Blatt-Spray-Massenspektrometrie: Eine schnelle Ambient Ionisation Technik direkt Metaboliten von Pflanzengewebe bewerten

Zusammenfassung

Blatt-Spray-Massenspektrometrie ist eine direkte chemische Analyse-Technik, die minimiert die Probenvorbereitung und beseitigt Chromatographie, so dass für die schnelle Erkennung von kleinen Molekülen von Pflanzengewebe.

Zusammenfassung

Pflanzen produzieren Tausende von kleinen Molekülen, die in ihren chemischen Eigenschaften unterschiedlich sind. Massenspektrometrie (MS) ist eine leistungsfähige Technik für Pflanze Metaboliten zu analysieren, denn es Molmassen mit hoher Sensitivität und Spezifität bietet. Blatt-Spray MS ist eine ambient Ionisation Technik wo Pflanzengewebe für direkte chemische Analyse über Elektrospray, Beseitigung von Chromatographie aus dem Prozess verwendet. Dieser Ansatz zur Probenahme Metaboliten ermöglicht eine Vielzahl von chemischen Klassen gleichzeitig von intakten Pflanzengewebe, Minimierung der Menge der Probenvorbereitung erforderlich erkannt werden. Bei Verwendung mit einem hochauflösenden, genaue Masse MS erleichtert Blatt Spray MS den Schnellnachweis von Metaboliten von Interesse. Es ist auch möglich, tandem mass Fragmentierung Datensammlung mit dieser Technik um eine zusammengesetzte Identifizierung zu erleichtern. Die Kombination aus präzise massenmessungen und Fragmentierung ist vorteilhaft bei der Bestätigung zusammengesetzte Identitäten. Das Blatt-Spray MS Technik erfordert nur geringfügige Änderungen Nanospray Ionisierung Quelle und ist ein nützliches Werkzeug zum Ausbau der Fähigkeiten eines Massenspektrometers. Hier wird frisches Blattgewebe aus Sceletium Tortuosum (Mittagsblumengewächsen), eine traditionelle Heilpflanze aus Südafrika, analysiert; zahlreiche Mesembrine Alkaloide werden mit Blatt-Spray MS erkannt.

Einleitung

Pflanzen enthalten eine Vielzahl von kleinen Molekülen mit unterschiedlichen chemischen Eigenschaften. MS ist eine leistungsfähige Technik für Pflanzenstoffe zu analysieren, da es elementare Kompositionen eine hohe Sensitivität und Spezifität für die Detektion und Identifizierung von Metaboliten¹verschaffen kann. Am häufigsten wird MS auf Lösungsmittel extrahierte Proben durchgeführt, die durch Chromatographie vor MS Analysis¹getrennt sind. Jedoch der Flüssigchromatographie (LC) langen Analysenzeiten benötigt und ist oft verbunden mit einem umfangreichen Probe Vorbereitung¹. Im Gegensatz dazu ist direkte chemische Analyse von intakten Gewebe, die Chromatographie umgeht eine sehr schnelle Technik, minimales Beispiel Vorbereitung²erfordern. In Fällen wo chromatographische Schritte verzichtet werden können, kann somit eine direkte chemische Analyse sehr vorteilhaft sein.

