Spektrale Reflectometric Mikroskopie auf Markhaltige Axone In Situ

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine Schritt für Schritt Protokoll für imaging Markhaltige Axone in einer festen Gehirn-Scheibe mit imaging-Technik basierend auf spektrale Reflectometry markierungsfreie Nanobereich.

Zusammenfassung

In einem Säugetier Nervensystem bietet Myelin eine elektrische Isolierung durch hüllt die Axon-Fasern in einer vielschichtigen Spirale. Inspiriert durch seine hoch organisiert subzelluläre Architektur, entwickelten wir vor kurzem eine neue bildgebende Modalität, benannt spektrale Reflectometry (brange), die noch nie da gewesenen markierungsfreie nanoskaligen Bildgebung von live Markhaltige Axone in Situermöglicht. Das Prinzip beruht auf nanostruktureller Auskunft durch die Analyse der Reflexion Spektrum der vielschichtigen subzelluläre Struktur. In diesem Artikel beschreiben wir ein detaillierte Schritt für Schritt-Protokoll für die Durchführung einer grundlegenden brange Bildgebung der nervösen Gewebe mit einem kommerziellen konfokale mikroskopische System, ausgestattet mit einem Weißlicht-Laser und einen durchstimmbaren Filter. Wir decken die Verfahren der Probenvorbereitung, Erwerb von Spektraldaten und Bildverarbeitung für nanostruktureller Informationsbeschaffung.

Einleitung

In den Säugetieren Nervensystem bietet Myelin rasche Nervenleitung und axonalen Integrität durch hüllt die Axon-Fasern mit vielschichtigen häutigen scheiden. Seine vielschichtige Struktur besteht aus abwechselnd nanoskaligen Dünnschichten bestehend aus Plasmamembranen (~ 5 nm), Zellflüssigkeit (~ 3 nm), und extrazellulären Raum (~ 7 nm)^1,2. Optische Mikroskopie, einschließlich der jüngsten Höchstauflösung Mikroskopie, eignen sich nicht für die Beobachtung der nanoskaligen Myelin Dynamik aufgrund ihrer unzureichenden Auflösung aufgrund der optischen Beugung^3,4,5. Obwohl Elektronenmikroskopie feine Details der Myelin Nanostruktur bereitstellen können, ist es nicht kompatibel mit den lebenden biologischen Systemen aufgrund sehr invasive Probe Vorbereitungen mit chemischen Fixierung und Ultrasectioning^6,7 . Bis vor kurzem gab es keine Technik anwendbar, nanoskaligen Dynamik der Markhaltige Axone in Situzu beobachten.

Schain Et Al. berichtete zuvor, dass Markhaltige Axone bunte Lichtreflexion⁸aufweisen. Durch die Annahme der Spektralanalyse auf das reflektierte Licht, haben wir eine neue bildgebende Modalität für nanoskalige Bildgebung Markhaltige Axone, benannt spektrale Reflectometry (brange)⁹entwickelt. Brange basiert auf der Dünnschicht-Störungen, die in den mehrschichtigen Aufbau der Myelinscheide (Abbildung 1). Durch optische Simulation auf verschiedenen Axone haben wir gezeigt, dass das Reflexionsvermögen-Spektrum eine periodische Funktion der Wellenzahl und seiner Periodizität ist () ist umgekehrt proportional zu den Axon-Durchmesser (d). Diese einfache Beziehung () bietet einfache Quantifizierung der Axon Durchmesser aus den Daten der brange. Nutzen dies, offenbart wir das vorherrschende Axon prall unter milden traumatischen Hirnverletzungen in unserem vorherigen Bericht.

