Caenorhabditis Sieb: Ein Low-Tech-Instrument und Methodik für die Sortierung von kleiner vielzelliger Organismen

Zusammenfassung

Das aktuelle Protokoll beinhaltet eine Methodik für die Sortierung und Reinigung Alter abgestimmt Populationen von Caenorhabditis Elegans. Es verwendet eine einfache, kostengünstige, und effiziente maßgeschneiderte Werkzeug um eine große experimentelle Population von Nematoden für Forschung zu erhalten.

Zusammenfassung

Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist eine etablierte Modellorganismus verwendet in einer Reihe von grundlegenden und biomedizinischen Forschung. Innerhalb der Nematoden Forschungsgemeinschaft ist eine Notwendigkeit für eine kostengünstige und effektive Möglichkeit, großer, Alter abgestimmt Populationen von C. Eleganszu. Hier präsentieren wir eine Methodik für die mechanisch sortieren und Reinigen von C. Elegans. Unser Ziel ist es, eine kostengünstige, effiziente, schnelle und einfache Verfahren um Tiere einheitliche Größen und Stufen für den Einsatz in Experimenten zu erhalten. Dieses Tool, das Sieb Caenorhabditis verwendet eine Custom-Built Deckel-System, die Gewinde auf gemeinsame konische Labor Röhren und C. Elegans anhand der Körpergröße sortiert. Wir zeigen auch, dass das Sieb Caenorhabditis Tiere effektiv aus einer Kultur Platte überträgt, zu einem anderen ermöglicht eine schnelle Sortierung, synchronisieren und Reinigung ohne Beeinträchtigung der Marker für Gesundheit, einschließlich der Motilität und Stress-induzierbaren gen-Reporter. Dieses allgemein zugänglicher und innovativer Tool ist eine schnelle, effiziente und nicht stressig-Option für die Aufrechterhaltung der Populationen von C. Elegans .

Einleitung

Die Nematoden Wurm Caenorhabditis Elegans, ist eine führende Modellorganismus. Neben der einfachen und kontrollierten Natur ihrer Züchtung im Labor ihre gesamte Genom sequenziert¹ und Entwicklungsstörungen Schicksal jeder Zelle ist bekannt². Aufgrund dieser Eigenschaften ist C. Elegans weit verbreiteten Modellorganismus für genetische Studien. Zusammen mit diesen vorteilhaften Eigenschaften kommen jedoch einige Herausforderungen für Forscher. Aufgrund ihrer schnellen Generationszeit C. Elegans Populationen können schnell laufen aus der Nahrung und/oder Populationen mit mehreren Generationen vermischt werden und Entwicklungsstadien auf einmal präsentieren. Folglich erfordern Experimente auf solide Nematoden Wachstumsmedien (NGM) Forscher körperlich bewegen Tiere zu frischen Teller, bevor die bakterielle Nahrungsquelle erschöpft und neue Larven entwickeln. Dies kann mühsam sein, da eine häufige Übertragung der Tiere erforderlich ist, um zu verhindern, dass die experimentellen Populationen von mit Nachkommen Generationen vermischt. Jedoch erfordern einige Experimente sowohl große Anzahl von Tieren und längere Zeitpunkte (z.B. DNA oder RNA-Extraktion im Erwachsenenalter). Dies verstärkt die Entwicklung genau zu erhalten eine synchronisierte Bevölkerung und große Zahl von Tieren übertragen.