Typische LC-MS für natürliche Produkte und Metabolomics-Forschung stützt sich auf langwierige Bulk Extraktionen von getrockneten oder gefrorenen Pflanzenmaterial, enthält mehrere Gewebe und Zelle Arten³. Alternativ kann direkte chemische Analyse, wie die MS-Detektion von Metaboliten von Pflanzengewebe, Zelltypen zu isolieren und Vorbereitung Artefakte⁴vermeiden. Blatt-Spray MS, auch bezeichnet als Gewebe-Spray^5,6, ist eine direkte ambient Ionisation MS-Technik, die im wesentlichen keine Probe Vorbereitung^5,7erfordert. Blatt-Spray, die MS auf Papier Spray MS, eine ambient Ionisation Technik mit Merkmalen der Elektrospray-Ionisation verwandt ist, die für die Erkennung von Analyten ermöglicht, die auf Papier⁷abgelegt werden. Trotz des Namens Blatt Spray MS ist für verschiedene Arten von Pflanzengewebe, nicht nur Blätter und wurde auf Obst, Samen, Wurzeln, floral Gewebe und Knollen unter anderem^{6,8,9, demonstriert 10,11,12}. Die Technik erleichtert die Ionisierung der endogenen Phytochemicals direkt aus pflanzlichen Stoffen in das Massenspektrometer für Erkennung⁸. Blatt-Spray MS bieten auch Informationen über die räumliche Verteilung der Chemikalien in verschiedenen Gewebetypen in Pflanzen¹³. Wenn Blatt Spray MS mit solvent-Extraktion und LC-MS verglichen wird, deuten die Ergebnisse Blatt-Spray, die MS für die schnelle Erkennung von Oberfläche Metaboliten von einzigartigen Zelltypen wie Trichome¹³ermöglicht. Abbildung 1 zeigt den Blatt Spray MS Versuchsaufbau. Direkte Elektrospray-Ionisation tritt nach nur geringfügigen Quelle Änderungen. Liegt eine hohe Spannung auf das pflanzliche Gewebe über eine Metallklammer, produzieren einen Spray von hoch geladenen Tröpfchen bilden einen Taylor-Kegel, der trägt die Ionen mit dem Ion-Einlass der MS. Electrospray Ionisierung tritt aus der natürlichen Flüssigkeit der Pflanze oder vom Lösungsmittel appl IED auf der Pflanzenoberfläche. Eine Spitze auf das Gewebe der Elektrospray erleichtert und kann natürlich vorkommende oder geschaffene durch Schneiden.

Blatt-Spray MS ist eine schnelle Methode für die semi-quantitative und qualitative Analyse der intakten Pflanzengewebe, die Dienstprogramm für vielfältige Anwendungen gefunden haben. Zum Beispiel wurde die Technik zur endogene Verbindungen, verwandte Arten zu unterscheiden und auch zu Änderungen in der gleichen Spezies, die unter verschiedenen Bedingungen gewachsen bewerten zu erkennen. Frühere Studien haben hierbei gezeigt, durch die Messung der Metaboliten in Beautyberry (Callicarpa L.) ¹² und amerikanischer Ginseng (Panax Quinquefolium L.) ⁶. im zweiten Beispiel, ginsenoside, Aminosäuren und Oligosaccharide konnte nach Benetzung rohes Ginseng Gewebe nachgewiesen werden. Wilde und kultivierte amerikanischer Ginseng wurden von Knolle Scheiben⁶differenziert. Ginseng Knolle Integrität blieb nachfolgenden Blatt Spray MS, die für eine anschließende morphologische und mikroskopische Prüfung⁶erlaubt. Darüber hinaus können auch exogene Verbindungen auf Pflanzenproben nachgewiesen werden. Eine Reihe von Pestiziden (Acetamiprid, Diphenylamine, Imazalil, Linuron und Thiabendazol) wurden auf Schale und Fruchtfleisch von Obst und Gemüse⁹gefunden. Während diese Studien und viele andere das Dienstprogramm Blatt Spray MS für verschiedene spezifische Zwecke gezeigt haben, hat ein detailliertes Protokoll bisher nicht gemeldet.

