Multimodale Volumetrische Retinal Imaging von schrägen Scanning Laser Ophthalmoskopie (oSLO) und optische Kohärenztomografie (OCT)

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um ein großes Sichtfeld (FOV) dreidimensionale (3D) Fluoreszenz und OCT Netzhautbild mithilfe eine neuartige bildgebende multimodale Plattform abrufen. Wir werden das System-Setup, die Methode der Ausrichtung und der operativen Protokolle vorstellen. In-Vivo Bildgebung werden demonstriert und repräsentative Ergebnisse zur Verfügung gestellt werden.

Zusammenfassung

Während Fluoreszenz-Bildgebung in der Augenheilkunde weit verbreitet ist, ist ein großes Sichtfeld (FOV) dreidimensionale (3D) Fluoreszenz Netzhautbild nach wie vor eine große Herausforderung mit der State-of-the-Art-Retinal bildgebende Modalitäten, weil sie Z-Stapeln, erfordern würde Kompilieren Sie eine Volumetrische Dataset. Neuere optische Kohärenztomografie (OCT) und OCT angiographiesysteme (OCTA) überwinden diese Einschränkungen um dreidimensionale (3D) anatomische und vaskuläre Bilder liefern, aber die Farbstoff-freie Art der OCT kann nicht auslaufen bezeichnend für vaskuläre visualisieren Dysfunktion. Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige schräge scanning Laser Ophthalmoskopie (oSLO) Technik, die 3D Volumetrische Fluoreszenz retinale Bildgebung. Das Setup von dem abbildenden System generiert die schräge Abtastung durch eine Taube Schweif Schieberegler und richtet die endgültige imaging-System in einem Winkel, fluoreszierende Schnittbilder zu erkennen. Das System nutzt die Laser-scanning-Methode und ermöglicht daher eine einfache Einbindung von OCT als ergänzende volumetrischen strukturellen bildgebenden Modalität. In-Vivo Bildgebung auf Ratte Netzhaut wird hier gezeigt. Fluorescein Lösung wird intravenös injiziert, um Volumetrische Fluorescein Angiographie (vFA) zu produzieren.

Einleitung

Augenheilkunde und Vision Wissenschaft profitieren von der modernen optischen bildgebenden Verfahren, da die Netzhaut mit Licht leicht erreicht werden kann. Fluoreszenz retinale Bildgebung ist ein wichtiges Instrument bei der Diagnose und Behandlung von Gefäßerkrankungen chorioretinalen wie Diabetische Retinopathie (DR) und Altersbedingte Makula-Degeneration (AMD), die Ursachen von Blindheit in den Vereinigten Staaten führen.

Jedoch ist es immer noch schwierig, ein großes Sichtfeld (FOV), dreidimensionale (3D) Retinal imaging mit Fluoreszenz-Bildgebung zu erwerben. Fundus-Fotografie verfügt nicht über die Tiefe-Lösung von Fähigkeit und diffuses Licht nicht ablehnen. Die Vermischung von Signalen unterschiedlicher Tiefe reduziert dadurch die Bildqualität. Scanning Laser Ophthalmoskopie (SLO) und konfokale SLO (cSLO) kann die Wirkung von diffusem Licht mithilfe konfokale gating¹reduzieren. Es ist jedoch schwierig für SLO oder cSLO eine menschliche Netzhaut 3D-Bild aufgrund der Begrenzung der Schärfentiefe zu erwerben. Adaptiver Optik SLO (AOSLO) bieten hervorragende Auflösung und Kontrast korrigieren der Wavefront Aberrationen durch das menschliche Auge eingeführt. Jedoch müsste AOSLO Z-Stapeln für Volumetrische Bildverarbeitung². Optische Kohärenz Tomographie (OCT)³ und OCT angiographiesysteme (OCTA) überwinden diese Einschränkungen um dreidimensionale (3D) anatomische und vaskuläre Bilder^4,5,6, sondern die Farbstoff-freie Natur bieten Oktober kann nicht auslaufen bezeichnend für vaskuläre Dysfunktion visualisieren.