Aktuelle Methoden der Übertragung von C. Elegans kultiviert auf NGM Kommissionierung oder Waschen der Tiere von Platte zu Platte; chemische Behandlung der Tiere (z. B.mit der DNA-Replikation-Inhibitor Fluorodeoxyuridine oder FUDR); oder mittels Durchflusszytometrie, um die Tiere im Multi-well-Platten zu sortieren. Kommissionierung beinhaltet die Verwendung von ein Handwerkzeug, gemacht mit einer dünnen Platindraht oder eine Wimper manuell einzelne oder mehrere Tiere^3,4übertragen. Diese Methode ist korrekt, aber erfordert Geschick und Zeit und ist eine Einschränkung für Studien, die große Zahl von Tieren. Mai auch sein körperlich schädlichen und stressig für die Tiere durch potenziell Personen unnatürlich und inkonsistente Mengen von Störung und Kraft zu unterwerfen. Waschen umfasst Spülen einer Kulturschale mit einer Pufferlösung und die Lösung mit den Tieren über Glas Pasteurpipette auf eine neue Kultur-Platte zu übertragen. Diese Methode ist schnell und effizient aber ist nicht genau, wie mehrere Generationen und Entwicklungsstadien der Tiere in der Masse übertragen werden. Chemische Behandlungen, wie z. B. FUDR, können in die Kultivierung Medien, um zu verhindern, dass die Produktion von Nachkommen durch Sperrung DNA-Replikation, und somit die Gameten Produktion und Ei-Entwicklung aufgelöst werden. Während wirksam, nach Entwicklungsstörungen Reifung, nicht die normalen Entwicklungsprozesse stören diese Methode angewendet werden, und dies bedeutet, dass es noch eine Voraussetzung um die Tiere vor seine Verwaltung³zu übertragen. Diese Methode beeinflusst auch mehrere zelluläre Signalwege, die spürbare Auswirkungen auf die Tiere wenn sie älter werden (z.B., eine Lebensdauerverlängerung oder eine veränderte proteostase) abhängig von der Sorte von C. Elegans verwendet^{5, 6,7,8,9,10}. Flow Cytometry Methoden automatisch sortieren und individuelle C. Elegans aus einem Multi-well-Platte auf eine andere¹¹übertragen. Während diese Methode sehr effektiv und effizient ist, ist Flow Cytometry Ausrüstung unerschwinglich teuer und für viele Forscher nicht zugänglich. Eine Alternative zur Übertragung von Tieren soll mutierten Modelle verwenden, die sind temperaturempfindlich, z. B. Fer-15 und Fem-1, die steril mit Temperatur Einstellung¹²geworden. Verwendung von mutierten Tieren in einigen Situationen nützlich ist, diese spezifische Stämme wachsen langsamer als Wildtyp Tiere und sie verlassen sich auf eine veränderte Genom, als schlechte Vertreter für alternde oder gesunde Würmer. Darüber hinaus das Vertrauen auf eine temperaturverschiebung induzieren Sterilität führt auch das Fehlen von einer statischen Umgebung, und Temperaturschwankungen leicht nachweislich Einfluss auf Gen Ausdrücke^{13,14, 15}. Forschungsgruppen haben zuvor veröffentlichten Techniken beschreiben die Verwendung eines Netzes zum Filtern von C. Elegans nach Größe¹⁶. Jedoch konnten wir finden Vorarbeiten Tests für alle Änderungen an den allgemeinen Gesundheit Resultaten, die den Einsatz von solchen Filtern zugeordnet werden können.

So gibt es eine Notwendigkeit in C. Elegans Forschungskreisen eine kostengünstige, effiziente, schnelle und präzise Methode zur Übertragung von großen Anzahl von Tieren zwischen Kultur Platten. Wir haben eine verbesserte, zugängliche Stück Ausrüstung (benannt Caenorhabditis Sieb) und eine zugehörige Protokoll für seine Herstellung und Betrieb, die den Bedürfnissen der Forschungsgemeinschaft C. Elegans entwickelt. Hierin, teilen wir das Design der Caenorhabditis Sieb und Methoden für den Einsatz, und wir zeigen, dass ihre Verwendung nicht die allgemeine Gesundheit oder alle Stress-Marker im Vergleich zu standard manuellen Kommissionierung und eine Behandlung mit den gängigen auswirkt, Einschränkung der Fruchtbarkeit chemische FUDR.

