In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

Zusammenfassung

Wir beschreiben Methoden zum isolieren eckzahn Neutrophils aus Vollblut und NET Bildung in live Neutrophilen mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu visualisieren. Protokolle, NET Bildung und citrullinierte Histon H3 zu quantifizieren sind auch beschrieben (citH3) Ausdruck mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie.

Zusammenfassung

Als Reaktion auf eindringende Krankheitserreger loslassen Neutrophilen Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen (Netze), die extrazelluläre Netzwerke von DNA mit Histonen und antimikrobielle Proteine verziert sind. Übermäßige Netto Bildung (NETosis) und citH3 Release bei Sepsis ist mit mehreren organdysfunktion und Mortalität bei Mäusen und Menschen, aber ihre Auswirkungen bei Hunden sind unbekannt. Hier beschreiben wir eine Technik, um Hunde Neutrophilen aus Vollblut zur Feststellung und Quantifizierung der NETosis zu isolieren. Leukozyten-reiche Plasma, erzeugt durch Dextran Sedimentation wird durch handelsübliche Dichte Gradienten Trennung Medien getrennt und Granulozyten gesammelt für Zell-Graf und Durchführbarkeit zu testen. Um Echtzeit-NETosis in live Neutrophilen beobachten, werden Zelle permeationsfähigen und Zelle impermeant fluoreszierenden Nukleinsäure Flecken Neutrophilen aktiviert durch Lipopolysaccharid (LPS) oder Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) hinzugefügt. Veränderungen in der nuklearen Morphologie und NET Bildung sind im Laufe der Zeit durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. In-vitro- NETosis zeichnet sich weiter durch co-ns1 zellfreie DNA (Blut), Myeloperoxidase (MPO) und citrullinierte Histon H3 (citH3) mit einem modifizierten Doppel-Immunolabelling-Protokoll. Um Objektiv zu quantifizieren, NET Bildung und citH3 Ausdruck mit Fluoreszenz-Mikroskopie, Netze und citH3-positiven Zellen in einer verblindeten Weise mit verfügbaren Software quantifiziert. Diese Technik ist eine spezifischen Assay, der in-vitro- Kapazität der eckzahn Neutrophilen NETosis unterziehen zu bewerten.

Einleitung

Neutrophile sind kurzlebige Granulozyten verantwortlich für die anfängliche Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger. Neutrophile, an den Ort der Infektion, rekrutiert beseitigen Mikroorganismen durch Phagozytose, Degranulation und Generierung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-¹. In Anwesenheit von Bakterien oder Endotoxine verziert neutrophile Release Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen (Netze), bestehend aus extrazellulären Chromatin mit Histonen und granulare Proteine wie Elastase und Myeloperoxidase (MPO)². Zwar Netze unverzichtbar antimikrobielle Eigenschaften, Erhöhung der experimentellen und klinischen Beweis schlägt vor, dass übereifrige NET Bildung bei Sepsis zu mehreren Organ Dysfunktion und Tod^3,4, führen kann ^{5 , 6}.

Da Netze eine ähnliche pathophysiologische Rolle bei Hunden spielen dürfen, können therapeutische Interventionen, die entweder verhindern oder verringern Netto Bildung als neue Behandlungsstrategien bei septischen Tieren dienen. Aus diesem Grund gibt es eine Notwendigkeit für eine zuverlässige Technik zu bewerten und zu quantifizieren, NETosis und NET-Komponenten bei Hunden. NET-Komponenten einschließlich zellfreie DNA (Blut) und Nukleosomen wurden zuvor im eckzahn Neutrophilen und Plasma von klinischen Hunde^7,8,9bewertet. Mit Fluoreszenz-Assays, festgestellt Goggs und Letendre, dass septische Hunde höhere Niveaus von Blut als gesunde Hunde^{8 haben}. Obwohl diese Techniken sehr objektiv und quantitative sind, ist Messung von Blut und Nukleosomen als Marker für NETosis unspezifisch, da sie von nekrotischen Zellen außer NETosing Neutrophilen abgeleitet werden können. Hier beschreiben wir eine Technik, die Fluoreszenz-Mikroskopie untersuchen die Verhalten von live NETosing Neutrophilen nutzt. Wir beschreiben auch ein modifiziertes Protokoll mit Doppel-Immunolabeling, um Netze und deren Komponenten wie MPO und citH3 in eckzahn neutrophile¹⁰subjektiv zu quantifizieren.

