 antibody	Abcam	ab10983	Rabbit polyclonal
Anti-Mouse IgG antibody	LI-COR	926-68070	Goat Polyclonal, IRDye 680RD
Anti-Rabbit IgG antibody	LI-COR	926-32211	Goat Polyclonal, IRDye 800CW
Anti-Rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	111-025-003	Goat Polyclonal, TRITC
Phosphate Buffer Saline	Thermo-Fisher Scientific	10010049
37% Formaldehyde Solution	Electron Microscopy Sciences	15686	4% solution for cell fixation
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	10% blocking solution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100	0.1% permeabilization solution
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D1306
Calcein AM	Thermo-Fisher Scientific	65-0853-39	Cell fluorescent visualization
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning Life Sciences	356231	Growth factor reduced
DiI labeled Acetylated LDL	Thermo-Fisher Scientific	L3484