Die brange System basiert auf konfokalen Mikroskopie und besteht aus einer speziellen Laserquelle und Filter (Abbildung 2). Die Eingabequelle ist ein Weißlicht-Laser, Breitband spektrale Leistung für Infrarot-Regionen sichtbar. Für die Spektral Scan, das System ist ausgestattet mit zwei Akusto-optische Geräte: ein Akusto-optischen Durchstimmbare Filter (Aventurien) für die Bereitstellung einer ausgewählten Wellenlänge von Breitband-Eingangsquelle und eine Akusto-optischen Strahlteiler (AOBS) für die Führung der ausgewählten reflektiert Wellenlänge zum Detektor. Die Software für die Hyperspektrale konfokalen Mikroskopie bietet (siehe Tabelle der Materialien) eine anpassbare spektrale Scanoption nacheinander die Reflexion Bilder bei verschiedenen Wellenlängen Eingang erwerben. Darüber hinaus können die chromatische Aberration kritisch in der spektralen Messung beeinträchtigen. Daher ist ein Apochromat Objektiv empfohlen.

Der Hinweis Weißlicht-Laser erzeugen eine ungleichmäßige spektrale Leistung und die optischen Komponenten beeinflussen auch die spektrale Profil. Daher müssen die erworbenen Spektren für die anschließende Quantitative Analyse kalibriert werden. Eine geschützte Silberspiegel dient in der Regel als Referenz, die eine nahezu konstante Reflexion (> 97 %) bietet über den vollen und sichtbaren Bereich. Die erworbenen Spektren werden dann durch die Referenz-Spektren aus dem Spiegel unterteilt.

Die spektrale Schrittweite für die Spektral Scan bestimmt die Geschwindigkeit, Erwerb; Es muss daher optimiert werden. Wie eine größere Axon eine höhere spektrale Periode wurde, erfordert es feiner spektrale Probenahme. Zum Beispiel hat ein Axon mit einem Durchmesser von 10 µm, eines der größten physiologischen Axone spektrale beträgt ca. 8 nm. Nach Nyquist Sampling Kriterien, wir Beschäftigten die spektrale Samplingintervall von 4 nm um die physiologischen Axone in die Maus Nervengewebe zu decken. Dieser Ansatz dauert in der Regel über mehrere Sekunden für eine volle spektrale Scan und damit ist nicht geeignet für in-Vivo Anwendungen, wo stört die physiologische Bewegung (z.B. Atmung und Herzschlag) stabile spektralen Erwerb. Wir lösten vorher dieses Problem durch Instrumentieren maßgeschneiderte aufrechte Mikroskop, entworfen, um das gesamte Spektrum für jeden Punkt mit einem Array Spektrometer (Erwerb Geschwindigkeit ≈ 30 ms pro Pixel) zu erwerben.

In diesem Bericht beschreiben wir ein detailliertes Protokoll auf der brange Bildgebung auf einer festen Gehirn-Scheibe, die in einem kommerziellen Hyperspektrale Mikroskop ausgeführt werden können (siehe Tabelle der Materialien). Somit kann das Protokoll von Experimentatoren ohne Fachkenntnisse in optischen Instrumenten erfolgen. Wir decken auch die potenziellen Probleme und Problembehandlung für Erfassung und Analyse von Daten der brange.

Protokoll

Alle chirurgischen Eingriffe wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Sungkyunkwan University angenommen.

1. die Probenvorbereitung

Hinweis: Autoklav alle chirurgischen Instrumente vor dem Umgang mit Tieren. Führen Sie alle chirurgische Leistung in einem Saal zu chirurgischen Eingriffen. Sterile op Kittel und Handschuhe sollten von allen Personal im OP jederzeit getragen werden.