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartigen multimodale Plattform für 3D Volumetrische Fluoreszenz Retinal imaging, nämlich schräg scanning Laser Ophthalmoskopie (oSLO). In diese imaging-System eine schräge Abtastung entsteht durch eine Taube Schweif Schieberegler und eine endgültige imaging-System orientiert sich in einem Winkel zur Fluoreszenz Kreuz Schnittbilder zu erkennen. Das System nutzt Laser-scanning-Methoden, und diese Techniken ermöglichen einfache Einbindung mit OCT als ergänzende volumetrischen strukturellen bildgebenden Modalität. Die aktuelle Tiefe Auflösung beträgt etwa 25 µm in der Ratte Netzhaut und das Sichtfeld beträgt 30°. Im Wesentlichen der oSLO ermöglicht eine fluoreszierende Version Okt. und sind gleichzeitig mit OCT kombinierbar und OCTA über einem großen FOV.

In diesem Protokoll werden wir das Setup des oSLO, die Methode der Ausrichtung und den Bau, die Methode der in-Vivo Bildgebung der Ratte Netzhaut und die repräsentativen Ergebnisse beschreiben.

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von Animal Care und Nutzung Ausschuss (ACUC) von Boston Medical Center genehmigt.

1. System-Setup

1. oSLO-System
   1. Verwenden einer Laserquelle Supercontinuum als System-Laserquelle.
      1. Höheren Wellenlängenbereich (650-2000 nm) Bereich des sichtbaren Lichts (450-650 nm) durch einen dichroitischen Spiegel (DM1) trennen. Erweitern Sie das Spektrum mit einem Paar dispersive Prismen nach den Strahl durch einen Strahlteiler Polarisation (PBS).
      2. Legen Sie einen Schlitz um die Erregung Wellenlängenbereich (475-495 nm) auszuwählen. Verwenden Sie einen reflektierenden Spiegel reflektieren den gefilterten Strahl zurück auf das Prisma paar und Paar dann das Licht in die Singlemode-Faser (SMF 1).
      3. Verwenden Sie ein Spektrometer zur Bestätigung der Auswahl der Wellenlänge am Ausgang der single-Mode-Faser.
   2. Verbinden Sie die Singlemode-Faser mit zwei kaskadierte LWL-Koppler, wie in Abbildung 2dargestellt. Einer der Faser-Ausgangs-Port aus der zweiten Faserkoppler liefert das Licht auf das oSLO-System.
   3. Lassen Sie den Laser zuerst im oSLO-System.
      1. Den Laser von einem Galvanometer-Spiegel (GM1) abzulenken. Relais der Laser zu einem zweiten Galvanometer-Spiegel (GM2) durch ein 1:1 Teleskopsystem, und weitere Relais auf die Pupille des Auges durch einen 3:1 Teleskopsystem.
      2. Installieren Sie einen dichroitischen Spiegel (DM2) innerhalb des Systems der 3:1 Teleskop, die Fluoreszenz-Signale zu reflektieren.
   4. Das 3:1 Teleskopsystem und dichroitische Spiegel (DM2) auf eine angepasste Taube Schweif Schieberegler zum Ausgleich der optischen Achse und erstellen die schräge Beleuchtung zu scannen, wie in Abbildung 3gezeigt zu montieren. Verwenden Sie ein Bremssattel genau die Offset Länge beliebig steuern.
