Methoden zur Bewertung der Rolle von c-Fos und Dusp1 in Abhängigkeit der Onkogen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir Protokolle für die genetischen und chemischen Validierung von c-Fos und Dusp1 als Medikament Ziel bei Leukämie mit in vitro und in vivo genetische und humanisierte Mausmodelle. Diese Methode kann auf jedes beliebige Ziel für genetische Validierung und therapeutische Entwicklung angewendet werden.

Zusammenfassung

Die Demonstration der Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKIs) bei der Behandlung von chronisch-myeloischer Leukämie (CML) hat eine neue Ära in der Krebstherapie eingeläutet. Jedoch reagiert eine kleine Population von Zellen nicht auf TKI Behandlung, was zu minimaler Resterkrankung (MRD); auch die potenten TKIs scheitern, diese Zellen zu beseitigen. Diese MRD-Zellen dienen als Reservoir Resistenz gegen Therapie entwickeln. Warum TKI Behandlung gegen MRD Zellen unwirksam ist, ist nicht bekannt. Growth Factor Signalisierung unterstützt das Überleben der MRD-Zellen während der TKI Behandlung verwickelt ist, aber ein mechanistisches Verständnis fehlt. Jüngste Studien gezeigt, dass erhöhte c-Fos und Dusp1 Ausdruck durch konvergente onkogenen und Wachstumsfaktor Signalisierung in MRD Zellen TKI-Resistenz zu vermitteln. Die genetische und chemische Hemmung der c-Fos und Dusp1 CML exquisit empfindlich auf TKIs macht und heilt CML in beide genetischen und humanisierte Mausmodelle. Wir identifizieren dieser Zielgene mit mehreren Microarrays von TKI-empfindlichen und -resistente Zellen. Hier bieten wir Methoden zur Target-Validierung mit in vitro und in vivo Mausmodellen. Diese Methoden können leicht auf jedes Ziel für genetische Validierung und therapeutische Entwicklung angewendet werden.

Einleitung

Konstitutive Tyrosin-Kinase-Aktivität von BCR-ABL1 Fusion Onkogen verursacht CML, sorgt für eine Begründung um die Kinase-Aktivität von niedermolekularer Hemmer ansprechen. Der Erfolg von TKIs bei der Behandlung von CML-Patienten revolutioniert das Konzept der gezielten Therapie^1,2. Anschließend entwickelte Anti-Kinase-Therapie als Präzisionsmedizin für mehrere andere Malignome, einschließlich der solide Tumoren. Bisher sind mehr als dreißig Kinase-Inhibitoren von der United State FDA für die Behandlung von verschiedenen malignen Erkrankungen zugelassen. TKI-Behandlung ist, zwar sehr effektiv bei der Bekämpfung der Krankheitsbildes ist es nicht heilende. Außerdem besteht eine kleine Population von Krebszellen während der Behandlung: die MRD^3,4,5. Selbst Patienten, die eine kompletten Remission zeigte bleiben MRD, die schließlich Ergebnisse in Rückfall, wenn nicht ständig unterdrückt. Daher ist die Beseitigung der MRD-Zellen benötigt, um eine dauerhafte oder heilende Reaktion zu erreichen. CML ist eine wertvolle Paradigma für das Konzept der Präzisionsmedizin, Mechanismen der Onkogenese, rationale Ziel gerichtete Therapie, Krankheitsverlauf und Resistenzen zu definieren. Aber auch heute noch die TKI-induzierte Zelltod bei Krebszellen zu fahren ist nicht vollständig geklärt, noch warum MRD Zellen (bestehend aus leukämischen Stammzellen [LSCs]) sind intrinsisch resistent gegen TKIs^4,6. Dennoch ist das Phänomen der "Onkogen Abhängigkeit von" mutierten Kinase Oncoprotein TKI Wirksamkeit beteiligt wo die akuten Hemmung der gezielten Onkogen von TKIs einen onkogenen Schock verursacht, der zu einer massiven Proapoptotic Antwort oder Ruhe in Zelle führt Kontext-abhängigen Weise^6,7,8,9. Es fehlen jedoch die mechanistische Onkogen Abhängigkeit zu untermauern. Jüngste Studien haben verwickelt, dass Onkogen Abhängigkeit hebt Wachstumsfaktor Signal- und folglich Resistenz zu TKI-Therapie^{10,11,12 verleiht}. Daher durchgeführt, um einen Einblick in den Mechanismus der Onkogen Abhängigkeit, wir Vollständiggenom Expression profiling von BCR-ABL1 süchtig und nonaddicted Zellen (gewachsen mit Wachstumsfaktoren), die ergab, dass c-Fos und Dusp1 wichtige Mediatoren der sind Onkogen sucht¹³. Die genetische Löschung von c-Fos und Dusp1 ist synthetischen tödlich für BCR-ABL1 mit dem Ausdruck Zellen und die Mäuse im Experiment nicht Leukämie entwickeln. Darüber hinaus geheilt die Hemmung der c-Fos und DUSP1 von niedermolekularer Hemmer BCR-ABL1-induzierte CML bei Mäusen. Die Ergebnisse zeigen, dass Ausdruck Niveaus von c-Fos und Dusp1 in Krebszellen, die Apoptotic Schwellenwert definieren, so dass niedrigere Medikament Empfindlichkeit verleihen, während höhere Resistenz gegen Therapie¹³führen.