Protokoll

1. Caenorhabditis Sieb Konstruktion und Verwendung

1. Konstruktionsprotokoll
   1. 2 Deckel aus 50 mL konische Röhrchen (Abbildung 1A) zu erwerben.
   2. Entfernen Sie den mittleren Bereich innerhalb der inneren Lippe der Lider (betrachtet von unten, Abb. 1 b) mit dem Bunsenbrenner und Roheisen Sonde oder einen Lötkolben oder trat Bohrer.
      Hinweis: Mit Wärme, um die Kunststoff-Deckel zu schneiden ist eine Klinge vorzuziehen, da gibt es weniger Verletzungsgefahr.
   3. Reinigen Sie und Schleifen Sie die Schnittkanten und oben Sie die Oberfläche mit einer gebogene Feile oder einem Rotary Schleifwerkzeug (z.B.Dremel). Siehe Abbildung 1.
   4. Schneiden Sie den Kreis der das Monofilament Netz auf den entsprechenden Durchmesser (Abbildung 1). Hierzu verfolgen Sie einen Deckel auf einem Monofilament Netz Nylonblatt und schneiden Sie nur innerhalb der Linie gezeichnet.
   5. Schneiden Sie Nuten/Schrägstriche in die obere Fläche der Deckel zur Verbesserung der Adhäsion von zwei Deckeln, wenn Klebstoff auf den Kunststoff (Abbildung 1E) angewendet wird.
   6. Die Deckel mit Ethanol zu reinigen und trocknen lassen.
   7. Cyanacrylat Kleber auf der Oberseite der beiden Deckeln, halten bis zum äußeren Rand.
      Hinweis: ein wenig Leim geht ein langer Weg.
   8. Legen Sie das Monofilament Netz gemäß Tabelle 1, auf einem geklebten Deckel (Abb. 1F). Setzen Sie den zweiten Deckel oben auf das Netz invertiert; Beide Deckel müssen ihre Spitzen zusammen. Drücken Sie fest zusammen (Abb. 1). Stellen Sie sicher, dass das Netz straff gespannt ist.
      Hinweis: als Sicherheitsmaßnahme, Verwendung Pinzette um das Netz auf den Deckeln zu platzieren.
   9. Sobald die erste Schicht der Leim getrocknet ist, wenden Sie einen Ring aus Cyanacrylat-Klebstoff um die äußeren Lücke zwischen den Deckeln. Seien Sie großzügig, da dies Integrität fügt und jede Peeling auseinander oder undicht verhindert.
   10. Beschriften Sie den Filter mit einer Pore Maschenweite des Netzes Monofile.
       Hinweis: Hier verwenden wir zwei Maschengrößen Pore – 20 µm und 50 µm.
2. Verwenden Sie Protokoll
   1. Vornässen der Sieb.
      1. Pipette eine Kochsalzlösung, z. B. M9 [5 g NaCl, Na₂HPO₄6 g, 3 g KH₂PO₄, 1 L von hochreinen H₂O und 1 mL MgSO₄ (1 M)]¹⁷, durch die Mitte des Siebes bis sich ein Tröpfchen bildet , kondensiert und tropft ab der Mitte des unteren Filter (Abbildung 2A). Optional, gelten ein fusselfreies Tuch (z.B.windex) auf den Boden zu gestalten oder einen Tropfen Feuchtigkeit auf das Netz zu verbreiten.
      2. Legen Sie das Sieb über eine 50 mL konische Rohr. Beschriften Sie das Rohr als "Abfall-Tube" (Abb. 2 b).
   2. Waschen Sie eine Bevölkerung von C. Elegans aus einer nährbodenplatte.
      1. Waschen der Platte mit der M9-Puffer und der Wurm-haltigen Medium auf der Oberseite der Monofilament Netz 1 mL zu einem Zeitpunkt (Abbildung 2). Achten Sie darauf, in der Mitte des Netzes zu betreiben. Waschen Sie alle Würmer von der Platte.
         Hinweis: In der Regel 3 mL M9 für eine 60 mm-Platte ist ausreichend.
      2. Um die Anzahl der Würmer in pipettieren verloren zu minimieren, verwenden Sie ein Glas Pasteurpipette, um die Würmer aus der Platte und in das Netz-Zentrum (Wiederholung nach Bedarf) zu bewegen.
      3. Spülen Sie den Filter mit dem M9-Puffer von oben. Wieder, stellen Sie sicher, in der Mitte des Netzes zu betreiben und spülen alle Würmer in diesem Bereich. Waschen Sie sich so oft wie notwendig, um sicherzustellen, dass das Netz die Bakterien und kleinere Würmer durchlaufen haben.
   3. Ernten Sie die Größe angepasst Tiere vom Sieb.
      1. Legen Sie eine neue 50 mL konische Rohr an die Spitze des Siebes mit der erwachsenen Würmer aus Schritt 1.2.2.3 mit Blick auf das Innere der neuen Kollektion-Röhre (Abb. 2D).
      2. Entfernen Sie das erste Rohr (Abwasser Rohr) und Blättern Sie schnell über das Sieb und die neue Röhre, die Tröpfchen von Migration zu halten (Abbildung 2E).
         Hinweis: Wenn Sterilität nicht erforderlich ist, verwenden Sie ein fusselfreies Tuch (z.B.windex) Docht Fluid von Unterseite des Netzes vor spiegeln.
      3. Spülen Sie das Netz mit M9 in der neuen 50 mL Tube aus der neuen Oberseite (Abb. 2F). Wieder in das Netz-Zentrum Betrieb und Wartung ein Tröpfchen auf der Unterseite des Netzes.
      4. Ermöglichen die Würmer zu begleichen oder sanft nach unten zu drehen (z.B.< 16 X g) für ca. 1 min (Abbildung 2).
      5. Aspirieren die Pufferlösung aus dem Pellet von Würmern, im Idealfall bis zu > 0,5 mL, oder entfernen Sie soviel Flüssigkeit wie möglich ohne zu stören das Pellet.
      6. Die Würmer mit einem Glas Pasteurpipette auf einem Teller NGM Pipette und trocknen lassen. Raum mehrere Tröpfchen heraus auf eine neue Platte, damit sie schneller (Abb. 2 H Trocknen).
   4. Reinigen Sie Sieb.
      1. Das Sieb sanft und gründlich mit Ethanol und Umkehrosmose-Wasser abspülen. Lassen Sie ihn trocknen.
      2. In einen sauberen Behälter für unbestimmte zukünftige Verwendung speichern.
      3. Entsorgen Sie es, wenn das Netz ein "Sag" Erscheinungsbild entwickelt.