Die Protokollbeschreibung wird hier nicht auf die Optimierung der Methode für eine bestimmte Gewebe oder zusammengesetzte konzentrieren. Vielmehr wird die Erkennung von Mesembrine Alkaloide von Sceletium Tortuosum (L.) N.E.Br. (Mittagsblumengewächsen) als Beispiel verwendet, um notwendigen Optimierungsmaßnahmen besprechen, die getroffen werden sollten, wenn Sie ein Blatt Spray MS Experiment für eine Art Gewebe, einrichten oder zum ersten Mal widerrufen. S. Tortuosum ist eine saftige endemisch in der semi-ariden Karroo-Region in Südafrika. Eine traditionelle Medizin der San und Khoi Khoi Völker, es diente für Appetit und Durst Unterdrückung sowie die psychotropen und analgetische Effekte^14,15. Derzeit sind standardisierte Extrakte für die Behandlung von neuropsychiatrischen und neuropsychologischen Störungen^16,17verwendet. Die primäre Verbindungen des Interesses enthalten das Alkaloid Mesembrine und seine Derivate, von die viele auch in verwandten Sceletium Arten¹⁵gefunden werden. Wilde und kultivierte Populationen von S. Tortuosum haben Variable Konzentrationen der Mesembrine Alkaloide, damit eine Qualitätskontrolle Herausforderung¹⁸präsentieren. Eine Methode für die schnelle Erkennung von Mesembrine Alkaloide, wie Blatt-Spray MS, kann bei der Überwachung der Sceletium Produkte hilfreich sein. Denn bisher es keine detaillierte visuelle experimentelles Protokoll für das Blatt-Spray MS Technik gab, wir zeigen die Methode am Beispiel von S. Tortuosumund Folgendes beschrieben: die Änderung einer Nanospray-Quelle, die Auswahl und Vorbereitung von Pflanzengewebe, die Erfassung der Daten, die Interpretation der Ergebnisse und die Optimierung der MS-Parameter.

Protokoll

1. Änderungen an Nanospray Quelle für Leaf Sprühen MS

1. Verwenden Sie eine modifizierte Nanospray Quelle für Blatt Spray MS. Da keine fluidischen Komponenten für Blatt Spray MS notwendig sind, ändern Sie die Quelle durch das Entfernen der LC-Sonde aus der Quelle.
2. Montieren Sie das Blatt MS spritzdraht, das die Spannung auf das pflanzliche Gewebe mit den entsprechenden Pin zum Einstecken in die Quelle angewendet wird. Löten Sie die Pin an einem Ende ein isolierter Draht; Löten Sie eine Klammer am anderen Ende des Drahtes.
   Hinweis: Die Klemme (Alligator-Clip-Typ) kann oder haben keine Zähne. Für kleine Gewebe wird eine Klammer ohne Zähne bevorzugt. Ein optionale Flex-Arm mit einer Klammer kann die Nanospray Quelle, bei der Positionierung der Pflanzengewebe hinzugefügt werden. Beachten Sie, dass dieses Protokoll konkret beschreibt wie Blatt-Spray MS auf einem Hybrid Quadrupol Ionenfallen Masse Analysator MS System durchführen (siehe die Tabelle der Materialien); jedoch können andere MS-Systeme geändert werden, um diese Technik⁶durchführen. Kupplung Blatt-Spray kann MS mit einer tragbaren Massenspektrometer in Echtzeit chemische Analyse vor Ort ohne die Notwendigkeit, das Pflanzenmaterial zu den Labor-^19,-²⁰transport durchgeführt werden.
3. Positionieren Sie eine antistatische Matte auf dem Boden unterhalb der Quelle, die elektrische Entladung zu reduzieren, die von der Quelle bei hohen Spannungen auftreten.