Um die Fahrt der Onkogen Abhängigkeit Gene zu identifizieren, haben wir mehrere Vollständiggenom Expressions-profiling Experimente im Beisein von Wachstumsfaktor und einem TKI (Imatinib) mit Maus und CML Patienten gewonnenen Zellen (K562) durchgeführt. Diese Daten wurden analysiert, parallel mit CML Patienten Datensätze CD34 gewonnenen⁺ Blutstammzellen vor und nach der Behandlung mit Imatinib. Diese Analyse ergab drei Gene (ein Transkriptionsfaktor [c-Fos], duale Spezifität Phosphatase 1 [Dusp1], und ein RNA-bindende Protein [Zfp36]) sind häufig in TKI-resistenten Zellen hochreguliert. Um die Bedeutung dieser Gene in Übertragung Resistenzen zu validieren, werden Schritt für Schritt in Vitro und in Vivo -Analyse durchgeführt. Der Ausdruck Niveaus dieser Gene wurden durch Echtzeit-qPCR (RT-qPCR) und westliche Beflecken in resistenten Zellen bestätigt. Weitere, cDNA-Überexpression und Zuschlag von ShRNA Haarnadeln von c-Fos, Dusp1, und Zfp36 ergab, dass erhöhte c-Fos und Dusp1 Ausdrücke sind ausreichende und notwendige zu TKI-Resistenz verleihen. Daher führten wir eine in-vivo Validierung mithilfe von Mausmodellen mit c-Fos und Dusp1 nur. Für die genetische Validierung von c-Fos und Dusp1 wir ROSACreERT-induzierbaren c-Fos^fl/fl Mäuse (conditional Knockout)¹⁴ geschaffen und kreuzten sie mit Dusp1^{- / -} (gerade Knockout)¹⁵ zu ROSACreERT2-c-Fos^fl/fl Dusp1^{- / -} Doppel-transgener Mäuse. Knochenmark stammenden c-Kit⁺ Zellen (von c-Fos^fl/fl-, Dusp1^{- / -}- und c-Fos^fl/flDusp1^{- / -}) auszudrücken BCR-ABL1 analysierten in Vitro in einer Kolonie-bildende Einheit (KBE) Assay und in waren Vivo durch Knochenmark-Transplantation bei letal bestrahlten Mäusen, die Anforderung von c-Fos und Dusp1 allein oder zu zweit in Leukämie Entwicklung zu testen. Ebenso die chemische Hemmungen von c-Fos von DFC (Difluorinated Curcumin)¹⁶ und Dusp1 von BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)¹⁷ getestet wurden in vitro und in vivo mit BCR-ABL1-mit dem Ausdruck, Knochen Knochenmark stammenden c-Kit⁺ Zellen von der Wildtyp (WT) Maus. Um die Anforderung des c-Fos und Dusp1 in leukämischen Stammzellen zu bestätigen, haben wir eine CML-Maus-Modell wo BCR-ABL1 speziell in seiner Stammzellen durch Doxycyclin (Tet-Transaktivator drückt unter murinen Stammzellen Leukämie (SCL) Gen 3' Enhancer induziert wurde verwendet Verordnung)^18,19. Wir verwendeten Knochenmark Lin^–Sca⁺c-Kit⁺ (LSK) Zellen aus diesen Mäusen in einer in-vivo-Transplantation-Assay. Darüber hinaus wir Phopsho-p38 Ebenen und den Ausdruck von IL-6 als Pharmako-Dynamik Biomarker für Dusp1 und c-Fos Hemmung bzw. geschaffen, in Vivo. Zu guter Letzt, die Studie zur Relevanz für den Menschen, Patienten abgeleitet CD34 auszudehnen⁺ Zellen (entspricht der c-Kit⁺ -Zellen von Mäusen) wurden langfristige unterzogen in-vitro-Kultur-Einleitung Zelle Assays (LTCIC) und eine in-vivo humanisierten Mausmodell der CML^20,21. Die immungeschwächte Mäuse wurden mit CML CD34 + Zellen, gefolgt von medikamentöse Behandlung und Analyse der menschlichen leukämischen Zellen überleben transplantiert.

