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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu isolieren und zu charakterisieren, Struktur, olfaktorische Potenz und Verhaltensreaktion des vermeintlichen Pheromon Verbindungen der Meer Neunaugen.

Zusammenfassung

Bioassay-geführte Fraktionierung ist eine iterative Vorgehensweise, die die Ergebnisse der physiologischen und verhaltensbezogenen Bioassays verwendet, um die Isolierung und Identifizierung von einer aktiven Pheromon-Verbindung führen. Diese Methode führte in der erfolgreichen Charakterisierung der chemischen Signale dieser Funktion als Pheromone in einer Vielzahl von Tierarten. Meer Neunaugen setzen auf Geruchssinn, Pheromone zu erkennen, die Verhaltens- oder physiologische Reaktionen zu vermitteln. Wir nutzen dieses Wissen der Biologie der Fische, um Funktionen des vermeintlichen Pheromone zu postulieren und die Isolierung und Identifizierung von aktiven Pheromon-Komponenten führen. Chromatographie wird verwendet, um zu extrahieren, zu konzentrieren und Verbindungen aus dem konditionierten Wasser zu trennen. Elektro-Olfactogram (EOG) Aufnahmen werden durchgeführt, um festzustellen, welche Fraktionen olfaktorische Reaktionen hervorrufen. Zwei-Wahl Labyrinth Verhaltens Assays werden dann verwendet, um festzustellen, ob die duftenden Fraktionen auch verhaltensorientierte aktiv sind und eine Präferenz induzieren. Spektrometrische und spektroskopische Methoden bieten das Molekulargewicht und strukturelle Informationen gerne bei der Strukturaufklärung. Die Bioaktivität der reinen Verbindungen wird mit EOG und Verhaltensstörungen Assays bestätigt. Die Verhaltensreaktionen beobachtet im Labyrinth müssen letztlich in eine Feld-Einstellung, um ihre Funktion in einem natürlichen Bach Einstellung bestätigen überprüft werden. Diese Bioassays eine doppelte Rolle um 1) führen die Fraktionierung Prozess und (2) bestätigen und weiter zu definieren, die Bioaktivität der isolierte Komponenten. Hier berichten wir über die repräsentativen Ergebnisse einer Meerneunauge Pheromon-Identifikation, die exemplarisch für das Dienstprogramm des Bioassay-geführte Fraktionierung Ansatzes. Die Identifizierung von Meerneunauge Pheromone ist besonders wichtig, weil eine Modulation der Pheromon-Kommunikations-System unter den Optionen als invasive Meerneunauge im Laurentian Great Lakes zu kontrollieren ist. Diese Methode kann leicht angepasst werden der chemische Kommunikation in einer breiten Palette von Taxa zu charakterisieren und werfen Licht auf Wasserbasis Chemische Ökologie.

Einleitung

Pheromone sind spezielle chemische Signale, die von Personen, die ihnen Hilfe bei der Ortung Nahrungsquellen, Erkennung von Raubtieren und Vermittlung von sozialen Interaktionen der Artgenossen1veröffentlicht. Pheromon-Kommunikation bei Insekten wurde gut untersuchte2; die chemische Identifizierung und biologische Funktion der aquatischen Wirbeltieren Pheromone haben jedoch nicht so umfassend untersucht worden. Die Identität und Funktion der Pheromone freigegeben können angewendet werden, um die Wiederherstellung der bedrohten Arten3,4 oder Kontrolle Schädling Arten5,6zu erleichtern. Die Anwendung dieser Techniken erfordern die Isolierung und Charakterisierung von bioaktiven Pheromon-Komponenten.

Pheromon-Identifikation ist ein Zweig der Naturstoffchemie. Fortschritte in der Pheromon-Forschung wurde aufgrund der Beschaffenheit der Pheromon-Moleküle sich teilweise begrenzt. Pheromone sind oft instabil und in kleinen Mengen freigegeben, und nur ein paar Sampling-Techniken existieren, um winzige Mengen von flüchtigen7,8 oder wasserlöslichen Verbindungen9zu erkennen. Ansätze, Pheromone zu identifizieren sind (1) eine gezielte Überprüfung der bekannten Verbindungen, Metabolomik (2) und (3) Bioassay-geführte Fraktionierung. Eine gezielte Überprüfung der bekannten Verbindungen testet im Handel erhältlichen metabolische Nebenprodukte der physiologischen Prozesse, die die Hypothese als Pheromone funktionieren. Dieser Ansatz begrenzt, weil Forscher nur bekannte und verfügbare Verbindungen testen können. Allerdings hat es die erfolgreiche Identifikation von Sexualhormonen in Goldfisch diese Funktion als Pheromone10,11,12geführt. Metabolomik ist ein zweiter Pheromon-Identifikation-Ansatz, der potenzielle niedermolekulare Stoffwechselprodukte innerhalb eines biologischen Systems13unterscheidet. Ein Vergleich der Stoffwechselprofile von zwei Gruppen (d. h., eine aktive im Vergleich zu inaktiven Auszug) ermöglicht die Identifizierung eines möglichen metabolischen Profils aus, der Metabolit gereinigt wird, ist die Struktur aufgeklärt, und die Bioaktivität ist bestätigten14. Additive oder synergistische Wirkungen der komplexen Formulierungen bestimmte Mischungen sind eher mit Metabolomics erkannt werden, weil Metaboliten zusammen anstatt als eine Reihe von Fraktionen13gelten. Doch hängt die Umsetzung der Metabolomik die Verfügbarkeit von synthetischen Referenzen weil die resultierenden Daten nicht die Aufklärung der neuartige Strukturen erleichtern.