2. Vorbereitung des MS System für Blatt-Spray-MS

1. Wenn das System vor kurzem verwendet wurde, lassen Sie es kühl auf der Haut und entfernen alternative Quelle und der Sweep-Kegel. Befestigen Sie die Nanospray Blatt Spray MS Quelle.
2. Erstellen Sie eine Melodie-Datei mit den entsprechenden Ionisation Parametern wie folgt festgelegt: Mantel, Hilfs- und Sweep-Gas auf 0; die Spray-Spannung, 2 bis 5 kV; die Kapillare Temperatur auf 150-250 ° C; und die S-Objektiv HF-Pegel bis 50. Speichern Sie die Melodie-Datei mit der gewünschten Parameter^8,13. Optimieren Sie die Spannung und Temperatur für die besten Ionisation des Gewebes und widerrufen von Interesse.
   Hinweis: Gute Ausgangspunkte sind 4 kV und 200 ° C.
3. Machen Sie eine Methode-Datei einschließlich der Blatt-Spray MS-Melodie-Datei mit: positive und negative vollständige MS; eine Auflösung von 70.000; ein AGC-Ziel von 1 x 10⁶; ein Maximum von 200 ms; und den gewünschten Scan-Bereich m/Z. Alternativ können Sie nur 1 Polarität.

3. Vorbereitung des Instruments, Lösungsmittel und pflanzliches Gewebe

Hinweis: Immer Handschuhe tragen, und verwenden Sie Pflanzengewebe, die bearbeitet wurden nicht mit bloßen Händen. Andernfalls werden die Verunreinigung Ionen wie Polyethylenglykol Spektren dominieren.

1. Bringen Sie das Pflanzengewebe für die Analyse in den gleichen Raum wie das MS-System ermöglicht eine schnelle Auswahl.
2. Für pflanzliches Gewebe, das nicht natürlich Spitze, eine Rasierklinge auf einen Objektträger zu verwenden, um einen konischen Punkt (Abbildung 2) geschnitten. Bestimmen die Menge des Gewebes benötigt für die Analyse anhand der Instrument-Empfindlichkeit, Gewebetyp und widerrufen von Interesse (z. B., eine junge S. Tortuosum Blatt d. h. ~ 5 mm in der Länge).
   1. Geschnittenen S. Tortuosum fährt um 10 Wochen nach dem Keimen in dünne Streifen, die jeweils mit einem konischen Ende um einen Punkt zu bilden.
3. Verwenden Sie Zange, um sanft das Pflanzengewebe am Ende auszuwählen, die geklemmt werden. Halten Sie das Gewebe mit der Pinzette, sorgfältig auf die Klemme übertragen.
   Vorsicht: Berühren Sie die Instrument-Quelle nicht, wenn die Spannung auf.
4. Anpassen der flexible Arm und den Draht mit der Klemme, das Gewebe im Einklang mit dem MS-Einlass zu positionieren, so dass der Abstand zwischen der Pflanzengewebe und dem Ion-Einlass der MS 5-10 mm für die triple Quadrupol (z.B.TSQ) und linearen Falle Quadrupol (LTQ) und 10 -50 mm für die Ionenfalle Masse Analysator (z.B. Orbitrap)⁸.
   1. Stecken Sie das gegenüberliegende Ende des Drahtes in die Quelle. Wenn die ersten Versuche eine niedrige Signalintensität produzieren, bewegen das Pflanzengewebe näher mit dem Ion-Einlass (siehe die Diskussion zur Optimierung).
5. Laden Sie die Datei Methode; Benennen Sie die Datei und legen Sie den Speicherort der Datei. Schalten auf dem MS-System durch klicken, spielen und klicken Sie auf starten , um Erfassung von Daten zu beginnen.
6. Wenden Sie ein Lösungsmittel (z.B. Methanol) mit einem Pipettieren mit einer Gel-laden-Spitze, um den Abstand zwischen den Händen und die Hochspannung zum Schutz des Anwenders zu maximieren.
   Hinweis: Das Lösungsmittel Volumen benötigt, hängt von der Größe, Trockenheit und Textur des Gewebes, in der Regel ~ 2-20 µL. S. Tortuosum Blätter nicht Lösungsmittel hinzugefügt werden benötigen. Auftragen Sie die Lösungsmittel vorsichtig und berühren Sie die Instrument-Quelle nicht, wenn die Spannung auf. Verwenden Sie LC-MS Grade Lösungsmittel und Glaswaren, die Säure gewaschen wurde und ist frei von Reinigungsmitteln. In einigen Geweben kann ein Signal ohne Zugabe eines Lösungsmittels aufgrund der natürlichen Wassergehalt von Pflanzengewebe beobachtet werden. Jedoch wird eine höhere Signalintensität und reduzierten S/N in der Regel durch die Anwendung eines Lösungsmittels des Gewebes erreicht.
7. Daten zu erwerben, solange das Signal anhält oder bis die angemessene Spektren gesammelt haben, in der Regel 30-60 s. Bei Bedarf wenden Sie zusätzliche Lösungsmittel um eine hohe Signalintensität für einen längeren Zeitraum hinweg beizubehalten. Die Datenerfassung zu stoppen und Anhalten der MS-System.
8. Entfernen Sie das Gewebe zu und waschen Sie die Klammer mit 100 % Methanol und einem fusselfreien Tuch. Reinigen Sie den MS Ion Einlass nach ca. 1-2 h des Erwerbs Blatt Spray MS nach Vorgaben des Herstellers. Reinigen Sie auch den MS Ion Einlass zwischen Analysen der verschiedenen Gewebetypen.