In diesem Projekt entwickeln wir Methoden für Zielkennzeichnung und Validierungen mit genetischen und chemischen Werkzeugen mit verschiedenen präklinischen Modellen. Diese Methoden können erfolgreich angewendet werden, um andere Ziele entwickeln chemische Modalitäten für die therapeutische Entwicklung zu überprüfen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) in Cincinnati Children Hospital Medical Center (CCHMC) durchgeführt. Menschliche Exemplare (Normal BM und von CML (p210-BCR-ABL +) Leukämie) wurden durch Institutional Review Board genehmigt Protokolle erhalten (Institutional Review Board: Federalwide Qualitätssicherung #00002988 Cincinnati Children Hospital Medical Center) und Spender-informierten Einwilligung von CCHMC und der University of Cincinnati.

1. Echtzeit-qPCR Analyse

1. Gesamt-RNS aus BaF3 Zellen wachsen in RPMI ergänzt mit 10 % FBS und 10 % WEHI verbrachte Kulturmedium als Quelle von Interleukin-3 (IL-3) zu isolieren.
2. Ernte der Zellen im logarithmischen Phase (99 % lebendig) aus behandelten (IL-3 und Imatinib) sowie aus unbehandelten Proben, und sie bei 435 X g für 3 min zentrifugieren. Die Gesundheit und die Entwicklungsstadien der Zellen sind wichtig, da ihre gen-Expressionsprofile drastisch ändern können.
3. Isolieren Sie RNA durch die Reinigung total RNA²². Quantifizieren Sie die gesamte-RNS; dann unterliegen sie DNase-Behandlung-²³. Gleiche Mengen DNA-freie RNA zu konvertieren (2 µg), cDNA mit Reverse-Transkriptase-²⁴.
4. Führen Sie qPCRs mit dem Gen-spezifische Primer (Tabelle 1). PCRs 20 µL Reaktionen im 0,2 mL durchführen, dünnwandige PCR Schläuche mit optischen Kappen, mit einer 1 X Polymerase 0,5 µM jede Grundierung, 1 µL DNA und Wasser mischen (siehe Tabelle der Materialien). Legen Sie die Reaktion in den Thermocycler mit den folgenden Zyklus: Schritt 1, 95 ° C für 10 min; Schritt 2, 95 ° C für 15 s; Schritt 3 bei 60 ° C für 1 min; Schritt 4: wiederholen Sie die Schritte 2 – 3 40 Mal. Führen Sie alle PCRs in Triplicates und normalisieren Sie die Echtzeit-Daten in den β-Aktin-Ausdruck vor dem Plotten.

2. Western Blotting

Hinweis: Gesamte Zellextrakte wurden vorbereitet, indem man 250 µL 1 x Lyse Puffer, wie in Kesarwani beschrieben Et Al.¹³ mit einem Protease-Inhibitor cocktail und Phosphatase-Inhibitor cocktail 2 ergänzt.