Bioassay-geführte Fraktionierung ist ein integrierte, iterativen Ansatz, die zwei Felder umfasst: Chemie und Biologie. Dieser Ansatz nutzt die Ergebnisse der physiologischen und verhaltensbezogenen Bioassays, die Isolierung und Identifizierung von einer aktiven Pheromon-Verbindung führen. Ein grober Extrakt ist fraktioniert durch eine chemische Eigenschaft (d.h., Molekülgröße, Polarität, etc.) und getestet mit Elektro-Olfactogram (EOG) Aufnahmen und/oder in einem Bioassay. Die bioaktiven Komponenten werden heraus durch Wiederholen Sie diese Schritte der Fraktionierung und EOGs bzw. Bioassays gezeigt. Die Strukturen der reinen Wirkstoffe sind durch spektrometrische und spektroskopische Methoden aufgeklärt, die das Molekulargewicht und Strukturinformationen herstellen eine Vorlage der Verbindung synthetisiert werden. Bioassay-geführte Fraktionierung kann nachgeben, diverse Metaboliten und potenziell neuartige Pheromone mit einzigartigen chemischen Skelette, die wahrscheinlich nicht von den biosynthetischen Bahnen vorhergesagt werden.

Hier beschreiben wir die Bioassay-geführte Fraktionierung Protokoll zu isolieren und zu charakterisieren die Bioaktivität der männlichen Meerneunauge Sex Pheromon Verbindungen verwendet. Meerneunauge (Petromyzon Marinus) ist ein ideales vertebrate Modell Pheromon Kommunikation zu studieren, weil diese Fische verlassen sich stark auf die olfaktorische Detektion von chemischen Signale zu vermitteln ihre anadrome Lebensgeschichte, bestehend aus drei Phasen: Larven, Jugendliche und Erwachsene. Meerneunauge Larven bohren sich in das Sediment von Süßwasser-Streams, eine drastische Metamorphose zu unterziehen, und Jugendliche, die an einem See oder Meer, wo sie große Host Fische parasitieren, migrieren verwandeln. Nach dem ablösen von der Host-Fisch, migrieren die Erwachsenen wieder Laich Bäche, geleitet von den wandernden Pheromone freigegeben durch Stream-Resident Larven15,16,17,18,19 . Reife Männer zu den Laichgründen aufsteigen, lassen Sie ein Mehrkomponenten Sex Pheromone um Freunde zu gewinnen, zeitweise Laichen für etwa eine Woche und dann sterben15,20. Die Identifizierung von Meerneunauge Pheromone ist wichtig, weil eine Modulation der Pheromon-Kommunikations-System unter den Optionen als die invasiven Meer Neunaugen in der Laurentian Great Lakes21zu kontrollieren ist.

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Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 und 02/17-031-00) genehmigt.

1. Erfassung und Gewinnung von Meerneunauge bedingt Wasser

  1. Ort geschlechtsreif männliche Meer Neunaugen (15-30 Tiere) in einem Tank geliefert mit 250 L kohlensäurehaltiges Lake Huron Wasser gepflegt bei 16-18 ° C.
  2. Sammeln Sie die männlich konditioniertes Wasser in jeder Nacht von Juni bis Juli.
    Hinweis: Meer Neunaugen sterben natürlich nach dem laichen. Wenn ein Fisch steht kurz vor diesem Punkt in seinem Leben, mit einem frischen Reifen männlichen ersetzen.
  3. Extrahieren Sie die konditionierte Wasser durch Festphasenextraktion.
    1. Einweichen Sie das Harz in Methanol für 4 h, bevor Sie in eine Spalte laden. Laden Sie das Harz in die Spalte, dann Pumpe 10 Liter Wasser durch die Säule um das organische Lösungsmittel zu entfernen.
    2. Übergeben Sie das klimatisierte Wasser aus dem Tank halten die Fische über das Pumpsystem, das oben in der Spalte. Das Wasser fließt durch ein Bett von 2 kg mäßig polaren Polymeren Ionenaustausch-Harz (z. B.., HP Amberlite XAD-7-Harz), enthalten in einer Reihe von vier 2,5-Liter-Glas-Spalten. Pflegen Sie Last Geschwindigkeiten zwischen 400 und 600 mL/6 min. eluieren Metaboliten mit 10 L Methanol, unmittelbar gefolgt von 5 L Aceton.
      Achtung: Dieser Schritt verwendet Methanol und Aceton. Beide sind brennbar und giftig.
      Hinweis: Die gepoolten Restwert bei-80 ° C bis weiterverarbeitet speicherbar.
  4. Reaktivieren Sie die Spalte nach 1 Woche der Bereicherung durch Waschen mit Wasser (ca. 10 L).
  5. Entfernen Sie das organische Lösungsmittel (die Mischung von Methanol und Wasser) und Ernten des Extrakts durch rotatorische Verdampfung für 5 h unter vermindertem Druck (unter 300 Mbar) bei 40 ° C. Konzentrieren sich die Wasserrückstände durch Einfrieren Trockner Lyophilisierung für 48 h bei-20 ° C bis trocken.