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Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der University of California, Davis genehmigt (Protokoll Nummer: 18338).

1. Blutentnahme

1. Ziehen Sie 10 mL Blut aus entweder der cephalic oder Vena Ader mit einer Nadel 21 G durch Spritze absaugen.
2. Um übermäßige Schubspannung zu vermeiden, entfernen Sie die Nadel von der Spritze vor der Übertragung von Blut in Tube(n) mit Natrium Heparin (75 USP). Die Rohre invertieren sanft ein paar Mal um ausreichende Vermischung von Antigerinnungsmittel und Blut zu gewährleisten. Fragen Sie nach belegen Klumpen oder Erythrozyten Aggregate, bevor Sie die Proben auf Eis legen.

(2) Neutrophilen Isolation

1. Verdünnen Sie Anticoagulated Blut mit ein gleiches Volumen an eiskaltem Dubecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) (pH 7.4, ohne zweiwertigen kationen). Übertragen Sie 8 mL verdünnte Blut in ein 50 mL Polypropylen konischem Rohr mit 25 mL 3 % Dextran (von Leuconostoc spp. in 0,9 % Natriumchlorid-Lösung aufgelöst). Legen Sie das Rohr aufrecht bei Raumtemperatur für 30 min, Aggregation und Sedimentation der Erythrozyten zu ermöglichen.
2. Sorgfältig Schicht 5 mL Leukozyten-Rich Plasma (Abbildung 1) auf der Oberseite 5 mL Dichte Gradienten Medien in einem 14 mL Polypropylen Rundboden Röhrchen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die 2 Lösungen¹¹mischen.
3. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 400 X g mit Beschleunigung/Verzögerung (A/D) Wert 0 (keine Bremse) für 30 min bei Raumtemperatur.
4. Mit einer 5 mL serologische pipettieren Sammeln der Granulozyten Zellschicht durch Umgehung der Plasma und peripheren mononukleären Zellen (PBMC) Schichten (Abbildung 1). Verwenden Sie eine neue pipettieren jedes Mal um Kontamination zu minimieren.
5. Platz 4 bis 6 mL von der Polymorphnuclear (PMN) Zellschicht in ein 50 mL Polypropylen konischem Rohr. Da eine kleine Menge der Erythrozyten Aggregate zusammen mit dem PMN-Layer abgesaugt werden kann, verwenden Sie eine 1 mL serologische pipettieren, entfernen Sie vorsichtig die Erythrozyten-Aggregate, die an der Unterseite des Rohres ausgeglichen werden.
6. Lösen Sie die verbleibenden Erythrozyten mit 20 mL kalte Reinstwasser. Invertieren Sie sanft das Rohr mehrmals für 30 bis 60 s angemessene Lyse bevor Sie hinzufügen ein gleiches Volumen an eiskaltem 1,8 % Natriumchlorid-Lösung zu gewährleisten.
7. Zentrifugieren Sie bei 112 X g für 10 min bei 4 ° C, A/D auf 0 gesetzt.
8. Wiederholen Sie den Erythrozyten Lyse Schritt, wenn dieser Pellet rot angezeigt wird. Verwerfen des Überstands vorsichtig mit einer serologischen pipettieren und sanft Aufschwemmen das Pellet in 100 µL des DPBS (5 mM Traubenzucker, 0,9 mM MgCl₂, 1,9 mM CaCl₂ und 1 % Rinderserumalbumin, pH 7,3). Kombinieren Sie alle resuspendierte Zellen zu und auf Eis.
9. Führen Sie einer Zellzahl mit einer automatisierten Zelle-Analyzer und überprüfen Sie die Anzahl die durch eine Hemocytometer. Bei Bedarf konzentrieren Sie PMNs auf einen Objektträger mit einer Cytocentrifuge (1.000 u/min, 5 min) und bestimmen Sie den Anteil der Neutrophilen durch zählen der Anzahl der Neutrophilen aus der Gesamtzahl der Zellen zu.
10. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Neutrophilen durch einen Trypan blau Ausschluss Test wie beschrieben durch Strober Et al. ¹² erfolgreiche Isolierung sollte eine Tragfähigkeit von 95 zu 100 % Ausbeute und Neutrophilen sollte mehr als 95 %.
11. Bestimmen Sie die Konzentration von Neutrophilen Granulozyten durch Multiplikation der gesamten Zellenzahl mit die prozentuale Rentabilität und Prozent Neutrophilen. Erfolgreiche Isolierung sollte eine Konzentration von Neutrophilen von 1,5 6 x 10⁶/mL nachgeben.
12. Verdünnen Sie Neutrophile, eine Endkonzentration von 1 x 10⁶/mL mit DPBS mit 0,9 mM MgCl₂, 5 mM Traubenzucker, 1,9 mM CaCl₂und 1 % Rinderserumalbumin mit pH 7.3 angepasst.

