Analyse der N- Glykane von Raphanus Sativus Sorten verwenden PNGase H+

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine einfache und schnelle Methode für die Aufbereitung und Analyse von N- Glykanen aus verschiedenen Sorten von Rettich (Raphanus Sativus).

Zusammenfassung

In den letzten Jahren haben die Kohlenhydrat-Moieties Pflanzen beträchtliche Aufmerksamkeit empfangen, da sie eine potentielle Quelle von kreuzreaktiven, Allergie provozieren Immunantworten sind. Darüber hinaus auch spielen Kohlenhydrat-Strukturen eine entscheidende Rolle im Stoffwechsel der Pflanze. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und schnelle Methode für die Vorbereitung und Analyse von N- Glykanen aus verschiedenen Sorten von Rettich (Raphanus Sativus) mit einem N- Glycanase speziell für die Freisetzung von pflanzliche Kohlenhydrat-Strukturen. Um dies zu erreichen, wurden grobe Trichloressigsäure Säure Ausscheidungen von Rettich Homogenates mit PNGase H⁺behandelt und mit 2-aminobenzamid als fluoreszierende Tag gekennzeichnet. Die beschrifteten N- Glycan Proben wurden anschließend durch ultra-Performance liquid Chromatography (UPLC) Trennung und Matrix-assisted Laser Desorption ionisation-Zeit der Massenspektrometrie Flug (MALDI-TOF) für eine detaillierte Struktur-analysiert. Bewertung und die relative Abundancies der Rettich abgeleitet N- Glycan Strukturen zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann auch für die Analyse von N- Glykanen aus verschiedenen anderen Pflanzenarten verwendet werden und kann für weitere Untersuchungen der Funktion und Wirkung von N- Glykanen auf die menschliche Gesundheit nützlich sein.

Einleitung

N- Glykane in Pflanzen haben erhöhte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren gezogen, wie die bisherige Forschung N- Glykane als eine potenzielle Quelle für immunologische Kreuzreaktionen hervorhob, die allergische Reaktionen^{1,2 provozieren kann} . Es nachweislich bereits, dass N- Glykane auf Pflanze Glykoproteine katalytische Aktivität^3,4, Thermostabilität und klappbare^5,6 oder subzelluläre Lokalisierung beeinflussen kann und Sekretion⁷. Um die Glycan-Strukturen mit ihren jeweiligen Funktionen zu korrelieren, muss N- Glykane zuerst aus Glykoproteinen entweder chemisch oder enzymatisch entlassen werden. Die klassische chemische Methode für die Freigabe von N- und O- Glykanen ist β-Eliminierung, in denen alkalische Probenbehandlung durch Reduktion mit Natriumborhydrid ein Alditol⁸weichen begleitet wird. Jedoch dieses Verfahren schließt mit einem Fluorophore beschriften und verursacht erhebliche Verfall der Monosaccharid-Einheiten aus der reduzierenden Ende der Glycan Struktur. Chemische Deglycosylation basierend auf Ammonium Hydroxid/Carbonat Behandlung ist auch eine häufig verwendete alternative Methode⁹. Keines dieser Verfahren chemische Freisetzung verschlechtert intakte Proteine, die massenspektrometrische Analyse der unbeschrifteten Glycan Pools ohne die Einmischung von Peptid-Fragmente in den gleichen Massenbereich ermöglicht. Ein Nachteil dieser Methoden ist jedoch die erhöhte Abbaurate von α1, 3-Fucosylated N- Glykane, eine gemeinsame Struktur der Kohlenhydrate in Pflanzen¹⁰gefunden. Alternativ, enzymatischen Freisetzung von Methoden mit Peptid:N- Glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) werden auch eingesetzt. Rekombinante PNGase F (von Flavobacterium Meningosepticum) ist die häufigste Wahl und erlaubt die Freigabe aller Arten von N- Glykanen, außer die Strukturen mit einem Kern α1, 3 Fucose^11,12. PNGase A (isoliert aus Mandel Samen) ist daher in der Regel für die Analyse der Anlage N- Glykane¹³verwendet. Jedoch dieses Enzym Deglycosylates nur proteolytisch abgeleitete Glykopeptide, und ist nicht in der Lage, Deglycosylate native Glykoproteine¹⁴. Daher ist eine mehrstufige Probe Aufarbeitung vor weiteren Analyse erforderlich, die umfangreichen Verlust von Glykoproteinen, insbesondere der niedrige Fülle¹⁵führt. Das übergeordnete Ziel der Methode ist, einen optimierten Arbeitsfluss für N- Glycan Release und Fluoreszenz-Beschriftung in eine einfache und robuste Art und Weise zu präsentieren. Die zugrunde liegende Logik ist, dass PNGase H⁺, das war vor kurzem in Terriglobus Roseus entdeckt und in E. Colirekombinant ausgedrückt werden kann, können N- Glykane direkt aus dem Protein-Gerüst in sauren hydrolyseneigung Bedingungen-¹⁶. Ein entscheidender Vorteil der Verwendung von PNGase H⁺ gegenüber alternativen Methoden ist, dass fluoreszierende Kennzeichnung Reaktionen in der selben Reaktionsgefäß durchgeführt werden können, ohne die Reaktion Puffer^17,18. Die einfache Zubereitung Bedingungen und hohe Rückgewinnung von niedrig-Fülle Oligosaccharide machen diese Methode ein wertvolles Werkzeug in der Analyse von N- Glykanen. Dieses Protokoll eignet sich für die Analyse der N- Glykane von verschiedenen Pflanzenarten.