2. Isolierung der Bruchteil Pools mit Chromatographie

  1. Die Silica-Gel (230-400 Mesh) in der ersten mobilen Phase für 30 min. Transfer des Gels mit dem Lösungsmittel (Suspension) in eine Glassäule einweichen. Öffnen Sie das Ventil der Spalte, die die mobile Phase durchlaufen lassen. Lassen Sie das Silica Gel auszufällen und bilden eine Silica-Gel-Bett.
  2. Die Extrakte mit Silica-Gel (70-230 Mesh) mischen und über das Silica-Gel-Bett in der Flüssigchromatographie-Spalte laden. Eluieren sie mit einem Gefälle von 95 % Kchl3 (Chloroform) / MeOH (Methanol) zu 100 % MeOH, 2,5 L Gesamtvolumen. Der Eluent in einzelnen Fläschchen (je 10 ml) zu sammeln.
    Achtung: Das Chloroform verwendet in diesem Schritt ist eine giftige Reagenz.
  3. Die Bündelung von den Eluenten in 20 Fraktionen durch eine Dünnschicht-Chromatographie (TLC)-Analyse zu führen.
    1. Durchführen Sie der TLC-Experiment auf vorbeschichtete Silica-Gel-Platten, indem die Probe auf die Startlinie und Eintauchen der Startlinie der Platte in den Entwicklungsländern Lösungsmittel (Wählen Sie die Polarität durch das Verhältnis der Kchl3 in Methanol 100-0 %) in einem verschlossenen Glas Tank.
    2. Wählen Sie das Verhältnis von Lösungsmittel alle TLC Flecken mit einem Zurückbehaltungsrecht Faktor (Rf) von 0,3 bis hin zu entwickeln - 0,8.
    3. Nachdem das entwickelnde Lösungsmittel Endzeile erreicht hat, nehmen Sie die Platte aus dem Tank und warten Sie 10 Minuten für das Lösungsmittel verdunstet.
    4. Visualisieren Sie die Flecken zuerst unter UV-Licht bei 254 nm und dann Fleck Sie durch Besprühen mit einer sauren Methanol-Lösung von 5 % Anisaldehyde (20 μl) durch eine Chromatographie-Spritze und Heizung sie bei 85 ° C für 3 Minuten.
      Hinweis: Die bunten Flecken auf die TLC Platte zeigen die wichtigste Komponente in der Fraktion.
    5. Kombinieren Sie das Laufmittel 20 Fraktionen basierend auf die Volltonfarbe und die R-f -Ähnlichkeit der Hauptbestandteil.
  4. Konzentrieren Sie den Anteil an einen Rückstand durch rotatorische Verdampfung unter vermindertem Druck (300 Mbar nach die Eigenschaft von Lösungsmitteln) bei 40 ° C für ca. 30 min.

(3) Elektro-Olfactogram (EOG) Aufnahmen, duftende Brüche/Verbindungen zu identifizieren