   5. Fluoreszenz imaging Strahlengang.
      1. Die Fluoreszenz von der dichroitischen Spiegel und Relais zum dritten Galvanometer-Spiegel um das langsame Scannen de-Scannen zu reflektieren.
      2. Relais das Licht zu einem bildgebenden Objektiv von einem anderen 1:1 Teleskopsystem. Installieren Sie die oben genannten Optik auf einem Verschiebetisch.
         Hinweis: Zusätzliche Übersetzung zweistufig sind unter dem dritten Galvanometer-Spiegel (GM3), Redundanz in die Anzahl der Freiheitsgrade sorgen für die Optimierung der Bildgebung installiert.
   6. Montieren Sie eine endgültige imaging-System auf einer Bühne, die hat drei Freiheitsgrade (Rotation und zwei Achsen der Übersetzung). Verwenden Sie eine planare Kamera, um die Cross-Sectional Fluoreszenzbilder zu erfassen.
2. Optische Kohärenz Tomographie System
   1. Verwenden Sie die gleichen Supercontinuum Laserquelle als System-Laserquelle.
      1. Trennen Sie das nahe Infrarot (NIR) Bereich (650-900 nm) von Restlicht (650-2000 nm) durch ein anderes dichroitische Spiegel (DM3). Verwenden Sie einen langen Pass Filter um ausreichend Bandbreite, um 800-900 nm weiter einzuschränken. Koppeln Sie den Strahl in die Singlemode-Faser (SMF 2).
   2. Verbinden Sie die Singlemode-Faser mit den anderen Eingang der zwei kaskadierte LWL-Koppler, mit der blauen oSLO Anregung zu kombinieren. Lenken Sie das Licht aus der zweiten Ausgangs-Port des zweiten Faserkoppler, OCT referenzarm, verfügt über eine Variable Graufilter (VNDF), Streuung Entschädigung Platten und einen reflektierenden Spiegel.
      Hinweis: Das Licht aus dem referenzarm zurück und das Auge setzt bei der zweiten LWL-Koppler und wird an das OCT-Spektrometer, das Signal zu sammeln.
3. Die Datenerfassung
   1. Verwenden Sie eine Datenerfassungs-System-Software in LabVIEW geschrieben und aus dem Scan-Protokoll von OCTA^7,8,9,10geändert. Für jeden B-Scan, eine 80 % Einschaltdauer sah Zahn mit 500 Schritten ist die Ausgabe von einem Analogausgang (AO1) X Steuerung "schnelle Scan Spiegel, GM2.
   2. Auslösen der Zeilenkamera bei jedem Schritt Daten für das Office-Anpassungstool zu erwerben nur, wenn der Spiegel in der Scan-Richtung ist. Legen Sie die Belichtungszeit für die Zeilenkamera 17 µs sein.
   3. Um die OCTA-Signal zu erhalten, wiederholen Sie die Messung 5 Mal am gleichen Ort B-Scan.
   4. Legen Sie die Ausgaberate AO bei 100 kHz und die OCT-a-line-Rate bei 50 kHz. Steuern der y' slow Scan Spiegel, GM1, durch Rampen Wellenform. Synchronisieren Sie den de-Scannen Spiegel, GM3, mit GM1, das langsame Scannen de-scannen.
   5. Die planare Kamera auslösen, indem Sie ein anderes Analogausgang Board (AO2) für eine fluoreszierende Aufnahme bei jeder y' Lage. Die bildgebende Größe zuschneiden oder bin die Nachbar-Pixel zur Erhöhung der Geschwindigkeit und Empfindlichkeit wie gewünscht.