1. Ernte 5 Millionen BaF3 Zellen über logarithmischen Phase (99 % lebendig) von behandelt (IL-3 und Imatinib) sowie aus unbehandelten BaF3 Zellen durch Zentrifugation bei 435 X g für 3 min bei 4 ° C. Lösen Sie die Zellen in der Lyse-Puffer (250 µL) durch Pipettieren nach oben und unten 1 X, gefolgt von einer 5 min Inkubation bei 80 ° C. Beschallen lysate zu brechen die DNA mit 5 – 6 Impulse von 5 s in einem Kühlraum bei 4 ° C.
2. Auf einem 1,5 mL-Tube übertragen Sie die lysate und Zentrifugieren Sie es bei 16.000 X g für 5 min, jegliches unlöslichen Material entfernen. Der Extrakt kann bei-80 ° C bis zum Gebrauch gespeichert werden. Hitze-Proben auf 80 ° C für 5 min in einem Heizblock vor dem Laden. Laden Sie 10 µL der Probe mit einer Gel-laden-Spitze auf 10 % SDS-PAGE Gel.
3. Lösen Sie die Proteine bei 150 V, bis der Referenz-Farbstoff den Boden des Gels erreicht. Übertragen Sie das Protein auf Nitrocellulose-Membranen durch eine elektrophoretische Übertragung bei 1 Ampere für 1 h. Nach der Übertragung blockieren die Membranen in 1 x Tris gepufferte Kochsalzlösung + 0,1 % Tween 20 (TBST) mit 5 % fettfreie Milch für 1 h und Sonde über Nacht bei 4 ° C mit der entsprechenden Antikörper bei einem 1:1,000 Verdünnung.
4. Waschen Sie die Membranen 3 X bis 5 X mit TBST für 10 min; dann, Sonde mit einem HRP-konjugierten geeignete sekundären Antikörper (1:5, 000 Verdünnung) bei Raumtemperatur für 1 h. TBST verwendet hängt die Größe des Containers. Achten Sie darauf, die Membran in TBST vollständig untertauchen. Waschen Sie den sekundären Antikörper 3 X 5 min mit TBST.
5. Den Fleck mit chemiluminescent Substrat Reagenz zu entwickeln. Gleiche Volumina des Substrats und der Puffer, aus zwei Flaschen, direkt vor dem Gebrauch zu mischen. Fügen Sie das Substrat an die Spitze der Membran zur Deckung der gesamten Membran mit einer 1-mL-Pipette und 1 min inkubieren. Die Flecken sollten innerhalb von 1 – 10 Minuten Zugabe des Substrates abgebildet werden.
6. Mit stumpfen Pinzette, legen Sie vorsichtig die Membran auf der Plattform des imaging Systems (siehe Tabelle der Materialien), viel von der Flüssigkeit zu vermeiden. Wählen Sie eine live-Ansicht und Flecken und Chemiluminiscence aus dem Menü. Mit manueller Übernahme, erwerben Sie Mehrfachbelichtungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Diese Dateien können visualisiert werden und quantifiziert mit imaging-Software.

3. Generation von Knockout-Mäusen

1. Überqueren Sie die c-Fos^fl/fl -Mäuse mit ROSACreERT2 Mäuse, ROSACreERT2c-Fos^fl/fl Mäuse¹³zu generieren. Erstellen Sie die Doppel-Knockout (KO)-Mäusen, züchten Sie ROSACreERT2c-Fos-^fl/fl -Mäuse mit Dusp1^{- / -} Mäuse, ROSACreERT2c-Fos^fl/fl Dusp1^{- / -} Mäusen¹³zu generieren. Genotyp gefolgt von PCR, die Mäuse von Tail-Clips, wie unten beschrieben.
2. Genotypisierung:
   1. Zur Vorbereitung der DNS, clip einen winzigen Teil des Hecks mit Schere und steckte es in eine 1,5 mL-Tube. Kauterisieren Sie das Heck mit beheizten Schere. Das abgeschnittene Heck im Rohr 200 µL 50 mM NaOH hinzu und bei 95 ° C in einem Hitze-Block für 1 h inkubieren.
   2. Wirbel der Schlauch gut und dann, durch Zugabe von 50 µL 1 M Tris-HCl pH 6,8 und Wirbel wieder neutralisieren. Zentrifugieren Sie das Rohr mit maximaler Geschwindigkeit für 1 min.
   3. PCRs 20 µL Reaktionen im 0,2 mL dünnwandiger PCR-Röhrchen mit 1 X Taq Polymerase master-Mix mit Farbstoff, 0,5 µM jede Grundierung, 1 µL DNA und Wasser führen. Legen Sie die Rohre in den Thermocycler und führen Sie die entsprechenden Zyklen wie in Tabelle 2dargestellt.
   4. Führen Sie das PCR-Produkt auf 2 % Agarosegel und Bild mit einem Gel-Dokumentationssystem.