  1. Borosilikatglas Kapillaren ziehen (Außendurchmesser: 1,5 mm; Innendurchmesser: 0,86 mm; Länge: 100 mm) mit einer Mikropipette Abzieher mit der Heizung auf 65 festgelegt.
  2. Punkten Sie und schneiden Sie die Öffnung an der Spitze der Kapillare mit einem diamantbestückte Glasschneider und füllen Sie ihn mit geschmolzenen 0,4 % Agar in 0,9 % Kochsalzlösung. Die Öffnung an der Spitze der Kapillare sollte etwa 10 µm im Durchmesser sein.
  3. Füllung der gezogenen Kapillaren Elektroden aus Schritte 3.1-3.2 und Solid-State-Elektroden-Halter mit Ag/AgCl-Pellets vorgefertigt (siehe Tabelle der Materialien) mit 3 M KCl mit einer Mikropipette.
    Hinweis: Luftblasen in der Kapillare oder der Elektrodenhalter zu verdrängen.
  4. Legen Sie die gezogenen Elektroden in den Elektrodenhalter.
  5. Bereiten Sie 100 mL 10-5 M L-Arginin in Holzkohle-gefiltertem Wasser aus einer 10-2 M L-Arginin Vorratslösung in entionisiertem Wasser (bei 4 ° C gelagert) in einem volumetrischen Kolben. Transfer von 20 mL 10-5 M L-Arginin zu einem Glasfläschchen.
  6. Bereiten Sie die Konzentration-Wirkungs-Kurve 10 mL 10-divisibel Verdünnungen der Bruchteil Pools aus Schritt 2.3 in Glasfläschchen. Bereiten Sie frische Verdünnungen täglich vor den Experimenten und innerhalb eines Tages zu verwenden. Setzen Sie die Glasfläschchen von gebrauchslösungen von L-Arginin und der Bruchteil Pool Verdünnungen in einem umlaufenden Wasserbad damit die Temperatur bis auf 8 ° c equilibrate
  7. Das Neunauge mit 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222; 100 mg/L) zu betäuben und mit einer sterilen Spritze mit einer intramuskulären Injektion von Gallamine Triethiodide (3 mg/kg Körpergewicht, in 0,9 % Kochsalzlösung) zu immobilisieren.
    Hinweis: Eine ausreichende Tiefe der Narkose wird bestimmt, durch die Beobachtung keine Gill-Bewegung, die Unfähigkeit, eine aufrechte Körperhaltung und keine Saugleistung an den Seiten des Tanks mit ihrer mündlichen Scheibe. Um eine mikrobielle Kontamination vor und während der Operation zu minimieren, sterile Handschuhe tragen und die Dissektion Werkzeuge in 70 % igem Ethanol (V: V) in entionisiertem Wasser für mindestens 10 Minuten vor der Verwendung einweichen.
  8. Richten Sie den narkotisierten Neunaugen in einem v-förmigen Stand und wickeln Sie es mit einem feuchten Papiertuch um Austrocknung zu verhindern.
    Hinweis: Behindern Sie die Kieme Öffnungen nicht.
  9. Legen Sie eine Tube belüftete Umlaufwasser, enthält 50 mg/L MS222 in der Mundhöhle, passen Sie die Durchflussmenge und sorgen dafür, dass Wasser über die Kieme Öffnungen um die Kiemen ständig bewässern beendet wird.
  10. Verwenden Sie ein steriles Skalpell und Pinzette [unter dem stereoskopische Mikroskop bei 1,25 X Vergrößerung (siehe Tabelle der Materialien)], 5 mm2 Teil der Haut auf der Oberfläche der olfaktorischen Kapsel um das olfaktorische Epithel aussetzen zu entfernen.
  11. Spülen Sie den Duftstoff Lieferung Schlauch mit gefiltertem Wasser und schließen Sie es an das Ventil montiert auf einem Mikromanipulator. Legen Sie das Duftstoff Lieferung Kapillarrohr in den olfaktorischen Epithel Hohlraum mit dem Mikromanipulator, um gefiltertes Wasser an den olfaktorischen Epithel um Austrocknung zu verhindern, bei der Verabreichung von Geruchsstoffen nicht zu liefern.
  12. Montieren Sie die Aufnahme und Referenz Elektroden auf die Mikromanipulatoren. Senken Sie die Bezugselektrode auf die äußere Haut in der Nähe der Naris. Das Mikroskop stereoskopische (1,25 X), niedriger der Aufnahme-Elektrode auf das riechepithel kaum berühren.
  13. Übertragen Sie die Aufnahme der Geruchsstoff Lieferung Röhre aus dem Hintergrund gefilterte Wasser auf 10-5 M-L-Arginin-Lösung.
  14. Schalten Sie den Computer, Verstärker (eingestellt auf DC-Modus), Filter und Digitizer. Mit Hilfe der Ventil-Treiber-Software Programmieren das Verfahren, einen 4 s Einzelimpuls der Geruchsstoff zu verwalten, durch Anklicken des Kästchens T1, T bis 4 einstellen s, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen des T2.
  15. In der Datenerfassungs-Software (siehe Tabelle der Materialien), den Erwerb Modus auf eine High-Speed-Oszilloskop festzulegen, klicken Sie auf das Play-Symbol und klicken Sie dann auf Start in der Ventil-Treiber den Geruchsstoff Impuls auslösen.
    Hinweis: Der Datenerfassungs-Software zeichnet automatisch die differenzielle EOG Antwort Amplitude für 20 s (3 s, 4 s während der Geruchsstoff Puls und 13 s danach). Benutzen Sie der Mikromanipulator, um die Positionen der Aufnahme Elektrode, Bezugselektrode oder Duftstoff verabreichungsschlauch erhöhen das Signal-Rausch-Verhältnis mit einer maximale Reaktion auf L-Arginin-Standard und eine minimale Reaktion auf die Blindkontrolle (manövrieren gefiltertes Wasser). Boden des Verstärkers durch die Umstellung des AC-DC-Verstärker-Schalters auf GND beim Verschieben der Elektroden.
  16. Die Aufnahme der Blindkontrolle, L-Arginin und dann die Geruchsstoffe in Schritt 3,6 von niedrigen zu hohen Konzentrationen mit einem Flush 2 min mit gefiltertem Wasser zwischen Anwendungen vorbereitet.
  17. Boden Sie nach der Aufnahme Antworten auf alle Geruchsstoffe getestet werden des Verstärkers und einfahren Sie vorsichtig der Elektroden und Geruchsstoff Lieferung Kapillarrohr. Nach den genehmigten institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) Methoden, bei Beendigung des Experiments EOG narkotisierten Neunauge mit einer Überdosis MS222 einschläfern (1 g/L).
    Hinweis: Prüfen Sie erfolgreiche Euthanasie mit der Feststellung mangelnder Gill Bewegung und Takt für mindestens 5 min, gefolgt von bolzenschussmethode im Gehirn.
  18. Analysieren und darstellen der Daten-Analyse-Software mit. Bestimmen Sie die Schwelle des Nachweises der Geruchsstoffe22 duftende Brüche zu identifizieren, die größer als die leere wassersteuerung Reaktionen hervorrufen. Die Bruch-Pools, die Konzentration abhängig olfaktorische Reaktionen hervorrufen, die anders sind als das Steuerelement leer Wasser werden dann in eine Verhaltens-Assay (Schritt 4) getestet.