2. Validierung der Caenorhabditis Sieb Sortiermethode

1. Allgemeine Wartung
   1. Für alle Experimente Kultur worms auf eine standard Nematoden Wachstumsmedien¹⁷ (1 L der NGM besteht aus 2,5 g Pepton, 17 g Agar, 3 g NaCl, 975 mL bidestilliertem Wasser, 1 mL 5 mg/mL Cholesterin, 1 mL 1 M CaCl₂ 1 mL 1 M MgSO₄, 25 mL 1 M KHPO₄und 0,5 mL von 100 mg/mL Streptomycin) bei 25 ° C.
2. Experimentelle Behandlung Verwaltung
   1. Vergleichen Sie die drei Behandlungsgruppen: Pick, Fluorodeoxyuridine (FUDR) und Caenorhabditis Sieb.
      1. Für die Behandlungsgruppe FUDR die NGM-Medien, um eine Endkonzentration von 100 μM, Nachkommen-Produktion zu verhindern 100 mg/mL FUDR hinzu, und übertragen Sie die Würmer täglich auf einen frischen NGM Teller Essen Erschöpfung zu vermeiden.
      2. Markieren Sie für die Pick Gruppe und übernehmen Sie die Würmer manuell mit einer Platin-Schleife.
      3. Folgen Sie für die Behandlungsgruppe Caenorhabditis Sieb Schritt 1.2 und pipette die Würmer auf eine NGM-Teller.
3. Caenorhabditis Sieb prozentuale Ausbeute
   1. Um zu quantifizieren, wie effektiv das Sieb ist zur Sortierung von C. Elegans, Alter-synchrone N2 Tiere an Tag 1 des Erwachsenenalters bei 25 ° C (d. h.48 h nach der Eiablage) wachsen und übertragen sie dann durch Abnehmen ihnen frische NGM-Platten (in Höhe von insgesamt N = 50 oder N = 100 Tiere pro Tre Atment Gruppe).
   2. Nach 24 Stunden der Erholung, transfer die Bevölkerung zum neuen NGM Platten mit Caenorhabditis Sieb nach oben-Protokoll (siehe Schritt 1.2) und die Anzahl der erfolgreich übertragenen Tiere.
   3. Berechnen Sie die prozentuale Ausbeute als das Verhältnis der Anzahl der Tiere im Vergleich zu der Startnummer zu Beginn der Übertragung multipliziert mit 100 (%) übertragen.
4. Healthspan assays
   Hinweis: Gäste Healthspan Parameter der Motilität Klasse, der pharyngealen Pumprate und sowohl die vorderen und hinteren sanften Touch-Reaktion an Tagen 2, 4, 6 und 8 des Erwachsenenalters für Alter synchronisiert N2 Tiere gepflegt bei 25 ° C.
   1. Motilität tracking
      1. Motilität Partituren basiert auf einem Klasse-basierte System (Klassen A, B und C) weisen nach den Methoden von Herndon Et Al. ¹⁸. vergleichen Sie die Auswirkungen der drei experimentellen Gruppen anhand eines ordinale logistische Statistiken im statistischen Analyse-Software.
         Hinweis: Klasse A Personen bewegen sich spontan in einem normalen, sinusförmige Muster. Klasse B Personen bewegen sich in deutlich nicht-sinusförmige Bewegungen und möglicherweise drängen um Bewegung zu fördern. Klasse C Individuen bewegen Sie ihren Kopf und/oder Schweif als Reaktion auf Drängen aber nicht über den Agar bewegen.
   2. Pharyngealen Pumprate
      1. Zählen Sie die Mühle Bewegung des Tieres terminal pharyngealen Glühbirne visuell unter einem Stereomikroskop bei einem 600 X letzte Vergrößerung für 1 min.
      2. Eine statistische Analyse mit einem One-Way ANOVA mit α = 0,05 und Bonferroni Post-Tests mit α = 0,05.
   3. Touch-Reaktion
      1. Erfassen Sie eine sanfte Berührung Reaktion und vergleichen Sie zwischen den drei Behandlungsgruppen. Führen Sie die Tests basierend auf den Methoden von Calixto Et Al. beschrieben ¹⁹.
      2. Aufzeichnung der vorderen und hinteren touch-Reaktion durch sanft streichelte eine Wimper Pick senkrecht über der Rute oder der Kopf (5 X, abwechselnd Kopf und Schweif) der Tiere.
      3. Erhalten Sie jede Bewegung in die entgegengesetzte Richtung des Pinselstrichs als 1 Punkt auf einer Skala von 0 bis 5 für die vordere und die hintere Antwort.
      4. Statistische Analyse mit einem One-Way ANOVA mit α = 0,05 und Bonferroni Post-Tests mit α = 0,05.
