Quantifizierung der Hypopigmentation Aktivität In Vitro

Zusammenfassung

Wir beschreiben drei experimentelle Methoden zur Bewertung der Hypopigmentation Aktivität von Chemikalien, die in-vitro-: Quantifizierung der 1) zellulären Tyrosinase-Aktivität und Melanin (2) Inhalt und (3) Messung von Melanin durch zelluläre Melanin Färbung und Bildanalyse.

Zusammenfassung

Diese Studie stellt Labormethoden für die Quantifizierung von Hypopigmentierung Aktivität in vitro. Melanin, das große Pigment in Melanozyten, wird als Reaktion auf mehrere zelluläre und umweltbedingten Faktoren synthetisiert. Melanin schützt die Hautzellen vor UV-Schäden, aber auch biophysikalische und biochemische Funktionen hat. Übermäßige Produktion oder Ansammlung von Melanin in den Melanozyten kann dazu führen, dass dermatologische Problemen, wie z. B. Muttermale, Sommersprossen, Pigmentflecken und Melasma. Daher ist die Kontrolle der Melanogenese mit Hypopigmentierung Agenten wichtig bei Patienten mit klinischen oder kosmetische Bedürfnisse. Melanin wird in erster Linie in den Melanosomen Melanozyten in einen komplexen biochemischen Prozess namens Melanogenese, welche von der Erwartungshaltung extrinsischen und intrinsischen Faktoren wie Hormone, Entzündungen, Alter und UV-Licht Exposition synthetisiert. Wir beschreiben drei Methoden zur Bestimmung der Hypopigmentation Aktivität von chemischen oder natürlichen Substanzen in Melanozyten: Messung von (1) zellulären Tyrosinase-Aktivität und Melanin (2) Inhalt und (3) Färbung und Quantifizierung zellulären Melanin mit Bild Analyse.

In Melanogenese katalysiert Tyrosinase die Bandbreitenbegrenzung Schritt, der L-Tyrosin in 3,4-Dihydroxyphenylalanine (l-Dopa) und dann in Dopaquinone umwandelt. Daher ist die Hemmung der Tyrosinase eine primäre Hypopigmentierung Mechanismus. In kultivierten Melanozyten kann Tyrosinase-Aktivität durch Hinzufügen von l-Dopa als Substrat und Messung Dopaquinone Produktion durch Spektralphotometrie quantifiziert werden. Melanogenese kann auch durch Quantifizierung des Melanin Inhalts gemessen werden. Der Melanin-haltigen zelluläre Anteil wird mit NaOH extrahiert und Melanin wird spektrophotometrisch quantifiziert. Zu guter Letzt kann der Melanin Inhalt durch die Bildanalyse nach Fontana-Masson Färbung von Melanin quantifiziert werden. Obwohl die Ergebnisse dieser in-vitro-Untersuchungen nicht immer in der menschlichen Haut reproduziert werden können, sind diese Methoden vor allem als erster Schritt um potenzielle Hypopigmentierung Aktivitäten zu erkennen in der Melanogenese Forschung, verbreitet. Diese Methoden können auch zur Aktivität der Melanozyten, Wachstum und Differenzierung zu bewerten. Die Gültigkeit der Effekte gewährleisten konsistente Ergebnisse mit drei verschiedenen Methoden.

Einleitung

Melanin spielt eine entscheidende Rolle in der Physiologie, Pathologie und Toxikologie mehrere Organe einschließlich der Haut, Augen und Gehirn¹. Hauptfunktionen von Melanin sind Foto-Screening und biochemischen Wirkungen. Melanin absorbiert Nah-Infrarot- und sichtbares Licht sowie Ultraviolett (UV) Strahlung, mit erhöhten Absorptionsraten bei kürzeren Wellenlängen des Lichts; Melanin schützt somit vor Schäden durch sichtbares Licht oder UV Strahlung²Gewebe. Melanin ist ein Antioxidans und hat eine Affinität für Metalle und andere giftigen Chemikalien; Daher kann es Gewebe vor oxidativen und chemischen Stress³schützen. Allerdings verursacht die übermäßige Produktion von Melanin dermatologische Probleme.