4. zwei-Wahl Labyrinth Verhaltens Bioassay, verhaltensorientierte Brüche/Wirkstoffe zu identifizieren

  1. Die geschlechtsreifen weiblichen Meerneunauge im Release Käfig in das Labyrinth zu akklimatisieren (siehe ergänzende Abbildung1) 5 min. halten die Durchflussmenge des Flusswassers im Labyrinth
    Hinweis: Das Labyrinth ist mit 2,7 m Länge, das Labyrinth in zwei Kanäle am vorgelagerten Ende trennen Raumteiler aus lackierten marine Grade Holz und 6,5 m Länge und 1,2 m in der Breite misst gebaut. Wasser wird in das Labyrinth vorübergehend umgeleitet. Die Wassertiefe sollte auf 0,19 m gehalten werden und die Geschwindigkeit bei 0,07 m/s ± 0,01 beibehalten werden sollte.
  2. Lassen Sie das Meerneunauge und kumulative aufgewendete Zeit verbringt der Neunaugen in der experimentellen und Steuerkanal jedes enthaltenden Fluss Wasser für 10 Minuten.
    Hinweis: Wenn das Meerneunauge fehlschlägt, geben die experimentelle und Steuern Kanal für mindestens 10 s während dieser Zeit 10 min am Ende des Prozesses, als Beweis der Inaktivität oder starke Seite Voreingenommenheit.
  3. Wenden Sie den Test-Stimulus (d. h., eine vermeintliche Pheromon auf 10-12 M in 50 % Methanol/entionisiertem Wasser gelöst), der nach dem Zufallsprinzip zugewiesene experimentelle Kanal und das Fahrzeug (50 % Methanol/deionisiertes Wasser) das Steuerelement Kanal mit peristaltischen Pumpen zu konstanten Preisen von 200 mL/min für 5 Minuten.
    Hinweis: Die Erkennung Grenzkonzentration des Test Stimulus wie mit den Elektro-Olfactogram-Aufnahmen bestimmt sollte als die Ausgangskonzentration für Verhaltens-Test verwendet werden.
  4. Anwenden der Test-Reiz und das Fahrzeug für eine zusätzliche 10 min und kumulative aufgewendete Zeit der Neunaugen verbringt in der experimentellen und Steuerkanal.
  5. Spülen Sie das Labyrinth mit Wasser für 10 min vor dem Start der nächsten Prüfung. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.4 mit mindestens 7 Neunaugen, wenn genügend Test Impulse zur Verfügung steht.
  6. Berechnen Sie einen Index von Präferenz22 für jeden Versuch zu und bewerten Sie die Bedeutung mit einem Wilcoxon-unterzeichnet-Rank-Test.
    Hinweis: Die Ergebnisse des Index in eine einzelne Zahl, die entweder positiv oder negativ sein kann. Ein positiver Wert für den Index des Präferenz zeigt Attraktion, während ein negativer Wert für den Index des Präferenz Indikationen Abstoßung. Wenn der Index der Präferenz signifikant verschieden von NULL ist, gilt der Anteil aktiv.
    figure-protocol-13335
    Hier,
    Bc = die Verweildauer der Test Neunaugen in der Steuerkanal vor der Duftstoff-Anwendung
    Be = die Zeit in der experimentellen Kanal vor der Duftstoff-Anwendung
    Ac = die Zeit in der Steuerkanal nach der Duftstoff-Anwendung und
    Ae = die Zeit in der experimentellen Kanal nach dem Duftstoff auftragen.