Protokoll

1. die Probenahme

1. Verschiedene Sorten von frischem Rettich (Raphanus Sativus L.) zu erwerben.

2. Isolierung von Proteinen aus Rettich

1. Ca. 100 g frische Radieschen mit einem Küche Mixer für 10 min zu homogenisieren.
2. Übertragen Sie die Gülle 50 mL Zentrifugenröhrchen, Zentrifuge bei 14.000 × g bei 4 ° C für 20 min die unlösliche Material zu entfernen.
3. Übertragen des Überstands vorsichtig in eine neue 50 mL Zentrifugenröhrchen und fügen Sie ein gleiches Volumen 2 M Trichloressigsäure Säure (TCA) Lösung.
   Hinweis: Hinzufügen von TCA wird löslich (Glyco) Proteine ausgefällt.
4. Bei 14.000 × g bei 4 ° C für 30 min zentrifugieren und den überstand von gebeizte (Glyco) Proteine zu entfernen.
5. Waschen Sie die Pellets mit 20 mL entionisiertem Wasser und Zentrifuge bei 14.000 × g bei 4 ° C für 5 min, lösliche Oligosaccharide und Polysaccharide zu entfernen.
6. Wiederholen Sie Schritt 2.5. vier Mal.
7. Wieder aussetzen Sie, die Pellets in 1 mL entionisiertem Wasser und Übertragung auf eine frische 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.

3. Vorbereitung der N- Glykane

1. Mix 50 µL Proteinlösung aus Schritt 2.7. (Dies entspricht 5 g frische Radieschen) mit 0,2 mU von rekombinanten PNGase H⁺ in 10 mM-Essigsäure.
2. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 37 ° C für 12 h. Zentrifugieren Sie nach der Inkubation bei 14.000 × g für 5 min um die extra-Protein und Enzym zu entfernen.
3. Übertragen Sie den überstand auf eine frische 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.

4. Reinigung des N- Glykane

1. Vorbereiten der Festphasen-Extraktion (SPE) Spalte zu bereichern die N- Glykane und Salze und andere Verunreinigungen zu entfernen, aus dem Reaktionsgemisch, Erhöhung der Selektivität des Fluorogenic 2-aminobenzamid (2-AB) Kennzeichnung Agenten für N- glycan Derivatisierung.
   1. Fügen Sie 3 mL deionisiertes Wasser, waschen Sie die Spalte hinzu.
   2. Fügen Sie 3 mL 80 % Acetonitril Lösung mit Trifluoroacetic Säure (TFA, 0,1 % V/V), um aktiv die SPE-Spalte hinzu.
   3. Hinzugeben Sie 3 mL deionisiertes Wasser für den SPE-Säulen equilibrate.
2. Die Probe von Schritt 3.3 auf die Säule übertragen und die Durchströmung zu verwerfen.
3. Hinzugeben Sie 1,5 mL deionisiertes Wasser, waschen Sie die Spalte und entsorgen Sie den Durchfluss.
4. Eluieren freigegeben N- Glykane aus der Spalte mit 1,5 mL 20 % Acetonitril Wasserlösung mit 0,1 % TFA (V/V) in ein 2 mL Zentrifugenröhrchen.
5. Entfernen Sie das Lösungsmittel durch zentrifugale verdunsten bei Raumtemperatur. Verdampfen Sie, bis die Probe vollständig trocken ist.