Die Quantität und Qualität von Melanin in der Haut und Iris sind die wichtigsten Determinanten der Farbe der Iris und der Haut. Menschen können unterschiedlicher Hautfarbe Farbvorlieben haben; Einige bevorzugen gebräunten Haut, während andere hellere Hautfarben bevorzugen. Abhängig von diesen Verbraucherprofile entwickelten Hypopigmentierung Kosmetik Einzelmärkte für bevorzugte Haut Farben⁴zu befriedigen. Dementsprechend sind Studien der Hypopigmentation und Anti-Melanogenic Tätigkeit wichtig, sowohl wissenschaftlich als auch praktisch.

Melanogenese ist der komplexe Prozess der Melanin Biosynthese durch eine Reihe von enzymatischen und spontane chemische Reaktionen in Melanozyten. Eine Melanozyten ist umgeben von ca. 36 Keratinozyten und Melanozyten sind die Melanin-Synthese-Fabriken, die ihr Produkt zu benachbarten Keratinozyten verteilen. In der Haut wird das Melanin produziert und gespeichert in der Melanosomal Fach der Melanozyten zu benachbarten Keratinozyten in die Epidermis über Dendriten transportiert.

L-Tyrosin dient als das ursprüngliche Substrat für Melanogenese und das Enzym Tyrosinase zwei aufeinander folgende Reaktionen katalysiert, die L-Tyrosin in 3,4-Dihydroxyphenylalanine (DOPA) und dann in Dopaquinone umwandeln. Diese Reaktionen sind die Bandbreitenbegrenzung Schritt Melanogenese^5,6. Dementsprechend kann Hypopigmentierung Aktivität zuerst durch Beurteilung zellulärer Tyrosinase-Aktivität direkt gemessen werden. Hierzu sind Melanozyten Extrakte mit Tyrosinase mit DOPA inkubiert und die Dopaquinone produziert in den Proben gemessen werden, durch Spektralphotometrie auf 475 nm. Die Werte werden durch die Proteinkonzentrationen der Proben und Stoffe mit Hypopigmentierung Aktivität führen zu weniger Dopaquinone Bildung im Vergleich zu Kontrollen normalisiert.

Zweitens kann Hypopigmentierung Aktivität durch Messung von Melanin in kultivierten Melanozyten direkt quantifiziert werden. Nach der Behandlung der Zellen mit dem Testmaterial, Melanin unter alkalischen Bedingungen gewonnen wird und der Melanin Inhalt wird quantifiziert durch Spektralphotometrie bei 400 nm. Ein Hypopigmentierung Agent führt zu einem niedrigeren Gehalt an Melanin als die Kontrollen-⁷.

Schließlich kann die Hypopigmentation Aktivität mit Fontana-Masson Melanin Färbung und anschließende Bildanalyse quantifiziert werden. In der Fontana-Masson Färbung, Melanin Granulat Ammoniak-Silbernitrat auf einen sichtbaren schwarzen metallischen Zustand reduzieren und die schwarzen Bereiche von Zellen in mikroskopische Aufnahmen repräsentieren die Menge an Melanin.

Ein Hypopigmentierung Agent gibt in der Regel einheitliche und vergleichbare Ergebnisse mit diesen drei Methoden, die bestätigt, dass die Aktivität des Stoffes gültig ist. Alternativ kann es nützlich, um den Ausdruck von wichtigen Genen und Proteinen in Melanogenese in Beantwortung einer Prüfsubstanz Hypopigmentierung Aktivität untersuchen zu messen sein. Wichtige Enzyme in Melanogenese⁸sind neben Tyrosinase Tyrosinase-related Proteine (TRP-1) und Dopachrome Tautomerase (TRP-2). Die Transkription Faktor Mikrophthalmie-assoziierter Transkriptionsfaktor (MITF) ist ein master Regulator Melanogenese und Quantifizierung von seiner gen/Proteingehalte Ausdruck oder ein Promotor-Aktivität-Assay kann auch zur Hypopigmentierung Tätigkeit zu beurteilen.