(5) chromatographische Isolation von reinen Verbindungen aus aktiven Brüche

  1. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.4 mit den Bruch-Pools, die olfaktorische Antworten (Schritt 3) induzieren und entlocken Sie Verhaltensreaktionen (Schritt 4) zu.
  2. Weiter zu reinigen Sie die aktiven Fraktionen in Verbindungen mit Größe-Ausschluss-Chromatographie mit einer Sephadex LH-20 Spalte.
    1. Vorbereitung die Probe in 0,5 mL in der Anfangsphase mobile [Kchl3- MeOH (1:1) oder MeOH 100 %], laden Sie in die entsprechende Spalte ein Kchl3- MeOH (1:1) Spalte und dann eine Spalte MeOH (100 %) und eluieren sie um die Verbindungen zu erzielen.

(6) Strukturaufklärung einer reinen Verbindung mit Massenspektrometrie (MS) und Kernspinresonanz (NMR)

  1. Auflösen und die gereinigte Verbindung in der ersten mobilen Phase (in der Regel, Methanol, Wasser, 1:1, V: V) der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) zu einer 10 μl Lösung von ca. 1 μg/mL zu verdünnen.
    1. Übertragen der Beispiellösung auf HPLC Vials und setzte sie in den Autosampler HPLC. Injizieren der Probe (10 μl) in der Elektrospray-Ionisation Massenspektrometrie (ESIMS) und notieren Sie die hochauflösende Electrospray Ionisierung Massenspektrometrie (HRESIMS) Spektren einer Chromatographie Massenspektrometer23.
  2. Vorhersagen der Summenformel laut Datenbank in der Massenspektrometer-Software (siehe Tabelle der Materialien)24.
    1. Öffnen Sie das Chromatogramm der injizierten Probe und erhalten Sie seine Massenspektrum durch Auswahl den chromatographischen Gipfel zu.
    2. Geben Sie die gemessenen Masse Ion (m/Z) Wert (4 Dezimalstellen) in elementare Zusammensetzung im Modul " Werkzeug ". Legen Sie die Toleranz-Parameter auf PPM < 5.
    3. Passen Sie die Symbol-Parameter um die Elementzusammensetzung der gemessenen Moleküls zu passen. Die Software erzeugt eine Vorhersage der Summenformel anhand der einzelnen Masse Analyse.
  3. Wählen Sie die deuterierte Lösungsmittel (600 μL, CH3OH -d4 oder DMSO -d6) gemäß dem Protokoll25 , die Muster aufzulösen.
    1. Vollständig auflösen der Probe in den ausgewählten deuterierte Lösungsmittel zu einer Lösung mit einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 mg/mL. Übertragen Sie die Beispiellösung in ein NMR-Röhrchen die 1D (1H, 13C) aufzeichnen und 2D NMR [1H -1H Korrelation Spektroskopie (GEMÜTLICHE), Heteronuclear Quantum Kohärenz (HSQC-), Heteronuclear single mehrere Bond Korrelation (HMBC)] Spektren auf einem 900 MHz NMR-Spektrometer-26.
  4. Ort der NMR-Röhrchen mit der Probe in der Spinner-Turbine. Verwenden Sie die tiefenbegrenzer um sicherzustellen, dass die Probe Höhe in der Mitte des messfensters ist. Öffnen Sie die NMR-Software (siehe Tabelle der Materialien) und heben Sie klicken um die Probe in den Magneten zu ändern.
    Hinweis: Halten Sie eine Hand über der Oberseite des Magneten, die Gas aus der Spitze des Magneten zu fühlen. Zur gleichen Zeit sollte ein pfeifendes Geräusch hörbar sein.
  5. Sanft legen Sie die Probe auf das Luftkissen auf den Magneten und drücken Sie erneut, um die Probe in der NMR-Magneten hinabsteigen auf heben .
    Hinweis: Achten Sie auf ein "Klick" Geräusch um anzugeben, dass die Probe in der richtigen Position ist.
  6. Erstellen Sie ein neues Dataset und laden Sie die Default-Parameter von der NMR-Gerät empfohlen (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Geben Sie "Sperre", die automatische Verriegelung Prozedur aufzurufen, und wählen das Lösungsmittel auf der schnellen Seite.
    2. Für die Feinabstimmung, im manipulieren Panel, passen Sie die Schaltfläche in der Unlock -Modell, stellen Sie den Cursor im Feld manipulieren und den Magneten wieder zu sperren.
    3. Stellen Sie auf der Eingabeaufforderung Atma Seite den Parameter im Bedienfeld "manipulieren" tuning-Verfahren, was einige Minuten dauern kann. Warten Sie, bis die Abstimmung abgeschlossen ist, um den Vorgang fortzusetzen.
    4. Starten Sie die automatische Shimmen Routine durch Eingabe von "Topshim" in der Eingabeaufforderung. Warten Sie, bis die Shims abgeschlossen ist, um den Vorgang fortzusetzen.
    5. Typ "Rga" Automatische festzulegende empfangen Gewinn Anpassungen, dann Typ "d1", legen Sie die Verzögerung zwischen den Pulsen, dann Typ "Zg" die Übernahme starten und warten, bis die Übernahme beendet.
    6. Geben Sie "Ef" oder "Efp" die Daten zu verarbeiten und geben Sie dann "Apk" für automatische Ausstieg. Verarbeiten Sie die Daten über die NMR-Processing-Software.
  7. Die chemische Struktur von einer Interpretation von NMR-Daten-Analyse zu erhellen.
  8. Zählen Sie die Kohlenstoff-Signale in den 13C-NMR-Spektrum. Wählen Sie die übereinstimmenden Molekulare Formel aus dem prognostizierten Ergebnis in der hochauflösenden Massenspektrometrie (HR-MS).
  9. Integrieren Sie die Proton-Signale in der 1H-NMR-Spektrum zu, und weisen Sie die Konnektivität von der Kohlenstoff - und Proton-basierte auf die Signale des HSQC-Spektrums.
  10. Weisen Sie die Konnektivität das Kohlenstoffskelett anhand der Korrelationen in der 1H -1H gemütlich und HMBC-Spektrum.
  11. Weisen Sie versuchsweise die chemische Struktur, basierend auf der Struktur Begründung27. Suchen Sie die vorläufige Struktur in der chemischen Struktur Datenbanken. Vergleichen Sie die vorläufige Struktur mit der Analoga in Referenzen.
  12. Weisen Sie die relative Konfiguration mit dem Nuclear Overhauser Effekt Spektroskopie (NOESY) Spektrum.
    Hinweis: Da die Identitätseigenschaften Enantiomeren Spektrometrie und spektroskopische Methoden angezeigt identisch sind, die absolute Konfiguration einige Verbindungen, insbesondere mit Alkohol 2' und 2'-NH2, muss mit ermittelt werden eine Derivatisierung Reaktion. Nach der Reaktion Derivatisierung erleichtern die Unterschiede auf den Spektren angegeben die eindeutige Zuordnung der absoluten Konfigurationen von den meisten Verbindungen28.