(5) Fluoreszenz Derivatisierung von N- Glykanen

1. Bereiten Sie 1 mL 2-AB-Lösung, bestehend aus 35 mM 2-AB und 0,1 M-Natrium-Cyanoborohydride in Dimethyl Sulfoxid/Essigsäure Säurelösung (7:3, V/V).
2. Fügen Sie sechs verschiedene Radieschen 5 µL 2-AB-Lösung für die getrockneten Proben (Schritt 4.5.) abgeleitet. Vortex: jede Probe, bis Sie vollständig aufgelöst.
3. Inkubieren Sie die Mischung für 2 h bei 65 ° c
4. Lassen Sie die Probe auf Raumtemperatur für 5 min abkühlen, und fügen Sie 5 µL deionisiertes Wasser und 40 µL Acetonitril. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 14.000 x g für 3 min.
5. Übertragen Sie 48 µL aus der Überstand in ein 300 µL High-Erholung-HPLC-Fläschchen. Speichern Sie die derivatisierte N- Glycan Proben bei-20 ° C bis zu einem Monat.

6. HILIC-UPLC Profilierung der N- Glykane

1. Analysieren Sie die Proben unter Verwendung eines Standardsystems UPLC bzw. an eine Online-Fluoreszenz-Detectorset bei der Anregung/Emission Wellenlängen von 330 nm/420 nm, angeschlossen.
2. Verwenden Sie eine hydrophobe Wechselwirkung Flüssigkeitschromatographie (HILIC)-UPLC Glycan Spalte an eine Spalte Temperatur von 60 ° C für die Analyse.
3. Bereiten Sie Lösungsmittel A durch Verdünnung 50 mL der Stammlösung (1 M Ammonium-Formiat Lösung, pH 4,5) mit 950 mL flüssige Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LCMS)-Wasser zu benoten. Bereiten Sie die Stammlösung wie folgt:
   1. 700 mL LCMS-Klasse H₂O. 43 mL Ameisensäure hinzufügen
   2. Stellen Sie den pH-Wert auf 4,5 durch tropfenweise Zugabe von wässrigen Ammoniaklösung (25 % w/w).
   3. Das Lösungsmittel auf ein Messzylinder übertragen und LCMS-Klasse H₂O. Store bei 4-6 ° C für bis zu 3 Monaten bis zu 1000 mL einfüllen.
4. Verwenden Sie LCMS-Grade Acetonitril als Lösungsmittel B.
5. N- Glykane mit folgenden Farbverlauf Elution zu trennen:
   1. Durch das Hinzufügen von 95 % der Lösungsmittel B in Lösungsmittel A. Set die Durchflussmenge bei 0,5 mL/min von 0 bis 44,5 min starten.
   2. Von 0 min bis 6 min verringern Sie allmählich den Anteil des Lösungsmittels B mit einem linearen Farbverlauf to78 %.
   3. Von 6 min bis 44,5 min verringern Sie allmählich den Anteil des Lösungsmittels B mit einem linearen Farbverlauf auf 55,9 %.
   4. Von 44,5 min bis 46,5 min schnell verringern Sie den Anteil des Lösungsmittels B mit einem linearen Farbverlauf von 55,9 % auf 0 % bei 0 % für 2 min halten Sie und initiieren Sie Waschen der Spalte zu. Reduzieren Sie die Durchflussmenge auf 0,25 mL/min von 44,5 auf 55 min.
   5. Waschen Sie die Spalte weiter durch Lösungsmittel B auf 95 % von 48,5 min bis 50,5 min erhöhen und bei 95 % für 4,5 min halten.
   6. Re equilibrate der Spalte um die Startbedingungen des 95 % Lösungsmittel B mit 0,5 mL/min von 50,5 auf 57 min.
6. Injizieren Sie 45 µL der Probe in der UPLC-System.
7. Eluieren Sie die N- Glykane von UPLC mit Retentionszeiten zwischen 15 und 40 min.
8. Jeder beobachteten UPLC Peak Bruch mit 2 mL Zentrifuge Röhren sammeln und Trocknen der Proben durch zentrifugale verdampfen.
9. Injizieren Sie ungefähr 1 Pmol 2-AB mit der Bezeichnung Dextran standard (2−20 Glucose-Einheiten), die Pflanze -N- Glycan Profilierung zu kalibrieren und ihre Elution Zeiten in standardisierten Glucose-Einheiten zuweisen.