4. Isolierung von c-Kit⁺ Zellen aus dem Knochenmark

1. Die Mäuse nach institutionellen Richtlinien zu opfern.
   Hinweis: Hier wurden die Mäuse zu Kohlendioxid (CO₂) an eine entsprechende ausgesetzt, der AVMA Durchflussrate empfohlen, bis Tod von der Einstellung der Atmung und Herzschlag festgestellt wurde, gefolgt von zervikale Dislokation.
2. Die Bein-Knochen von der Maus zu ernten – zwei Oberschenkelknochen, zwei Schienbeine, zwei Iliacs. Reinigen Sie alle Gewebe aus den Knochen durch Abkratzen entfernt mit einem Skalpell. Die Beinknochen in kalten 1 X PBS auf Eis gelegt – 5 mL in einer 15 mL Tube. Gießen Sie den Inhalt des Schlauches in einen Mörser geben und mit einem Stößel zerdrücken.
3. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein Sieb 70 µm Zelle in ein 50 mL-Schraubverschluss-Röhrchen mit einer 10 mL-Pipette verbunden, mit einer Pipette. Waschen Sie den Mörser und Stößel mehrfach mit kalten 1 X PBS, sammeln und die 50 mL-Tube Zellsuspension hinzufügen. Spin-down Knochenmark bei 1.200 X g bei 4 ° C für 5 min. Entfernen der Überstand über ein Vakuum mit einer Glaspipette befestigt. Unterbrechen Sie die Zelle Pellet in 5 mL 1 X PBS mit einer Pipette.
4. Mit einer Pipette langsam fügen angehaltenen Knochenmark nach oben von 5 mL der Raumtemperatur (die Temperatur ist entscheidend) Polysucrose, unter größter Sorgfalt nicht zu stören das Interface. Drehen Sie mit 400 X g bei Raumtemperatur für 20 min mit der Bremse ausgeschaltet.
5. Sammeln Sie die trübe Mono-Kern Ergebniszelle (TMNC) Schnittstelle mit einer Pipette und steckte es in eine neue 15 mL Tube. Bringen Sie die Lautstärke bis auf 10 mL mit 1 X PBS für die Wäsche, 20 µL zum zählen, und drehen sich mit 1.200 X g bei 4 ° C für 5 min. überstand verwerfen und speichern das Pellet auf Eis für Schritt 4.6.1.
6. Führen Sie c-Kit⁺ Zelle isoliert.
   1. Folgen einem Microbead-Kit-Protokoll für das c-Kit-⁺ Zelle isoliert. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 80 µL 1 X PBS + EDTA + BSA, 10⁷ Zellen. Die Zellsuspension fügen Sie 20 µL CD117 MicroBeads/10⁷ total Zellen hinzu. Mischen Sie gut durch aufschütteln und 10 min bei 4 ° c inkubieren Bringen Sie das Volumen bis zu 10 mL durch Zugabe von 1 x PBS + EDTA + BSA und Spin bei 1.200 X g bei 4 ° C für 5 Minuten.
   2. Den Überstand über ein Vakuum zu entfernen und die Zelle Pellet in 500 µL/10⁸ total Zellen in 1 X PBS + EDTA + BSA aussetzen. Mit dem Magnet-Stand mit der magnetischen Spalte angefügt, fügen Sie 3 mL 1 x PBS + EDTA + BSA und lassen Sie es über die Schwerkraft in eine 15 mL Sammelröhrchen durchfließen.
   3. Sobald der erste Puffer Zusatz durchlaufen die Spalte beendet hat, fügen Sie die Zellsuspension auf die Spalte, ermöglicht es, per Schwerkraft in das 15 mL Sammelröhrchen durchfließen. Dieses Passes ist der unerwünschte Zelle Teil.
   4. Waschen Sie die Spalte 3 Mal mit 3 mL 1 X PBS + EDTA + BSA jedes Mal ermöglicht es, per Schwerkraft in das Sammelröhrchen durchfließen. Entfernen Sie die Spalte aus der Magnet, und legen Sie auf den oberen Teil eine 15 mL-Tube.
   5. 5 mL 1 x PBS + EDTA + BSA und spülen Sie es sofort mit den Kolben mit der Spalte zur Verfügung gestellt. Entfernen Sie den Kolben zu, und wiederholen Sie den Flush mit einem zusätzlichen 5 mL 1 x PBS + EDTA + BSA. Zählen der Zellen in das Gesamtvolumen mit Standardmethoden.
   6. Spin-down der Zellen bei 1.200 X g bei 4 ° C für 5 min. Überstands entfernen und erneut das Pellet in kompletten IMDM (IMDM + 10 % FBS + IL-6 [10 ng/mL] mSCF [50 ng/mL] FLT3 Ligand [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) für die Kultur. Kultur, die diese Zellen in 2 x 10⁶ Zellen/1 mL Zelle IMDM komplette Medien über Nacht, indem man sie in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂.