7. EOG und Bioassay reinen Verbindungen zu bestätigen sind Geruchs- und verhaltensorientierte aktiv

  1. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.5.
  2. Vorbereitung der Konzentration-Wirkungs-Kurve 10-divisibel Verdünnungen der reinen Verbindungen von 10-6 M - 10-13 M von einer 10-3 M Pheromon Vorratslösung in 50 % Methanol/Wasser gespeichert bei-20 ° C basierend auf das Molekulargewicht bestimmt 10 mL Schritt 6.2. Setzen Sie die Glasfläschchen mit der gebrauchslösungen von L-Arginin und die reinen Verbindungen in einem umlaufenden Wasserbad damit die Temperatur bis auf 8 ° c equilibrate
  3. Wiederholen Sie die Schritte 3,7-3.18.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.2.
  5. Der nach dem Zufallsprinzip zugewiesene experimentelle Kanal und das Fahrzeug (50 % Methanol/deionisiertes Wasser), der Steuerkanal mit einer peristaltischen Pumpe zu konstanten Preisen von 200 mL/min für 5 min zuweisen Sie reine Verbindung bei der EOG-Erkennung-Grenzkonzentration.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 4,4-4,6.

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Ergebnisse

Ein Diagramm einer Zusammenfassung des Protokolls der Bioassay-geführte Fraktionierung beschriebenen Schritte ist in Abbildung 1dargestellt. Das Protokoll erfolgt in Schritten zu isolieren und zu charakterisieren, die Struktur, die olfaktorische Potenz und Verhaltensstörungen Tätigkeitsbereich 5 vermeintliche Meerneunauge Pheromone (Abbildung 2). Mit der Masse spektrometrische und NMR-Daten (Abbildung 3