Protokoll

1. Vorbereitung von Mediums, Verbindungen und Reagenzien

1. B16F10 komplette Wachstumsmedium vorzubereiten. Ergänzung Dulbecco geändert Adlers Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (PEST).
   1. Um 500 mL des kompletten Medium zu machen, mischen Sie 445 mL Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) mit 50 mL der FBS und 5 mL von PEST in eine sterilisierte Glasflasche 1 L. Nach dem Mischen sanft, Filtern Sie das Medium durch einen 0,2 µm Flaschenverschluss Filter, um eine neue sterilisierte Glasflasche und dann speichern bei 4 ° C.
      Achtung: Alle Kulturtechniken der Zelle sollte in mikrobiologischen Sicherheitsschrank mit aseptischen Technik um zu Sterilität zu gewährleisten erfolgen.
2. Lyse Puffer vorzubereiten: 20 mM Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane mit 0,1 % Triton x-100 (V/V)-Puffer bei pH 7,5 (pH mit HCl eingestellt). Dieser Puffer kann verwendet werden, für 3 Monate bei Raumtemperatur (RT). Die Lyse-Puffer direkt vor der Verwendung Protease-Inhibitoren hinzufügen.
3. Tyrosinase-Inhibitor Testpuffer vorzubereiten. Bereiten Sie 1 M NaH₂PO₄ (monobasic) und 1 M Na₂HPO₄ (Diabas-) auf Lagerlösungen. Mischen Sie 46,3 mL Na₂HPO₄ und 53,7 mL NaH₂PO₄ zu einem Endvolumen von 0,1 M-Natrium-Phosphat-Puffer (pH 6.8) vorzubereiten.
   1. Verdünnen Sie der resultierenden Mischung bis 1 L (Endvolumen) mit H₂O. anpassen den pH-Wert der Endlösung auf 6,8. Dieser Puffer kann verwendet werden, für 1 Monat wenn bei 4 ° c gelagert
4. Tyrosinase-Substratlösung vorbereiten: 0,1 % 3,4-Dihydroxy-L-Phenylalanin (DOPA, w/V) gelöst in Testpuffer Tyrosinase-Hemmer (siehe Schritt 1.3).
   Achtung: Halten Sie auf dem Eis während des Betriebs.
5. Bereiten Sie optional 100 U/mL Pilz Tyrosinase. Die gefriergetrockneten Pilz Tyrosinase in Testpuffer Tyrosinase-Inhibitor auflösen. Diese Lösung eignet sich für 2 Monate bei – 20 ° c Lagerung Der Pilz Tyrosinase-Aktivität als auch die zelluläre Tyrosinase-Aktivität werden in Anwesenheit von Zelle Materialien berechnet.
   Achtung: Die Lösung ist regelmÄÑig, bevor wiederholt so Einfrieren, Einfrieren und Auftauen vermieden werden kann. Halten Sie die Lösung auf dem Eis während des Betriebs.
6. Bereiten Sie 1 N NaOH-Lösung. 4 g NaOH in einem volumetrischen Kolben wiegen und in destilliertem Wasser auf 100 mL machen auflösen.
7. Fixierung-Lösung (10 % Formalin) vorzubereiten. Verdünnen Sie 27 mL 37 % Formaldehyd mit 73 mL destilliertem Wasser. Bereiten Sie täglich frisch.
8. Ammoniakhaltige Silber Stammlösung vorbereiten. 5 mL 10 % Silbernitratlösung in einem volumetrischen Kolben vorzubereiten. Fügen Sie Ammonium Hydroxid Lösung tropfenweise, hinzu, bis der Niederschlag vollständig gelöst ist. Fügen Sie 200 μL der Silbernitrat-Lösung (10 %). Die Lösung wird leicht trüb werden.
   Achtung: Vermeiden Sie Kontakt und Inhalation. Verwenden einer Abzugshaube.
9. Ammoniakhaltige Silber Arbeitslösung vorzubereiten. Verdünnen Sie 2,5 mL ammoniakalischen Silber Stammlösung mit 7,5 mL destilliertem Wasser. Einmal verwenden und dann entsorgen.
   Achtung: Vermeiden Sie Kontakt und Inhalation. Verwenden einer Abzugshaube.
10. 0,1 % gold Chlorid vorzubereiten. Bereiten Sie 1 mL 10 % gold Chlorid und fügen Sie 99 mL destilliertem Wasser in einem volumetrischen Kolben hinzu. Bereiten Sie täglich frisch.
11. Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) vorzubereiten. 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ und 0,24 g KH₂PO₄ in 800 mL destilliertem Wasser zugeben. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit HCl. verdünnt das entstehende Gemisch bis 1 L (endgültige Volumen) mit destilliertem Wasser.
12. Bereiten Sie 5 % (w/V) Natriumthiosulfat-Lösung in destilliertem Wasser gelöst.