1. Gewebe-Fixierung
   1. Bereiten Sie zwei 10 mL-Spritzen, die jeweils mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer gefüllt.
   2. 7-12-Wochen alten Maus (C57BL/6J oder jede Mauslinien mit beiderlei Geschlechts) durch die Gabe von einer Mischungaus aus Zoletil und Xylazin (1:1, 20 mg/kg) oder eine andere geeignete Anästhesie Regime (z.B., Mischung von 80 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg zu betäuben Xylazin) mit einer intraperitonealen Injektion.
   3. Sobald die Maus eine chirurgische Ebene der Anästhesie (Nutzung der Zehe Pinch-Response-Verfahren) erreicht hat, setzen Sie das Herz durch das Abschneiden der Haut und den Brustkorb mit einer Schere.
   4. Schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer kleinen Schere Blut ablassen und Durchspülen der PBS und PFA Lösung nacheinander durch die linke Herzkammer mit einer Nadel (Perfusion Rate = 4 mL/min, Volumen = 10 mL für jede Lösung).
      Hinweis: Die Maus wird steif, wenn der Vorgang erfolgreich abgeschlossen ist. Die Verwendung von Augensalbe oder Sterilisation ist nicht notwendig, da das Verfahren terminal ist. Die Fixierung Verfahren kann übersprungen werden. Dieser Schritt wird jedoch empfohlen, strukturelle Verformungen einschließlich mechanische Gewebeschäden und ischämischen axonale Schwellung zu minimieren. Finden Sie für weitere Details über Gewebe Fixierung im Artikel von Gage, G. J. Et al. ¹⁰
2. Vorbereitung des Gehirns Slice
   1. Enthaupten Sie die Maus mit einer chirurgischen Schere durch den ventralen Thorax und Abdomen.
   2. Entfernen Sie die Kopfhaut und Periost mit einer entsprechend kleinen Schere bis vollständig aussetzen des Schädels.
   3. Brechen Sie die Stirnbein und schneiden Sie das Schädeldach entlang die sagittale Naht aus dem Hinterhauptsbein mit kleine Schere mit Sorgfalt nicht auf das Gehirn schädigen.
   4. Entfernen Sie vorsichtig das Schädeldach und die Dura Mater sequenziell mit feinen Pinzette.
   5. Extrahieren Sie das Gehirn mit einem weichen Plastiklöffel, kümmert sich nicht um das Gewebe zu beschädigen.
   6. Spülen Sie und genießen Sie die extrahierte Gehirn in einer 4 % PFA-Lösung für 30 min bei 4 ° C.
   7. Schneiden Sie die feste Gehirn in 100-150 µm Abschnitte mit einem Vibratome.
      Hinweis: Für weitere Details auf der Gewebe-Vorbereitung finden Sie im Artikel von Segev Et al. ¹¹. für nachfolgende Verfahren, das Gewebe sollte werden in Scheiben geschnitten in Abschnitte dünner als die Dicke der Abstandhalter.
3. Montage des Gehirns Slice
   1. Jedes Gewebe Segment 1 Objektträger und 2 quadratischen Deckgläser (22 × 22 × 0,17 mm) vorbereiten.
   2. Eines der quadratischen Deckgläser in die Hälfte geschnitten (zwei rechteckige Stücke) mit einem Glasschneider.
   3. Befestigen Sie die beiden von der halbierten Deckgläser mit einem super-Klebstoff auf die Folie-Glas.
      Hinweis: Der Abstand zwischen den zwei halbierte Gläser sollte etwas größer als die Größe des Segments Gewebe.
   4. Ernten Sie die Gehirn-Scheibe mit einem Pinsel oder einer Pipette zu und legen Sie das Gewebe auf der Folie Glas zwischen den Abstandhalter. Achten Sie darauf, nicht das Gewebe Falten.
   5. 100 μl PBS auf der Gewebeoberfläche zu verzichten.
   6. Legen Sie das Quadrat Deckglas auf der Oberseite des Gewebes. Einschluss von Luftblasen während dieser Phase zu vermeiden.
   7. Dichtung rund um das Deckglas mit einem Nagellack (oder alternativ geeigneter Klebstoffe) zur Verdampfung des PBS und Verunreinigung durch Staub während der anschließenden Bildbearbeitung Sitzung zu verhindern.
      Hinweis: In diesem Stadium kann der Experimentator pausieren.