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Diskussion

Fische leben in einer chemischen Welt voller Verbindungen noch identifiziert werden. Bioassay-geführte Fraktionierung bewährt wesentlich zu identifizieren und zu charakterisieren, bioaktive Moleküle, die viele chemische Interaktionen, wie bei Masu-Lachs31, Asiatische Elefanten32und Meer Neunaugen33zu vermitteln, 34,35. Bioassay-geführte Fraktionierung ist ein effektives Vorgeh...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken der US geologischen Umfrage Hammond Bay biologische Station für die Nutzung ihrer Forschung Einrichtungen und das Personal der US Fish and Wildlife Service und Fischerei und Ozeane Kanada für die Bereitstellung Meer Neunaugen. Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der Great Lakes-Fischerei-Kommission Weiming Li und Ke Li unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Premium standard wall borosilicate capillaries with filament Warner InstrumentsG150F-4recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm)
Pipette puller instrumentNarishigePC-10pulls electrodes for EOGs
Diamond-tipped glass cutterGenericcut tip of electrodes for EOG
Borosilicate glass capillariesWorld Precision Instruments1B150-4odorant delivery tube for EOG
Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mmWarner InstrumentsESP-M15Nrecording electrode holder
Reference electrode holder E Series with handle with  Ag/AgCl pellet  for glass capillary OD 1.5 mmWarner InstrumentsE45P-F15NHreference electrode holder
1 mm pinWarner InstrumentsWC1-10to bridge reference and recording electrode holders
2 mm pinWarner InstrumentsWC2-5to bridge reference and recording electrode holders
AgarSigmaA1296molten agar to fill electrodes
Potassium chloride (KCl)SigmaP93333M KCl to fill electrodes and electrode holders
Micropipette microfilWorld Precision InstrumentsMF28G-5to fill electrodes and electrode holders
L-ArginineSigmaA5006positive control odorant for EOG
MethanolSigma34860
Water bathCustom madeN/Aholds odorants for EOG
3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222)Syndel USATricaine1GEOG anesthetic
Gallamine triethiodideSigmaG8134-5GEOG paralytic
1 mL syringeBD Biosciences301025to administer paralytic
Subcutaneous needle 26G 5/8BD Biosciences305115to administer paralytic
Roller clampWorld Precision Instruments14043-20adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth
Sodium chloride (NaCl)J.T. Baker3624-05for preparation of 0.9% saline
V-shaped plastic stand as specimen stageCustom madeN/Aholds lamprey during EOG
Plastic troughCustom madeN/Aholds V-shaped plastic stand during EOG
Scalpel Blades - #11Fine Science Tools10011-00for EOG dissection
Scalpel Handle - #3Fine Science Tools10003-12for EOG dissection
Straight ultra fine forcepsFine Science Tools11252-00for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps
Curved ultra fine forcepsFine Science Tools11370-42for EOG dissection, Moria MC40B
Straight pring ScissorsFine Science Tools15003-08for EOG dissection
StereomicroscopeZeissDiscovery V8for EOG dissection
Illuminator lightZeissCL 1500 ECOfor EOG dissection
Plastic tubingGenericto connect re-circulating EOG setup and water baths
Odorant delivery tubingCustom madeN/A
In line filter and gasket setLee CompanyTCFA1201035A
MicromanipulatorsNarishigeMM-3to position electrodes and odorant delivery capillary tube
Magnetic holding devicesKanetecMB-K
Valve driverArduinocustom madeto control the opening of the valve for odor stimulation
Electromagnetic valveLee CompanyLFAA1201618Hvalve for odor stimulation
NeuroLog AC/DC amplifierDigitimer Ltd.NL106to increase the amplitude of the elictrical signal
NeuroLog DC pre-amplifier with headstageDigitimer Ltd.NL102Gto increase the amplitude of the elictrical signal
Low-pass 60 Hz filterDigitimer Ltd.NL125
DigitizerMolecular Devices LLCAxon Digidata 1440A
Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion softwareMolecular Devices LLCAxoScope version 10.4
Faraday cageCustom madeN/AElectromagnetic noise shielding
Two-choice mazeCustom madeN/Awaterproofed marine grade plywood covered with plastic liner
Trash pumpHondaWT30XK4Afills maze with water from nearby river
Peristaltic pump with tubingCole ParmerMasterflex 07557-00to adminster odorants in maze
Inverter GeneratorHondaEU1000ipowers perstaltic pump
Release cageCustom madeN/Aused to acclimate lamprey in the maze
MeshGenericused to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers
Buckets (5 gallon)Genericto mix odorants
Flow meterMarsh-McBirneyFlo-Mate 2000to measure discharge
XAD 7 HP resinDow chemical37380-43-1for extraction of conditioned water 
MethanolSigma34860for extraction of conditioned water 
Water bathYamatoBM 200for extraction of conditioned water 
Freeze dryerLabconcoCentriVap Concentratorfor extraction of conditioned water
chloroformSigmaCX1050for isolation of fraction pools
Silica gel 70-230 meshSigma112926-00-8for isolation of fraction pools
Silica gel 230-400 meshSigma112926-00-8for isolation of fraction pools
Pre-coated silica gel TLC platesSigma99571for isolation of fraction pools
anisaldehydeSigmaA88107for isolation of fraction pools
Sephadex LH-20GE Healthcare17-0090-01for isolation of fraction pools
Amberlite XAD 7 HP resinSigmaXAD7HPfor extraction of conditioned water 
4, 2.5L capacity glass columnsAce Glass Inc.5820for extraction of conditioned water 
AcetoneSigma650501for extraction of conditioned water 
TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent)Waters Co.N/Afor structure elucidation
Binary HPLC pumpWaters Co.1525for isolation of fraction pools/compounds
Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent)AgilentN/Afor structure elucidation
Rotovap drying systemBuchiRIIfor extraction of conditioned water 
UV lamp (254 nm)Spectronics Co.ENF-240Cfor thin layer chromatography 

Referenzen

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