5. Fruchtbarkeit-assay
   1. Um die Verwendung von Caenorhabditis Sieb Auswirkungen auf die Fortpflanzung zu ermitteln, wachsen Sie Alter-synchrone N2 Tiere an Tag 2 des Erwachsenenalters bei 25 ° C.
   2. 60 h nach Ei zu legen, Tiere auf neue NGM-Platten mit Platin holen oder Caenorhabditis Sieb übertragen und Ihnen 4 h zu erholen (trocken gesiebten Platten für 20-30 min).
   3. Geben Sie nach seiner Genesung individuell Teller holen die Tiere über eine Wimper NGM Platten ihnen 24 h um Eier zu legen, und entfernen Sie die Tiere. Lassen Sie die Nachkommen auf jeder Platte, unter normalen Bedingungen bei 25 ° C für ein weiteres 24 h zu entwickeln.
      Hinweis: Eine Wimper-Pick ist eine menschliche Wimpern sicherte sich am Ende einer Pasteurpipette mit Nagellack und sterilisiert mit Ethanol.
   4. Die Anzahl der lebensfähigen F1 Generation Individuen. Eine statistische Analyse mit einem T-Test mit α = 0,05.
      Hinweis: Lebensfähige Nachkommen gelten als Eier, die erfolgreich auszubrüten und beginnen ihre Entwicklung durch die regelmäßigen Larven Zyklen.
6. Fluoreszierende Reporter Stress-Reaktion-assays
   1. Führen Sie drei häufigsten verwendeten fluoreszierenden Reporter Assays um potentielle Marker von Stress zu erkennen: ein DAF-16::GFP Translokation in den Kernen der Zellen in einem Stamm [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; Rol-6)]²⁰; Hsp-16,2 Ausdruck [TJ375-gpIs1 (Hsp-16.2p::GFP)]²¹; und ein Sod-3 Ausdruck [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]²².
   2. Kultur für jeden Test, Alter-synchrone Tiere aus den drei Behandlungsgruppen bei 20 ° C und am Tag 3 des Erwachsenseins zu untersuchen: Verwenden Sie eine Negativkontrolle (auf einer täglichen Basis übertragen eine Gruppe von Tieren manuell mit einem Platin Pick), eine Positivkontrolle (auf einer täglichen Basis eine Gruppe von Tieren manuell mit einem Platin Pick plus eine etablierte Stressor übertragen), und das Sieb Caenorhabditis (die Tiere durch das Sieb passieren und es ihnen ermöglichen, für 30 min auf NGM kurz vor Bildgebung zu erholen).
   3. In der DAF-16::GFP-Assay Hitze Schock die Positivkontrolle Tiere bei 37 ° C für 30 min vor der imaging-²⁰. Für die Hsp-16,2-Assay Hitze Schock die Positivkontrolle Tiere für 90 min, 20 h vor dem imaging-²¹. Für die Sod-3 Test behandeln Sie die Positivkontrolle Tiere mit 100 mM Paraquat für 4 h vor imaging²².
   4. Ernte die Würmer sofort mit einer Wimper Pick aus und Klebe sie auf einem deckgläschen mit 1 μl einer 36 % Poloxamer 407 Tensid-Lösung, die Würmer zu immobilisieren.
   5. Die montierten Würmer mit einem anderen Deckglas Sandwich. Montieren Sie zwei Deckgläsern zu einem Standardglas Mikroskopie Folie und Bild der Würmer mit einer 8 X Vergrößerung auf einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop (für eine allgemeine Vergrößerung von 80 X) und eine ständige Exposition mit einem FITC-Filter.
   6. Um Unterschiede zwischen den drei Gruppen in der DAF-16::GFP-Assay zu erkennen, zu kategorisieren die Tiere anhand der Position der DAF-16::GFP-Reporter (Kern-, wenn die Reporter, Kerne, cytosolischen umgesiedelt, befindet sich die Reporter in Cytosol und Mittelstufe, wenn der Reporter befindet sich in Kernen und Zytosol).
   7. Vergleichen Sie die Ergebnisse unter Verwendung eines ordinalen Logistik statistischen Modells in statistische Analyse-Software. Für die Hsp-16.2 und die Sod-3 Ausdruck Assays, verwenden Sie eine einfache ANOVA mit α = 0,05 und Tukey post Hoc Tests mit α = 0,05 um die totale Fluoreszenz des Kopfes zu vergleichen.

