Ableitung und Differenzierung von Eckzahn Eierstock mesenchymalen Stammzellen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung, Erweiterung und Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen aus Eckzahn Ovargewebe.

Zusammenfassung

Interesse an mesenchymalen Stammzellen (MSCs) hat im letzten Jahrzehnt aufgrund ihrer einfachen Isolierung, Expansion und Kultur zugenommen. Studien haben vor kurzem die breite Differenzierung Kapazität gezeigt, die diese Zellen besitzen. Der Eierstock stellt einen viel versprechender Kandidat für zellbasierte Therapien, es reich an MSCs ist und, die es ist häufig nach Ovariectomy Operationen als Bioabfall entsorgt. Dieser Artikel beschreibt Verfahren zur Isolierung, Ausbau, und Differenzierung der MSCs abgeleitet aus dem Eckzahn Eierstock, ohne die Notwendigkeit der Zellsortierung Techniken. Dieses Protokoll stellt ein wichtiges Instrument für die regenerative Medizin wegen der breiten Anwendbarkeit dieser höchst differenzierbare Zellen in der klinischen und therapeutischen verwendet.

Einleitung

Die Anzahl der veröffentlichten Studien, die Fokus auf Stammzellen im letzten Jahrzehnt eine Forschungsarbeit, die durch das kollektive Ziel entdecken starke regenerative Medizin Therapien angeheizt hat, erheblich gestiegen ist. Stammzellen haben zwei primäre bestimmende Marker: selbst - Renovierung und Differenzierung. Mesenchymaler Stammzellen sind verantwortlich für regelmäßige Gewebe Umsatz und haben eine eingeschränktere Kapazität der Differenzierung im Vergleich zu embryonalen Stammzellen¹. Vor kurzem, zahlreiche Studien belegen eine Vielzahl der Differenzierung der MSCs, und ein Thema in der Diskussion ist, ob Unterschiede zwischen embryonalen und adulten Stammzellen alle²existieren.

Das Ovarium Oberflächenepithel ist ein ohne Commit Schicht von Zellen, relativ weniger differenziert, die beiden epithelialen und mesenchymalen Marker³, behalten die Fähigkeit, sich in verschiedenen Arten von Zellen als Reaktion auf differenzieren ausdrückt Umweltsignale⁴. Die genaue Lage von Stammzellen im Eierstock ist nicht bekannt; jedoch wurde vorgeschlagen, dass bipotentialen Vorfahren in der Tunica Albuginea zu Keimzellen⁵führen. Immunologische Untersuchungen haben die Hypothese, dass diese Zellen eine stromale Herkunft⁶ oder im oder proximalen dem Eierstock Oberfläche⁷. Da mesenchymaler Stammzellen zahlreiche Rezeptoren zum Ausdruck, die eine wichtige in der Zelle Adhäsion^{8 bringen Rolle}, wurde ein Experiment entwickelt, um die Hypothese zu testen, die Auswahl einer Bevölkerung der Zellen mit schnellen Adhäsion eine Bevölkerung der Zellen deutlich isolieren würde charakterisierbar als mesenchymale in der Natur. Unsere Fraktion berichtete kürzlich, die Ableitung von MSCs von Eierstockgewebe basierend auf ihre Kapazität der Haftung auf die Kunststoffoberfläche der Kulturschale in den ersten 3 h von Kultur, um eine gereinigte Population von Zellen ausstellenden schnelle Haftung⁹zu erhalten. Hier beschreiben wir die entwickelte Methode für mesenchymale Stammzellen isoliert von der ovariellen Gewebe.

Protokoll

Dieses Experiment wurde mit den Eierstöcken von vier Mischling Hündinnen nach elektiven Eingriffen an einem Eckzahn Sterilisationsprogramm gespendet durchgeführt. Dieses Experiment wurde von der Ethikkommission für Tierversuche UNESP-FCAV (Protokoll Nr. 026991/13) genehmigt.