2. Kalibrierung

1. Schalten Sie das Mikroskop mindestens 1 h vor der Bildgebung erlauben thermische Stabilisierung des Lasers Quelle (siehe Tabelle der Materialien). Dann schalten Sie die Software für die Spektral Scannen (siehe Tabelle der Materialien) und klicken Sie auf erfassen , auf der Oberseite GUI (Abbildung 3a).
2. Schalten Sie den Software-Auslöser für die Weißlicht-Laser (WLL) und Photomultiplier Tube (PMT) (Abb. 3a).
3. Wählen Sie den xyΛ-Modus auf das Drop-Down-Liste im Kauf-Modus, dann der Laser-Eingabemodus automatisch von Konstanten Prozent auf Konstanter Leistunggeändert. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Automatische SP-Bewegung. Und legen Sie dann die spektrale Fenster Eingabe Laser auf 470-670 nm und die spektrale Schrittweite bis 4 nm auf Λ-Erregung Lambda Scannen Einstellungen (Abb. 3 b).
4. Legen Sie die spektrale Bandbreite PMT auf 450-690 durch einen Doppelklick oder verschieben die Schieberegler für Spektralbereich (Abb. 3 c).
   Hinweis: Diesem Spektralbereich gehören die komplette Bandbreite der Eingangsquelle.
5. Wählen Sie ein Eintauchen in Wasser Objektiv passend mit hoher numerischer Apertur (NA > 0,7) und geben einen Wert an die PMT und Laser macht AOBS Konfiguration und Live-Scan -Taste aktivieren. Schalten Sie den Strahlengang durch Reflexion in der AOBS Konfiguration (Abbildung 3d) überprüfen.
6. Einen Referenz-Spiegel zu montieren (siehe Tabelle der Materialien) auf den Mikroskoptisch. Die Spiegelfläche sollte gegen das Objektiv konfrontiert werden. Wenn es nicht einfach, den Spiegel auf den Mikroskoptisch zu setzen ist, binden Sie einen Spiegel auf den flachen Teller (z. B. Folie Glas).
7. Kontrolle der Mikroskoptisch die Brennebene auf der Spiegelfläche ausrichten.
8. Passen Sie die PMT-Verstärkung und die Laserleistung, die unter Berücksichtigung den dynamischen Bereich des Detektors und ändern Sie den Eingabemodus Laser von Konstanten Prozent auf Konstanter Leistung.
   Hinweis: Wie üblich, eine PMT einen Gewinn von 500 (V) und eine relative Laserleistung von 0,1 % dienen bei 570 nm.
9. In einem Pseudo-Farbmodus zu überprüfen, dass es keine Sättigung im gesamten Wellenlängenbereich zu bestätigen. Wenn Sättigung beobachtet wird, senken Sie die Laserleistung (Abb. 3a).
10. Laufen Sie mit dem Lambda zu scannen .
11. Entfernen Sie den Spiegel von der Bühne, und wiederholen Sie den gleichen Erwerb ohne eine Probe um die dunkle Referenz (d.h. dunkle Versatz) zu erhalten.
12. Sichern Sie die Daten in einem Multistacked TIF -Format.

(3) brange Bildaufnahme

1. Legen Sie das montierte Gewebe auf Mikroskoptisch. Um etwa das Gewebe auf der Brennebene der Objektivlinse auszurichten, verwenden Sie die Weitfeld-Fluoreszenz-Modus durch ein Okular.
2. Mit der Live-Scan auf, Kontrolle der Mikroskoptisch ausrichten die Brennebene auf die Region des Interesses im Gewebe. Um die Hintergrundgeräusche aus dem Deckglas zu vermeiden, wählen Sie die Zielregion mindestens 15 μm Tiefe aus dem Glas-Gewebe-Interface.
3. Erwerben Sie die spektrale Bildstapel für die Zielregion mit dem gleichen Verfahren wie in 2.1-2.10 beschrieben.
4. Sichern Sie die Daten für das Gewebe und die dunklen Offset im Multistacked TIF -Format.
   Hinweis: In diesem Stadium kann der Experimentator pausieren.