(7) MALDI-TOF-MS-Analyse

1. Auflösen der Proben aus Schritt 6,8 in 5 µL LCMS-Wasser zu benoten. Mix 1 µL der Probenlösung und 1 µL 6-Aza-2-Thiothymine (ATT) Lösung (0.3 % w/V in wässrigem Acetonitril 70 % V/V) und die Mischung auf die MALDI-TOF-Probenträger Pipette.
2. Analysieren Sie die Proben mit einem MALDI-TOF Massenspektrometer Instrument im positiven Ionen-Modus durch Drücken der Schaltfläche " starten ".
3. Analysieren Sie die Massenspektren mithilfe der begleitenden MALDI-TOF-MS-Analyse-Software.
4. Interpretieren Sie die Spektren, die mit einer open-Source Glycan Auslegung Software¹⁹. Legen Sie die Suchparameter für 2-AB Kennzeichnung [M + Na]⁺, und legen Sie den Parameter Genauigkeit 2.0 da.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über die beschriebene Protokoll, einschließlich der Isolierung von Proteinen (Glyco-) aus Rettich, der Vorbereitung von N- Glykanen, UPLC Analyse und die MALDI-TOF-MS-Analyse dieser Komponenten. Abbildung 2 zeigt repräsentative UPLC Chromatogramme von derivatisierte N- Glykane der analysierten Rettich Sorten. Abbildung 3 zeigt die ...

Diskussion

Das Protokoll, die, das wir hier vorgestellt haben, erlaubt den Vergleich der N- Glycan Profile von verschiedenen Sorten von Rettich. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode im Vergleich zu bestehenden Protokolle ist, dass keine Puffer Änderungen zwischen die enzymatische Freisetzung von N- Glykanen und der Derivatisierung Reaktion mit 2-AB erforderlich sind. Der wichtigste Schritt dieses Verfahrens ist die Reinigung von N- Glykanen mit der Spalte "SPE" als Verstoß gegen Salze zu entfernen od...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
Trichloroacetic acid	SCR, Shanghai	80132618
Acetic acid glacial	Huada, Guangzhou	64-19-7
Acetonitrile	General-reagent	G80988C
Trifluoroacetic acid	Energy chemical	W810031
2-aminobenzamide	Heowns, Tianjin	A41900
Sodium cyanoborohydride	J&K Scientific Ltd	314162
Dimethyl sulfoxide	Huada, Guangzhou	67-68-5
2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol	Agilent Technologies	AT-5190-6998
6-Aza-2-thiothymine	Sigma	275514
Tools/Materials:
Kitchen blender	Bear, Guangzhou	LLJ-A10T1
Centrifuge	Techcomp	CT15RT
Centrifugal Evaporator	Hualida, Taicang	LNG-T120
SPE column	Supelco	Supelclean ENVI Carb SPE column
MALDI-TOF mass spectrometer	Bruker	Autoflex
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial	Agilent Technologies	# 5188-2788
HPLC System	Shimadzu	Nexera
Fluorescence Detector for HPLC	Shimadzu	RF-20Axs
Column oven	Hengxin	CO-2000
HPLC Column	Waters	Acquity UPLC BEH glycan column	2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size
LCMS-grade Water	Merck Millipore	#WX00011
LCMS-grade Acetonitrile	Merck Millipore	# 100029
Formic acid	Aladdin	F112034
Ammonia solution	Aladdin	A112080