(3) Fluoreszenz Mikroskopie der Live Neutrophilen

1. Platz 200 bis 400 μl der Neutrophilen (1 x 10⁶/mL) in jede Vertiefung eine Poly-L-Lysin beschichtet Kultur 12-Well-Platte. Neutrophile, auf den Boden der Näpfchen zu halten, indem die Zellen bei 37 ° C für 30 min Inkubation zu ermöglichen.
2. Beschriften Sie Nukleinsäuren mit 1 μM eines zwei Nukleinsäure-Farbstoffe, die in den Zellen mit intakten Membranen Flecken und die Flecken in Zellen mit durchlässigen Membranen (siehe Tabelle der Materialien), für 10 min bei Raumtemperatur.
3. Aktivieren von Neutrophilen mit 100 μg/mL Lipopolysaccharid (LPS) (E. Coli O55. (B5), 100 nM Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) als Positivkontrolle oder gleichwertigem Umfang des DPBS als Negativkontrolle für 180 min bei 37 ° C.
4. Abrufen von Bildern mit der GFP (Anregung: 470/22 nm, Emission: 525/50 nm) und Texas Red-Kanäle (Anregung: 585/29 nm, Emission: 628/32 nm) auf ein Fluoreszenz-Mikroskopie bei 40 X Vergrößerung zu den folgenden Zeitpunkten: 30, 90, 120 oder 180 Minuten.