4. Verarbeitung und Analyse von Bildern

1. Öffnen Sie die spektralen Daten (multistacked TIF) für den Referenz-Spiegel und das Hirngewebe in ImageJ.
2. Wählen Sie die ROIs (Regionen von Interesse) für das geöffnete Bild Stacks – den zentralen Bereich für den Referenz-Spiegel und das Segment von einem Axon Faser für das Hirngewebe.
3. Die rohen Spektren für die ausgewählten ROIs durch laufende Bild → Stapel → erwerben Plot z-Profil im Menü ImageJ.
4. Öffnen Sie die dunklen Offset Daten, eine für den Referenz-Spiegel und die anderen besessenen für das Hirngewebe genommen.
5. Erwerben Sie die Spektren für die dunklen Offsets von laufenden Bild → Stapel → Plot z-Profil im Menü ImageJ.
6. Speichern Sie alle erworbenen Spektren mittels Kopieren und Einfügen -Optionen.
   Hinweis: Für die brange Bildgebung ist die zentrale Bildfeld einfallenden optische Aberrationen minimieren empfohlen. Die Axon-Fasern können strukturell heterogenen entlang ihrer Länge sein. Daher empfiehlt sich den ROI auf einem kleinen Axon-Segment auswählen, in der Regel < 5 µm, teilweise-Volumen Artefakt zu minimieren.

5. Basislinienkorrektur und brange Signalanalyse

1. Subtrahieren Sie die Offset Spektren aus den Spektren des Referenz-Spiegels und das Hirngewebe.
2. Jedes Spektrum durch die Aufteilung der maximalen Intensität des Spektrums zu normalisieren.
3. Teilen Sie das normalisierte Spektrum des Axons durch die normalisierten Spektrum des Referenz-Spiegels und subtrahieren Sie DC-Offset aus dem normalisierten Spektrum.
4. Messen Sie die Wellenzahl Frequenz durch den Einbau der erworbenen Spektrum an einer sinusförmigen Kurve (siehe Tabelle der Materialien) und dann konvertieren Sie die erworbenen Wellenzahl, Periodizität durch Einnahme von Gegenseitigkeit.
5. Konvertieren Sie die Wellenzahl Periodizität in den Axon Durchmesser unter Verwendung der Gleichung in Abbildung 4 c.

Ergebnisse

Nach dem Protokoll wurde eine feste Gehirn-Scheibe mit exogenen beflecken, einem Myelin-targeting Fluorophor vorbereitet (siehe Tabelle der Materialien). Brange Bildgebung erfolgte auf die Gehirn-Scheibe mit einem kommerziellen Hyperspektrale confocal Mikroskop in Verbindung mit konfokale Fluoreszenz imaging (Abb. 4a). Für brange wurde Eingangs optischen Intensität auf 5 µW/µm² mit einer Pixel-Verweilzeit von ~ 1 µs festgelegt...

Diskussion

Brange ist eine neue markierungsfreie imaging-Modalität basierend auf spektrale Interferometrie, die zum ersten Mal im Leben Markhaltige Axone der nanoskaligen Informationen bietet. In der aktuellen Übernahme-Protokoll ist die räumliche Auflösung für den Axon Durchmesser des Ordens 10 nm. Darüber hinaus nutzt brange der Größenordnungen niedriger Lichtdosis im Vergleich zu anderen super-Resolution-Microscopies; Somit ist es frei von Phototoxizität und Immunofluoreszenz. Brange böte eine neue Allee für nanoskali...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass cutter	-	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
Nail polish	-	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
Apochromat objective 40×, NA 1.1	Leica Microsystems	15506357	Water-immersion type
Fluoromyelin Green	Thermo Fisher	F34651	Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used.
Leica SP8 TCS microscope	Leica Microsystems	SP8	Refer to the "Configuration of microscope" in Introduction Section for details.
Imaging software	Leica Microsystems	LAS-X	-
Matlab	MathWorks	-	-
Mirror	Thorlabs	PF10-03-P01	Coated with protected silver.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Life technologies	14190-136	-
Paraformaldehyde	Biosolution	BP031a	4% v/v in PBS
Cover slip	Thermo Fisher	3306	Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm)
Slide glass	Muto Pure Chemicals	5116-20F	Thickness: ~1 mm
Super glue	Henkel	Loctite 406	Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact.
Syringe pump	Brainetree Scientific	BS-8000 DUAL	-
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200S	-
White-light laser	NKT photonics	EXB-6	EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6.