2. System Ausrichtung

1. Passen Sie den Schlitz in der oSLO-Lichtquelle die blauen Erregung Wellenlänge auswählen. Verwenden ein Spektrometers zur Überwachung des Spektralbereichs um rund 475-490 nm.
2. Den Schieberegler Taube Heck montieren um die optische Achse von ~ 5 mm verschieben. Dadurch wird ein Offset bei der Ratte-Schüler von ~1.7 mm, was in einem schrägen Winkel von ~ 15 ° auf der Netzhaut.
3. Verschiebetisch der Fluoreszenz-Detektion-Optik durch die gleichen 5 mm einstellen.
4. Passen Sie die endgültige Fluoreszenz imaging-System um ~ 30 ° zu sein.
5. Messen Sie die optische Leistung mit einem Leistungsmesser. Sicherstellen Sie, dass die blauen oSLO erregerleistung ist ≤0.2 mW und OCT Laser macht ≤0.8 mW, die Netzhaut nicht beschädigt wird.
   Hinweis: Basierend auf dem ANSI-Standard, die maximale permissive Belichtung (MPE) an der Netzhaut ist auf der Ebene der ~ 2mW^7,8 im sichtbaren Bereich des Lichts. Nach der Formel von Delori Et al. ⁹, die Fehlergrenze für das nahe Infrarot-Licht ist etwa doppelt so hoch als das sichtbare Licht, bei etwa 4 mW.

3. in Vivo Tierversuch

1. Übertragen Sie eine 12-Wochen männliche lange Evans Ratte in der Induktion Kammer. Die Ratte mit 4,5 % Isofluran in Sauerstoff für 10 Minuten mit einer Durchflussmenge von 2 L/min durch einen Verdampfer Isoflurane zu betäuben.
   1. Bestätigen Sie die Tiefe der Narkose wie durch einen Mangel an Rückzug Reflex während einer interdigital Prise bestimmt.
2. Legen Sie nach der Induktion die Ratte auf Inhaber eines 5-Achsen (X, y, Z-Übersetzungen, Gier und Tonhöhe). Sorgen Sie für zusätzliche Wärme mittels einer beheizten Objekttisch, zirkulierenden Warmwasser Decke oder eine andere geeignete Methode in einem längeren Experiment. Pflegen Sie die Narkose auf 1,5 % des Isofluorane mit einer Durchflussmenge von 2 Liter/Minuten während der restliche Teil des Experiments. Wenn keine Induktion-Kammer mit aktiven Auspuff verwenden, sollte die Induktion Kammer auf einem Backdraft oder Randabsaugung Tisch oder unter einen Schnorchel, Isofluran Aufräumen platziert werden.
3. Erweitern Sie die Pupille mit 1 % Tropicamid ophthalmologischen Lösung für 2 Minuten. Tragen Sie 0,5 % Tetracaine HCl ophthalmologischen Lösung auf die Ratte Auge für zusätzliche örtliche Betäubung, auf, bei Bedarf. Auge mindestens einmal pro Minute während des Tests mit kommerziellen künstliche Tränen befeuchtet.
4. Fluorescein Salz (10 % w/w) oder FITC zu injizieren (10 % w/w) in steriler Kochsalzlösung verdünnt (0,1-0,3 mL) durch die Rute Vene mit einer 1 mL Spritze und ein 29G Nadel.
5. Schalten Sie die Laserquelle. Ort ein Graufilter, die blaue leichte Erregung bei der Ausrichtung zu vermindern. Messen Sie die Kraft des Lichtes OCT ~0.8 mW zu sein, und das blaue Licht < 0,01 mW auf die Bildung des grauen Stars zu vermeiden.
6. Startmodus der Galvanometer Scannen und Ausrichtung. Passen Sie die Höhe der den Augapfel zu einen stationären Laser auf der Hornhaut vor Ort machen. Passen Sie die Ratte augenposition um den Rand der Pupille etwa senkrecht zum Laser machen, und versetzt den Laser auf der apikalen Mitte des Auges, um ca. ~1.5 mm.
7. Tierische pedaldom weiter bis OCT Bilder optimale Qualität zu erreichen. In der X' schnell Abtastrichtung, stellen sicher, dass der Querschnitte B-Bild flach erscheint. Beim Umschalten auf die y' Scanrichtung zu verlangsamen, sicherstellen, dass der Querschnitt B-Bild scheint geneigt, wegen der schrägen scannen.
8. Graufilter, der blaue leichte Erregung zu entfernen und die Futtermittel von der Kamera in Echtzeit zu überwachen. Cross sectional fluoreszierende Bild sollte angezeigt werden, zeigt Blutgefäße erscheinen in verschiedenen Tiefen.
   1. Stellen Sie den Fokus der letzten Fluoreszenz imaging-System um den optimalen Fokus zu erreichen. Lassen Sie Feineinstellungen der augenposition in der seitlichen Ebene, optimale oSLO Bildqualität zu erreichen.
9. Beginnen Sie nach der Ausrichtung, gleichzeitige OCTA und volumetrische Fluorescein Angiographie (vFA) zu erwerben.
10. Die volumetrische Bilder für OCTA und oSLO von Matlab zu konstruieren. Die Algorithmen werden zuvor im Detail¹⁰beschrieben. Erzeugen Sie retinale Vasculatures Tiefe gelöst durch Segmentierung Bild.
11. Schalten Sie nach Abschluss der Bildgebung den Laser, lassen Sie das Tier tragen Sie einige ophthalmologische Salbe auf die Augen auf und dann legen Sie das Tier in einer Box Erholung.
12. Nicht unbeaufsichtigt lassen das Tier bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat oder wie pro institutionelle Politik.