4. Netto-Quantifizierung und Erkennung von NET-Komponenten mit Immunfluoreszenz

1. Legen Sie vorsichtig 18 mm Durchmesser Poly-D-Lysin beschichtet Deckel rutscht in die Vertiefungen einer Kultur 12-Well-Platte. Beschriften Sie die Brunnen entsprechend.
2. Samen 100 bis 200 μL der Neutrophilen (1 x 10⁶/mL) direkt auf den Deckgläsern isoliert und Neutrophilen zur Einhaltung des Deckel rutscht durch Inkubation der Zellen bei 37 ° C für 30 min ermöglichen.
3. Neutrophilen zu aktivieren, wie in 3.3 beschrieben. Hemmen Sie NET Bildung von Neutrophilen mit 200 µΜ Vorbehandeln Cl-Amidine (15 min, 37 ° C) vor der Aktivierung wie oben beschrieben von Li Et Al. ¹³ stellen Sie sicher, dass die ordnungsgemäße Fahrzeugkontrolle (DMSO) in das Experiment enthalten ist.
4. Entfernen Sie vorsichtig die Abdeckung rutscht mit feinen Pinzette. Schicht eine Paraffin-Film-Blatt über ein Reagenzglas stehen seichte Brunnen erstellen und geben Sie 2 bis 3 Tropfen 4 % PFA in jeweils gut¹⁰. Beschriften Sie die Brunnen entsprechend und legen Sie sanft das Deckel rutscht kopfüber auf die PFA-gefüllte Vertiefungen. Können Sie Zellen bei Raumtemperatur für 20 min behoben werden.
5. Waschen Sie die Zellen 3 Mal in DPBS für 5 min, indem Sie sie aus einem Brunnen zum nächsten verschieben.
6. Wenn Immunolabelling kurz nach der Neutrophilen Aktivierung und Fixierung durchgeführt werden kann, ermöglichen Sie Deckel rutscht luftgetrocknet, indem der Deckel rutscht nach oben auf ein Stück Papier Extinktion zu sein. Deckel rutscht kann bis zur weiteren Analyse bis zu 1 Woche aufgedeckt in einer beschrifteten 12-Well-Kultur-Platte bei 4 ° C aufbewahrt. Waschen Sie die Zellen 3 Mal in DPBS für 1 min mit der gleichen Technik wie unter 4.4 bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
7. Um Zellen permeabilize, sanft lag das Deckglas auf den Kopf gestellt auf einen Rückgang von 1 % NP-40 für 1 min mit der Technik in 4.4 beschrieben. Waschen Sie 3 mal 1 min auf einer Wippe in DPBS.
8. Nach dem Zufallsprinzip eine Reihe weisen Sie jede Probe zu und verwenden Sie eine Diamant-Markierung, um den Deckgläsern entsprechend zu kennzeichnen.
9. Bereiten und Label individuelle Petrischalen mit Paraffin Film ausgekleidet und legen 100 bis 200 μL der 5 % ziegenserum auf den Film (blocking-Puffer). Legen Sie die Deckgläsern kopfüber auf den blockierenden Puffer. Legen Sie auf einer Wippe und 1 h bei 37 ° c inkubieren
10. Waschen Sie 3 Mal für 5 min auf einer Wippe in DPBS.
11. Verdünnen Sie den primären Antikörper (1: 400 Kaninchen polyklonale Anti-citrullinierte Histon H3 (citH3) in 5 % ziegenserum). Inkubieren Sie Zellen in beschrifteten Petrischalen mit Paraffin Film ausgekleidet. Legen Sie jedes Deckglas kopfüber auf 50 bis 100 μL der verdünnten Antikörper-Lösung. Legen Sie auf einer Wippe und 1 h bei 37° c inkubieren
12. Waschen Sie 3 Mal für 5 min auf einer Wippe in DPBS.
13. Verdünnte Sekundärantikörpers konjugiert zu einem Fluorophore (1: 200) in 5 % ziegenserum. Inkubieren Sie Zellen in beschrifteten Petrischalen mit Paraffin Film ausgekleidet. Legen Sie jedes Deckglas kopfüber auf 50 bis 100 μL der verdünnten Antikörper-Lösung. Legen Sie auf einer Wippe und inkubieren Sie 1 h bei 37 ° C im Dunkeln.
14. Waschen Sie 3 Mal in DPBS für 5 min auf einer Wippe in die Dunkelheit.
15. Für die gleichzeitige Erkennung von Myeloperoxidase (MPO) die folgenden Schritte für eine modifizierte Doppel Immunolabeling Protokoll wie von Li Et Al. beschrieben ¹³
16. Inkubieren Sie Zellen in beschrifteten Petrischalen mit Paraffin Film ausgekleidet. Legen Sie jedes Deckglas kopfüber auf 100 bis 200 μl 10 % Kaninchen Serum unter sanftes Schaukeln (Übernachtung, 4 ° C, im Dunkeln).
17. Waschen Sie 3 Mal in DPBS für 5 min auf einer Wippe in die Dunkelheit.
18. Inkubieren Sie Zellen in 50 μg/mL unconjugated Ziege Anti-Kaninchen-Fab für 2 h bei Raumtemperatur auf einem Rocker im Dunkeln Fragmente.
19. Waschen Sie 3 Mal in DPBS für 5 min auf einer Wippe in die Dunkelheit.
20. Verdünnen Sie Primärantikörper (1: 200 Kaninchen polyklonale Anti-Human MPO Antikörper) in 5 % ziegenserum. Inkubieren Sie Zellen in beschrifteten Petrischalen mit Paraffin Film ausgekleidet. Legen Sie jedes Deckglas kopfüber auf 50 bis 100 μL der verdünnten Antikörper-Lösung. Legen Sie auf einer Wippe und inkubieren Sie 1 h bei 37° C im Dunkeln.
21. Verdünnen Sie Sekundärantikörpers konjugiert zu einem Fluorophor in 5 % ziegenserum und inkubieren Sie wie beschrieben in 4,8
22. Waschen Sie 3 Mal in DPBS für 5 min auf einer Wippe in die Dunkelheit.
23. Interferenz-Steuerelemente sollten bereit sein, durch den Ausschluss Inkubation mit beiden primären Antikörper in einem zweiten Schritt immun-Kennzeichnung.
24. Fleck DNA mit 300 nM 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) für 5 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
25. Waschen Sie 3 Mal in DPBS für 1 min auf einer Wippe in die Dunkelheit.
26. Geben Sie einen Tropfen (~ 50 μl) der antifade Eindeckmedium auf einen Objektträger. Klopfen Sie leicht den Rand das Deckglas auf einem Küchenpapier entfernen überschüssigen Puffer vor der Montage das Deckglas mit den Zellen auf den Kopf gestellt. Das Eindeckmittel sollte eine dünne Schicht zwischen dem Deckglas und der Objektträger bilden. Um Luftblasen zu entfernen, drücken Sie vorsichtig auf das Deckglas mit feinen Pinzette.
27. Lassen Sie Proben im Dunkeln bei 4 ° c über Nacht heilen Das Eindeckmittel sollte für die mikroskopische Analyse mit Immersion Linsen verhärten. Proben in 4 ° C im Dunkeln aufbewahren.