(1) experimentelle Vorbereitung

1. Vorbereiten oder 500 mL sterile Dulbecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) ohne Kalzium und Magnesium zu kaufen.
2. Bereiten Sie ein Kollagenase ich Lager Lösung durch Mischen von 40 µg des Enzyms in 1 mL des DPBS. Mit einem 0,2 µm Spritze Filter filtern Sie und speichern Sie 2 mL Aliquote bei-20 ° C.
3. Bereiten Sie die Nährmedien aus Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) niedrige Glukose mit fetalen Serum 10 % und 1 % der Antibiotika.
4. Sterile Materialien sammeln: Scheren und Pinzetten, einer Gewebekultur Kolben, Gerichte, Rohre und 10 mL und 5 mL Pipetten.
5. Standardzellen-Kultur-Labor-Geräte verwenden: einen biologischen Sicherheitsschrank (BSC), eine Zelle Kultur Inkubator auf 5 % CO₂ und 38 ° C und einer Zentrifuge gesetzt.
6. Reinigen die BSC: mit behandschuhten Händen, Sterilisieren sie mit 70 % EtOH, mit UV-Licht.

2. Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Eierstock

1. Halten Sie nach der Operation die Eierstöcke mit PBS-Puffer auf dem Eis in einem konischen Rohr, bis zum Eintreffen im Labor.
2. Füllen Sie zwei 100 mm Petrischalen mit 10 mL PBS.
3. Entfernen Sie die Eierstöcke aus der Tube und übertragen Sie sie auf der ersten Petrischale mit PBS. Waschen Sie sie mit dem Mischen Bewegungen.
4. Sanft rufen Sie den Eierstock ab und legen Sie sie in ein anderes Gericht. Mit einer sterilen Pinzette und Schere Hackfleisch das Gewebe in sehr kleine Stücke, etwa 1 mm groß.
5. Übertragen der ovariellen Gewebes auf eine 35 mm Petrischale und 2 mL der Kollagenbildung. Hacken Sie das Gewebe ein wenig mehr.
6. Legen Sie die Petrischale im Inkubator bei 38 ° C für 3 h und schütteln Sie die Petrischale mit kreisenden Bewegungen alle 20 Minuten.
7. Entfernen Sie nach 3 h die Petrischale aus dem Inkubator.
8. Übertragen Sie den Inhalt der Schale auf eine 15 mL-Tube. 5 mL der Erweiterung Medien hinzufügen.
9. Invertieren Sie sanft das Rohr vor Zentrifugation. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 2100 X g für 7 min. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Pellet mit 3 mL Erweiterung Medien.
10. Übertragen Sie das Pellet auf eine T25 Flasche. Stellen Sie die Flasche in den Inkubator mit 5 % CO₂ bei 38 ° C für 3 h.
    Hinweis: Der wichtigste Teil des Verfahrens ist es, die Medien nach 3 h Inkubation zu ändern.
11. Entfernen Sie die Flasche aus dem Inkubator und entfernen Sie das Medium mit dem restlichen Gewebe. Die Flasche 3 mL frische Erweiterung Medien hinzufügen.
12. Wechseln Sie das Medium alle 48 h und beobachten Sie die Flasche für zelluläre Zusammenfluss.
    Hinweis: Die wichtigsten Schritte des Verfahrens ist in Abbildung 1festzustellen.

3. Ausbau der mesenchymalen Stammzellen aus dem Eierstock

1. Zelle-passage
   1. Wenn die Zellen Zusammenfluss erreicht haben, entfernen Sie das Medium aus der Flasche.
   2. Waschen Sie die Flasche mit 3 mL PBS. Entfernen Sie die PBS.
   3. Fügen Sie 1,5 mL Trypsin und setzen Sie die Flasche in den Inkubator bei 38 ° C für 3 min. klopfen Sie leicht die Flasche, die Zellen zu lösen helfen.
      Hinweis: Zellen sollten Zusammenfluss ca. 5 - 7 d nach der ersten Beschichtung erreicht.
   4. 3 mL Erweiterung Medien hinzufügen und den Inhalt auf einem konischen Rohr übertragen.
   5. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 2100 X g für 7 min. Entfernen des Überstands und 1 mL Erweiterung Medien.
   6. Der Inhalt des Röhrchens sanft zu homogenisieren.
   7. Nehmen Sie eine Aliquote von 10 µL der Probe durchzuführen Zelle zählen und habe das Rohr mit den Zellen wieder in den Inkubator.
   8. Platz 10 µL der Mischung in die Hemocytometer.
2. Zählen der Zellen
   1. Verwenden Sie 10 X-Objektiv des Mikroskops und konzentrieren Sie sich auf die Rasterlinien für die Hemocytometer.
   2. Zählen der Zellen in fünf kleine Quadrate (Abbildung 2).
   3. Multiplizieren Sie die gezählte Anzahl von 50.000, die Anzahl der Zellen pro Milliliter zu schätzen.

4. Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Eierstock

Hinweis: Differenzierung Assays wurden nach den Leitlinien in Hill Et Al. durchgeführt. ⁹.

1. 1.0 x 10⁴ Samenzellen pro Bohrloch in dreifacher Ausfertigung, mit einer 4-Well Kulturschale.
2. Fügen Sie 1 mL der Erweiterung Medien.
3. Schütteln Sie sanft die Schale mit kreisenden Bewegungen.
4. Ersetzen Sie nach 24 h die Nährmedien mit den Medien wünschenswert Differenzierung.
5. Für osteogene, adipogenen und Chondrogenic Differenzierung, Inkubation der Zellen mit der Induktion-Medien für die 30D, mit Ersatz von Medien wurden alle 3 d. spezifische Differenzierung Kits für jede dieser Proben verwendet.
6. Inkubieren Sie für neurogene Abstammung Differenzierung die Zellen für 10d in den Induktion Medien mit Ersatz von Medien jeder 3-d. Die hier verwendeten Medien enthaltenen DMEM niedrige Glukose, 2 mM Valproinsäure, Hydrocortison-1 µM, 10 µM Forskolin, 5 mM Kaliumchlorid, 5 µg/mL Insulin und 200 µM Butylated Hydroxyanisole.
7. Für Entoderm Vorstufen 5D im Entoderm Medien gemäß Herstellervorschrift die Reagenz inkubieren.
8. Inkubieren Sie für primordialen Keimzellen Abstammung Zelldifferenzierung die Zellen in den Induktion Medien für 14 d, mit Ersatz von Medien jeder 3-d. Die hier verwendeten Medien enthaltenen DMEM, 10 % FBS, 1 mM Natrium Pyruvat, 10 ng/mL LIF, unwesentlichen Aminosäuren 1 mM, 2 mM L-Glutamin, 5 µg/mL Insulin, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 60 µM Putrescin, 20 µg/mL Transferrin, 10 ng/mL Maus epidermalen Wachstumsfaktor, 1 ng/mL menschlichen grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 40 ng/mL Human glial cell Line-derived Neurotrophic Factor und 15 mg/L Penicillin.

Ergebnisse

Mesenchymale Stammzellen isoliert von Eckzahn Eierstock:

Die Eierstöcke MSC Isolierung Verfahren ist in Abbildung 1zusammengefasst. Nach der Operation, Gewebe zu hacken, Kollagenase Verdauung und ein Medienwechsel 3 h nach dem Beginn der Kultur wurde eine vermeintliche MSC Bevölkerung mit schnellen Kunststoff-Klebstoff Eigenschaften von Eckzahn Ovargewebe erfolgre...

Diskussion

Hier stellen wir Hinweise darauf, dass MSCs von Eckzahn Eierstockgewebe isoliert werden können die biologische Abfälle nach Ovariectomy gilt. Da viele Zelltypen in den Eierstöcken gefunden werden können, haben wir vorgeschlagen, ein Protokoll, um wählen MSCs basierend auf ihre schnelle Einhaltung der Kunststoff, der Zellen, die wuchs in einem monomolekularen Film mit einer Fibroblasten-ähnliche Morphologie erfolgreich ausgewählt.

Der erste Bericht über die Ableitung von MSCs aus dem Kn...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Thermo Fisher	14190144
Collagenase I	Thermo Fisher	17100017
Tissue flask	Corning	CLS3056
DMEM low glucose	Thermo Fisher	11054020
FBS	Thermo Fisher	12484-010
TrypLE express	Thermo Fisher	12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit	StemCell	5110
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15070063
CD45	AbD Serotec	MCA 2035S
CD34	AbD Serotec	MCA 2411GA
CD90	AbD Serotec	MCA 1036G
CD44	AbD Serotec	MCA 1041
Nestin	Milipore	MAB353
β-Tubulin	Milipore	MAB1637
DDX4	Invitrogen	PA5 -23378
IgG- FITC	AbD Serotec	STAR80F
IgG- FITC	AbD Serotec	STAR120F