(5) Transduktion

1. Retroviren Plasmid Transfektion
   1. Tauen Sie frisch HEK293 Zellen am Nachmittag zuvor in einem Wasserbad auf 37 ° c eingestellt Drehen Sie die Cryotube mit der HEK Zellen bei 435 X g bei Raumtemperatur für 3 min. Entfernen der Überstand über ein Vakuum und Aussetzen der Zelle Pellet in 1 mL DMEM mit 10 % ergänzt FBS, Penicillin, Streptomycin und Glutamin.
   2. Zählen der Zellen und eine 10 cm behandelt Teller (~ 4 x 10⁶ HEK293T Zellen) das entsprechende Volume hinzufügen. Das Gericht 14 mL DMEM 10 Medien hinzu und mischen Sie es gut durch Verschieben nach oben und unten für eine gleichmäßige Verteilung. Legen Sie das Gericht in einem 37 ° C, 5 % CO₂ Inkubator über Nacht.
   3. Am nächsten Morgen, überprüfen Sie den Zusammenfluss der Zellen unter einen invertierten Lichtmikroskop (50 % oder mehr funktioniert gut).
   4. Kombinieren Sie die DNA (gewünschte retrovirale Plasmid), PclEco (Packaging Plasmid), 2 M CaCl₂und H₂0 in einer 1,5 mL Tube (= 500 µL) mit einer Mikropipette in folgender Höhe: 7,5 µg DNA (BCR-ABL1-YFP) 7,5 µg pCLeco, 62 µL 2 M CaCl₂ , und Wasser zu einem Endvolumen von 500 µL. hinzufügen 500 µL von 2 X HBS, eine weitere 1,5 mL-Tube.
   5. Fügen Sie die DNA mischen tropfenweise auf die 1,5 mL Röhrchen mit 500 µL 2 X HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES und 1,5 mM Na₂HPO₄) beim Mischen. Erreichen Sie dies zu, indem Sie einen Wirbel auf die niedrigste Geschwindigkeit und zum ständigen mischen beim Hinzufügen des Transfektion Mix festhalten Sie das HBS-Rohr.
   6. Lassen Sie die Transfektion Mischung für 20-30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Während der Inkubation der HEK Zellen 25 nM Chloroquin hinzu, und legen Sie sie wieder in den Inkubator. Fügen Sie nach der Inkubation die Transfektion Mischung tropfenweise die HEK Zellen hinzu und dann wirbeln Sie sanft die Medien um die Transfektion Mischung in die Platte zu mischen.
   7. Inkubieren Sie die Zellen mit der Mischung für ca. 8 h in einem 37 ° C, 5 % CO₂ Inkubator. Ändern Sie die Medien auf diese Zellen, indem sehr langsam Hinzufügen von 14 mL frische DMEM 10 Medien. Pipettieren langsam gegen die Wand der Schale verhindert, dass jede Abisolieren der HEK Zellen. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO₂ Inkubator.
   8. Sammeln des viralen Überstands mit einer 10 mL Spritze, den Überstand in die Spritze ziehen und befestigen Sie die Spritze Filter 0,45 µm. Eine neue Kollektion-Röhre stürzen Sie den viralen überstand. Nehmen Sie die erste Kollektion von viralen überstand ~ 16 h später.
2. Fibronektin virale Konzentration und Transduktion