(5) Neutrophilen extrazelluläre Trap Quantifizierung

1. Blenden Sie die Ortbestimmung erwerben und analysieren die Mikroskop-Bilder zu den experimentellen Bedingungen.
2. Mit dem Fluoreszenzmikroskop bei 40 X Vergrößerung, nehmen Sie 10 Bilder nach dem Zufallsprinzip aus verschiedenen Regionen von jedem Deckglas in einem Experiment unter den jeweiligen Kanälen. Stellen Sie sicher, dass die Belichtungszeit, Helligkeit und Kontrast der einzelnen Kanäle innerhalb der Aufnahme von Bildern konsistent gehalten werden.
3. Analysieren Sie die Bilder mit verfügbaren Software wie ImageJ (NIH). Identifizieren Sie Netze basierend auf Co Lokalisierung von Blut, citH3 und MPO (Abb. 3A, B). Die Anzahl der Netze und Neutrophilen Granulozyten in 10 ZUFALLSFELDER für jede experimentelle Bedingung zu quantifizieren. Zahlen der Netze freigegeben als Verhältnis ausgedrückt werden kann (Anzahl der Netze: Gesamtzahl der Neutrophilen) für jede experimentelle Bedingung.
4. Um die Behandlung Auswirkungen auf die intrazelluläre citH3 Ausdruck zu bewerten, zu zählen, die Zahl der Neutrophilen mit intrazellulären citH3 und Anzahl der Neutrophilen ohne intrazellulären citH3 in 10 ZUFALLSFELDER bei 40 X Vergrößerung unter den jeweiligen Kanälen ( Abbildung 3, rote Pfeile). Intrazelluläre citH3 Ausdruck kann als das Verhältnis der Zahl der Neutrophilen mit intrazellulären citH3 die Zahl der Neutrophilen ohne intrazelluläre citH3 ausgedrückt werden.

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Ergebnisse

Unter Verwendung dieses Protokolls live Cell Imaging, können Ermittler der nuklearen Morphologie, Plasmamembran Integrität und Anwesenheit von Blut im lebenden Neutrophilen beobachten. Ein Zelle impermeant nuklearen Farbstoff Flecken Kerne Säuren rot in Zellen mit beschädigten Zellmembranen. Eine weitere Zelle permeationsfähigen Farbstoff, Etiketten intrazellulären Nukleinsäuren in lebenden Zellen mit intakten Plasmamembranen. Alle intakt Neutrophils, unabhängig von ihrer Behandlu...

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Diskussion

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll, um die Änderungen in Kernen Konformation und Blut Release in lebenden Hunde Neutrophilen mit einer Zelle permeationsfähigen Färbung und eine Zelle impermeant Farbstoff zu beobachten. Der Hauptvorteil dieser Assay ist, dass es für Echtzeit-Erkennung von Netto Bildung durch hochauflösende Mikroskopie in live Neutrophilen ohne Fixierung der Zelle, daher bietet eine einfache und wertvolles Instrument für die Beobachtung von in-vitro- NET Bildung. Da dieser Test keine Antik...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma	31392	Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS	GE Life Sciences	17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	A1285801	With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190136	Without divalent cations
E. coli O55:B5	InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S11368	5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S7578	1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40	Pierce	28324
Poly-D-Lysine coated coverslips	neuVitro	H-12-pdl	12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody	Abcam	Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments	Jackson ImmunoResearch	111-007-003	Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody	Dako	A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)	Life Technologies Corporation	D1306