4. Data Quality Assessment

1. Öffnen Sie die Datendatei und Sichtprüfung der Basis Peak mass Chronogramm. Überprüfen Sie, dass die Signalintensität ~1.0 X 10⁷ bis 5,0 x 10⁸. Wenn das Signal niedriger ist, verschieben Sie das Gewebe näher mit dem Ion-Einlass. Wenn höher, das vordere Ende des MS System verschmutzt wird, so bewegen Sie das Gewebe weiter von den Ionen-Einlass.
2. Basierend auf das Vorhandensein oder Fehlen der Ionen des Interesses an der Massenspektren produziert, die Parameter verändert.
   Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

(5) Tandem Mass Fragmentierung

1. Entscheiden Sie, was Ionen sind von Interesse für die Tandem-Massen-Fragmentierung (MS/MS); ein Massenspektren Signal, dass > 1,0 x 10⁵ ist ausreichend für die Auswahl von Ionen für MS/MS.
2. Machen Sie eine neue Methode-Datei mit einer Aufnahmeliste m/Z , auf 4 Dezimalstellen. Klicken Sie auf globale Listen und Aufnahme. Wählen Sie unter Eigenschaften von PRM, die Fragmentierung Energie [z.B.normalisierte Aufprallenergie (NCE) von 30-50 ist eine gute Auswahl zu] und andere MS/MS-Parameter.
   1. MS/MS-Daten für Mesembrine Alkaloide erhalten, fragment der folgenden Ionen, 276.1583 m/Z, 290.1742 m/Z, und 292.1897 m/Zbei NCE 35.
      Hinweis: MS/MS-Datenerfassung kann unmittelbar nach der MS oder zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt werden. Das gleiche Gewebe kann oft nach einer vollen MS eingespannten bleiben und kann wiederverwendet werden, um MS/MS-Daten zu erfassen. Wenn jedoch eine Neulackierung kein ausreichendes Signal zur Verfügung stellt, nutzen Sie ein neues Gewebe.
3. Die MS/MS-Methode-Datei und eine benannte Datei zu laden. Schalten Sie die MS-System, und starten Sie Datenerfassung, Lösungsmittel hinzufügen, wenn nötig. Wenn ausreichende Spektren gesammelt wurden, in der Regel nach 30-60 s, stoppen Sie den Erwerb.
4. Zersplitterung in viele unterschiedliche Energien zu sammeln, bei der Zuweisung von Fragment-Ionen.
   Hinweis: Da Blatt Spray MS eine chromatographische Trennung fehlt, die Fragmentierung Spektren sind wahrscheinlich viele Ionen enthalten, und Fragmentierung bei verschiedenen Energien helfen Klarheit zu bringen.