2. Handy-Kultur und Behandlung

1. Verwenden Sie handelsübliche B16F10 Zellen. Pflegen Sie die B16F10 Zellen im kompletten Medium. Halten Sie die Zelle Kultur Kolben in eine befeuchtete, 5 % CO₂ Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C.
2. Testverbindungen, Inhibitor Positivkontrolle und Negativkontrolle Proben vorbereiten.
   1. Testverbindungen in geeigneten Lösungsmitteln auflösen. Wasserlösliche Verbindungen in bidestilliertem Wasser auflösen. Lösen sich Wasser unlösliche Verbindungen in geeigneten organischen Lösungsmittel, z. B.., DMSO.
   2. Hier verwenden Sie Arbutin in bidestilliertem Wasser (125 µg/mL) aufgelöst als Positivkontrolle um die Hypopigmentation Aktivität im Vergleich zu Testverbindungen oder eine Negativkontrolle zu beurteilen. Als Negativkontrolle (Control Fahrzeug behandelt), verwenden Sie die Lösungen oder Puffer in die zu untersuchende Probe, z.B., bidestilliertem Wasser, DMSO, Ethanol.
3. Zelle zu säen und Behandlung
   1. Samen B16F10 Zellen bei 5 × 10⁴ Zellen/Brunnen in Kultur 24-Well-Platten mit kompletten Medium und inkubieren Sie in eine CO₂ Inkubator für 24 h. Aspirieren Sie nach der Inkubation das komplette Medium.
   2. Inkubieren Sie Zellen mit Testverbindungen, ein Inhibitor-Steuerelement oder eine negative Kontrolle in einem CO-₂ -Inkubator für 72 h Check Zellen alle 24 h unter dem Mikroskop-haltigem DMEM Medium (ohne FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin). Gehen Sie nach diesem Schritt zu Schritte 3 bis 5 für weitere Experimente.
      Achtung: Die Mischung der Prüfsubstanz und DMEM Medium sollte durch einen 0,2 µm-Filter gefiltert werden.