Ergebnisse

Abbildung 4a zeigt ein Querschnitt OCT-Bild der Ratte Netzhaut. Abbildung 4 b -4 c zeigen die gleichen retinalen Schnittbilder von OCTA und oSLO vFA zur gleichen Zeit erworben. Der oSLO ermöglicht Cross-Sectional FA analog zu der OCT B-Scan. Im Vergleich zu OCTA identifiziert das oSLO vFA Cross-Sectional Bild eindeutig die Schiffe in der nervenfaserschicht (NFL) und Ganglion Zellschicht (GCL) und Kapillaren in d...

Diskussion

Hier haben wir beschrieben, oSLO, eine in Vivo Volumetrische fluoreszierende Retinal imaging Technik mit einem FOV über 30°. Im Vergleich zu OCT, eines aktuellen Behandlungsstandards bildgebendes Verfahren in der Augenheilkunde, oSLO bietet eine ähnliche 3D imaging-Funktion doch erlaubt Fluoreszenz-Kontrast, der OAT nicht anfällig ist. Der Vorteil von oSLO ist, dass es nur einen rasterscan erfordert und die nahtlose Kombination von OCT erlaubt, die zwei sich ergänzende Techniken für Struktur- und fluoreszi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supercontinuum Laser Source	NKT Photonics	SuperK EXTREME EXU-OCT6
Dichroic Mirror (DM1)	Thorlabs	DMLP650R
Dichroic Mirror (DM2)	Chroma	ZT514/1064rpc
Dichroic Mirror (DM3)	Thorlabs	DMLP900R
Single Mode Fiber (SMF 1)	Thorlabs	P3-460B-FC-2
Single Mode Fiber (SMF 2)	Thorlabs	P3-780A-FC-2
Optic Fiber Coupler	Thorlabs	TW850R5A2
1:1 Telescope System	Thorlabs	AC254-100-A×2
3:1 Telescope System	Thorlabs	AC254-150-A×2
3:1 Telescope System	Thorlabs	AC254-50-A×2
Galvo Mirrors (GM1,GM2)	Thorlabs	GVS201×2
De-sacn Galvo Mirrors (GM3)	Thorlabs	GVS011
Objective Lens	Olympus	UplanSApo 20×/0.75
Final imaging system	Olympus	UplanFL N 10×/0.3
Final imaging system	Computar	12-36mm/1:2.8
Camera	PCO	Pco.pixelfly usb
Filter	Thorlabs	FEL0800
Mounted Continuously Variable ND Filter	Thorlabs	NDC-50C-4M-A
Line Scan Camera	Thorlabs	SPL2048-140K
Analog Output Board (AO1)	National Instrument	PCI-6731
Analog Output Board (AO2)	National Instrument	PCIe-6351
Long pass filter	Thorlabs	FEL0800