(6) vermeintlichen Identifikationen durch genaue Masse und Tandem Mass Fragmentierung

1. Machen Sie vermeintliche Identifikationen durch Verweis auf präzise massenmessungen von öffentlich zugänglichen Metabolit Datenbanken wie z. B. Metlin²¹, menschliche Metabolom Datenbank²², Masse Bank²³, Lipid-Karten²⁴, National Institute of Standards und Technologie MS suchen²⁵, Respekt für sekundäre Pflanzenstoffe²⁶oder festzulegenden²⁷.
2. Da diese Datenbanken nicht erschöpfend sind, führen Sie eine zusätzliche Literaturrecherche auf die Pflanzenarten, die chemisch charakterisiert wie nötig.
3. Spiel Fragmentierung Ionen aus Blatt Sprühen MS/MS, zu den oben genannten Datenbanken Wenn MS/MS-Informationen verfügbar sind, oder der Literatur. Alternativ können Sie eine manuelle Interpretation der MS/MS-Fragment-Ionen oder eine Fragmentierung eines authentischen Standards durch die Direkteinspritzung oder LC-MS/MS durchgeführt.

7. die Datenanalyse

1. Konvertieren Sie die raw-Dateien von MS in MzXML Dateien mit dem MsConvert-Tool von Proteowizard²⁸.
2. Verwenden Sie die XCMS-Software-Paket in R für Peak Picking implementiert. Verwenden Sie eine direkte Infusion Verarbeitungsmethode für das Blatt-Spray MS-Analyse.
   Hinweis: Gut kommentierte für die Datenverarbeitung verwendeten Skripte finden Sie auf https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code.
3. Um semi-quantitative Messungen, Buchhaltung für die experimentelle Variabilität, Normalisieren Sie die Intensität der einzelnen Metaboliten durch die gesamte Ionenstrom (TIC) als MS Signalintensität variieren kann, teilweise durch leichte Abweichungen bei der Positionierung der Blatt-spray das Blatt in die Quelle und die Unterschiede in Blattform und Größe.
4. Alternativ können Sie Hersteller bereitgestellten Software für die Datenanalyse oder MZmine2 (bei http://mzmine.github.io/ gefunden werden)²⁹.

Ergebnisse

Bei 10 Wochen nach dem Keimen, frisch gesammelten Gewächshaus gewachsen S. Tortuosum Blätter wurden von Blatt Spray MS analysiert. Die experimentelle Workflow zum Nachweis von Metaboliten von S. Tortuosum verlässt mit Blatt-Spray, die MS in Abbildung 2dargestellt ist. Ein Blatt wurde ausgewählt, schneiden Sie in einen dünnen Streifen mit einem konischen Ende um einen Punkt zu bilden und mit dem Blatt-Spray MS Draht Clamp Vorrichtung ein...

Diskussion

Die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls stützt sich auf die Optimierung der verschiedenen Schritte für die Pflanzenarten, Gewebetyp und Ziel widerrufen von Interesse. Im Protokoll beschriebenen Parameter bieten einen guten Ausgangspunkt dar. Die folgenden experimentellen Entscheidungen müssen hergestellt und getestet werden: ob zu verwenden (1) Schnitt oder ungeschnitten Gewebe und Lösungsmittel (2) keine Lösungsmittel, (3) welche Lösungsmittel zu verwenden und in welchem Volumen (4) was die Entfernung von Gew...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Conn Pin	Digi-Key elctronics	WM2563CT-ND	pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage
small clamp	Digi-Key elctronics	314-1018-ND	CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clamp	Digi-Key elctronics	290-1951-ND	ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrink	Digi-Key elctronics	Q2Z1-KIT-ND	to cover soldering joints
NSI source Nanospray Ion Source	Thermo scientific	NA	Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap	Thermo scientific	NA	Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune Software	Thermo scientific		Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur Software	Thermo scientific
Plant of interest - S. tortousum