3. Messung der zellulären Tyrosinase-Aktivität

1. Mit der in Schritt2 beschriebenen Methode, entfernen Sie Medien zu und spülen Sie Zellen zweimal mit 300 μL von kaltem PBS.
2. Legen Sie der Zellplatte Kultur auf Eis. Fügen Sie 300 μL der Lyse Puffer und 5 min inkubieren. Dann sammeln Sie die Zelle lysate mit einem Schaber Zelle und übertragen Sie die Zelle lysate zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
3. Homogenisieren die Zelle lysate mit einer Zelle Homogenisator bei 14.500 u/min für 2 s, 3 Mal auf dem Eis, intrazelluläre Tyrosinase zu erhalten. Verwenden Sie den Optimalzustand speziell für den Homogenisator.
4. Zentrifugieren Sie für 10 min bei 12.000 × g bei 4 ° C und übertragen Sie überstand die Zelle auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Halten Sie auf dem Eis während des Betriebs.
5. Übertragen Sie 70 μl des Überstands auf einer 96-Well klar Polystyrol Mikrotestplatte.
6. Hinzufügen von 140 μL einer Lösung, die zu einer 96-Well klar Polystyrol Mikrotestplatte Tyrosinase Substrat (DOPA), leicht schütteln und 2 h bei 37 ° c inkubieren
7. Optional, jedes gut 70 μL 100 U/mL Pilz Tyrosinase-Lösung hinzu und 2 h bei 37 ° c inkubieren
8. Messen Sie die Tyrosinase-Aktivität bei einer Wellenlänge von 475 nm mit Mikrotestplatte Reader.
9. Die Tyrosinase-Aktivität, die Konzentration des Proteins jeder Probe zu normalisieren. Messen Sie die Proteinkonzentration jeder Probe durch einen Bradford-Assay.

4. Messung der Melanin Inhalt

1. Mit der in Schritt2 beschriebenen Methode, entfernen Sie Medien zu und spülen Sie Zellen zweimal mit 300 μL von kaltem PBS.
2. Legen Sie der Zellplatte Kultur auf Eis. Fügen Sie 300 μL der Lyse Puffer und 5 min inkubieren. Dann sammeln Sie die Zelle lysate mit einem Schaber Zelle und übertragen Sie die Zelle lysate zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
3. Zentrifuge für 10 min bei 12.000 × g bei 4 ° C.
4. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre und Messen Gesamt-Protein-Konzentration für die Normalisierung. Messen Sie die Proteinkonzentration jeder Probe durch einen Bradford-Assay.
5. Jedes Pellet 300 μL 1 N NaOH hinzu und bei 60 ° C für 1 h inkubieren.
6. Zentrifugieren Sie die gelöste Lösung für 10 min bei 12.000 × g bei 4 ° C.
7. Übertragen Sie 200 μl des Überstands auf einer 96-Well-Mikrotestplatte.
8. Messen der Melanin Inhalt bei einer Wellenlänge von 400 nm.
9. Der Melanin Inhalt zur Konzentration Proteins zu normalisieren.