Ergebnisse

Die Caenorhabditis Sieb besteht aus 2 Schraubverschlüsse, Sicherung einer Fläche von gewebtem Nylon Monofilament Netz kleiner als der Körperdurchmesser von der gewünschten Entwicklungsalter, zum Extrahieren von live Populationen von Organismen mit einer einfachen waschen-Technik verwendet. Es legt auf standard konischen Rohren und nutzt das Sieb mechanisch Tiere Sortieren nach Körperdurchmesser, verlassen die gewünschten Tiere in der Röhre fertig für die weitere Wartung u...

Diskussion

Hier haben wir die Gestaltung und Nutzung der zugänglichen, effektive Caenorhabditis Sieb als Werkzeug für die Sortierung und Pflege C. Elegans. Dieses Tool hat mehrere Vorteile, manuell auswählen einzelner Tiere, Wasch-Populationen, chemische Behandlungen (z.B.FUDR) und teurer Methoden der Trennung Tiere. Erstens die Caenorhabditis Sieb schnell und effizient (weniger als 20 min) sortiert Nachkommen aus großen gemischten Populationen von Tieren (Tabelle 2). Auch di...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Safety glasses	Uline	S-21076
Protective heat resistant glove	Grainger	Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube	Falcon	14-432-22
Synthetic Nylon mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd	NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue	Scotch Super Glue Liquid	SAD114
Pliers	Vampliers	VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file	Lowe's	Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR	Sigma	F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)	Sigma	S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)	BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)	BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Paraquat dichloride hydrate	Sigma	36541
Inverted fluorescence microscope	Olympus	FSX100