(5) Fontana – Masson Färbung

1. Fontana-Masson Färbung
   1. Waschen Sie Zellen zweimal mit 300 μL von kaltem PBS.
   2. Fügen Sie 200 μl 10 % Formalin in jede Vertiefung und 1 h bei 4 ° c inkubieren
   3. Mit destilliertem Wasser abspülen.
   4. Fügen Sie 200 μl vorgewärmten ammoniakalischen Silber Lösung arbeiten und Inkubation für 1 h bei 37 ° C oder bis die Zellen in der Farbe gelb/braun werden.
      Achtung: Frisch gemixten ammoniakalischen Silber Arbeitslösung in 58 – 60° C Wasserbad und ausreichend Zeit für die Temperatur equilibrate.
   5. Ammoniakhaltige Silber arbeiten Lösung zu entfernen und mit destilliertem Wasser abspülen.
   6. Entfernen Sie destilliertes Wasser. Fügen Sie 200 μL von 0,1 % gold Chlorid und 2 min bei RT inkubieren
   7. 0,1 % gold-Chlorid-Lösung zu entfernen und mit destilliertem Wasser abspülen.
   8. Entfernen Sie destilliertes Wasser. Fügen Sie 200 μL Natriumthiosulfat-Lösung (5 %, w/V) und 2 min inkubieren.
   9. Natriumthiosulfat-Lösung entfernen und mit destilliertem Wasser abspülen.
   10. Entfernen Sie destilliertes Wasser. Fügen Sie 200 μL der nuklearen schnell rot und 5 min inkubieren.
   11. Entfernen Sie nukleare schnell rot und mit Leitungswasser spülen.
   12. Leitungswasser zu entfernen und die gefärbten Zellen unter dem Mikroskop zu beobachten.
2. Fontana-Masson Färbung (Schwelle Analyse mittels ImageJ)
   Hinweis: Ein Beispiel für das Bild-Analyseverfahren mit ImageJ-Software zeigt die Zusatzmaterialien.
   1. Öffnen Sie das Programm ImageJ.
   2. Wählen Sie -Datei | Offen | Mikroskopbild.
   3. Wählen Sie Bild aus | Anpassen | Farbe Schwelle.
   4. Um die Fläche mit Fontana – Masson befleckt zu messen, die Messlatte Helligkeit Parameter auf Null und passen Sie die Helligkeit-Leiste, um den Punkt zu finden, an dem alle gefärbte Zellen (schwarz oder dunkelbraun) enthalten sind.
   5. Wählen Sie analysieren | Analysieren Sie Partikel. Das zusammenfassen Kontrollkästchen im Fenster Analyze Partikel und drücken Sie "OK". Das zusammenfassende Ergebnis zu erhalten und in ein Arbeitsblatt einfügen.
      Hinweis: Die Beschreibung der resultierende Feld Parameter lauten wie folgt:
      : Segmentname jedes Bild
      Anzahl: Anzahl der gefärbten Zellen
      Gesamtfläche: Gesamtfläche der gezählten Zellen
      Durchschnittliche Größe: Bereich/Gesamtzahl
      %-Bereich: gebeizt Bereich/Gesamt Fläche × 100 %; Gesamtfläche wird automatisch berechnet.
   6. Berechnen Sie die Relative Fläche mit Melanin mit dem Wert der Gesamtfläche befleckt.
      Relative Melanin gefärbten Fläche (%) = Wert der zellulären Gesamtfläche von Test Probe/durchschnittliche Gesamtfläche von Kontrolle × 100, d.h.

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse für die Hypopigmentation Aktivität von Arbutin, ein Anti-Melanogenic compound in B16F10 Melanozyten sind unten dargestellt. Abbildung 1A zeigt, dass Arbutin deutlich unterdrückt die zelluläre Tyrosinase-Aktivität im Vergleich mit dem Fahrzeug behandelt. In ähnlicher Weise wurde der Melanin Inhalt von Zellen stimuliert mit Arbutin deutlich im Vergleich mit den Reglern (Abbildung 1 b) reduziert. Mik...

Diskussion

Wir präsentierten Protokolle für die Bewertung der Hypopigmentation Aktivität der Testverbindungen mit kultivierten Melanozyten. Die repräsentativen Ergebnisse zeigten die Hypopigmentation Wirkung von Arbutin, ein Tyrosinase-Inhibitoren, die Tyrosinase-Aktivität und zellulären Melanin Inhalt gehemmt. Diese Methoden sind in der Anti-Melanogenic Aktivität Forschung verbreitet. Mit diesen Tests, haben wir auch erfolgreich identifiziert mehrere bioaktive Substanzen, die Melanogenese hemmende Effekte auf B16F10 Zellen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine	Sigma	D9628
Ammonium hydroxide solution	Sigma	#320145
Arbutin	Fluka	#10960
DMEM	HyClone	SH30243.01
FBS	HyClone	SH30084.03
Formalin	Yakuri Pure Chemicals	#16223	37%
Gold chloride	American MasterTech	AHG0226	0.10%
HCl	Samchun chemical	H0255
KCl	Bio basic Canada Inc.	PB0440
KH2PO4	Sigma	#60218
Na2HPO4	J.T.Baker	#3817-01
NaCl	Duksan pure chemicals	#81
NaOH	Sigma	655104
Nuclear fast red	Merck	100121	Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution	HyClone	SV30010
Silver nitrate	Duksan Pure Chemicals	#900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	J.T. Baker	#3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)	Sigma	S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate	Duksan Pure Chemicals	#2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Bio Basic Canada	TB0196
Triton X-100	Union Carbide	T8787
Tyrosinase from mushroom	Sigma	T3824	25 KU