   1. Unbehandelte 6-Well Kultur Platten 2 mL einer 0,1 mg rekombinantem menschlichen Fibronektin Fragment in 1 X PBS hinzufügen. Bereiten Sie so viel Fibronektin Bedarf, die abhängig von der Anzahl der Zellen und Genotypen. Man kann gut genug transduzieren 10 Millionen c-Kit⁺ -Zellen. Die Platte über Nacht bei 4 ° c inkubieren
   2. Am nächsten Tag entfernen der Fibronektin aus den Brunnen mit einer Pipette, Pipette 2 mL steril 2 % BSA in 1 X PBS blockieren die Platte und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Die BSA über ein Vakuum und waschen Sie gründlich durch Pipettieren 2 mL 1 X PBS dann entfernen sie über ein Vakuum.
   3. Fügen Sie sofort frisch gesammelt und gefiltert (bei 0,45 µm) virale überstand bis zu 5 mL. Zentrifugieren Sie bei 435 X g bei 32 ° C für 2 h. Entfernen der Überstand über ein Vakuum und wiederholen Sie diesen Schritt mit zusätzlichen frisch gesammelten virale überstand und wieder drehen. Der Überstand über ein Vakuum zu entfernen und die Brunnen durch Zugabe von 2 mL 1 X PBS waschen; dann entfernen Sie es über ein Vakuum.
   4. Fügen Sie die c-Kit⁺ -Maus Zellen, dass kultivierten Übernachtung (Schritt 4.6.6) in die virale beschichteten Vertiefungen durch die Zellsuspensionen gut mischen und sie in die jetzt-virale konzentrierte Fibronektin-Platte pipettieren. Schleudern Sie bei 1.200 X g bei 25 ° C 90 min. habe die Zellen in einem 37 ° C, 5 % CO₂ Inkubator.
   5. 48 h Posttransduction, pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 1.200 X g bei 4 ° C für 5 min und sie in FACS Puffer #1 (1 X PBS + 0,5 % BSA), 6 x 10⁶/mL aufzuwirbeln. Bestimmen Sie den Anteil der BCR-ABL1 positive Zellen durch Messung der Anteil der YFP positiv mit Durchflusszytometrie.
   6. Veranstaltungen mit dem standard-Verfahren zu erwerben. Erstes Tor der lebenden Zellen basierend auf vorderen und seitlichen streuen. Dann Tor YFP positive Leben Zellen mit Ausnahme der YFP-Negativecells von negativ-Kontrolle (Abbildung 4) bestimmt.

6. koloniebildenden UnitAssays

1. Tauen Sie die Methylcellulose mit Zytokinen für Maus bei Raumtemperatur für 1 – 2 h. aliquoten 3 mL Methylcellulose in ein FACS-Rohr mit einer 5 mL Spritze ohne Nadel. Sortieren Sie die YFP-positiven Zellen auf einen Cell Sorter.
2. Die Zellen Spin-down und das Pellet in IMDM komplette Medien auszusetzen. Zählen der Zellen werden vergoldet und verdünnen sie um 5.000 YFP-positiven Zellen in 100 µL IMDM komplette Medien zu erhalten.
3. Hinzufügen von 100 µL Zellsuspension mit 5.000 YFP-positiven Zellen und die geeignetsten Inhibitoren bis 3 mL von Methylcellulose (siehe Tabelle der Materialien). Wirbel auf hoch, um es für 10-30 s mischen.
4. Verwenden Sie nachdem die meisten der Luft, die Bläschen entgangen sind eine 1 mL Spritze, 1 mL der Medien in drei replizieren 3 cm Platten Teller durch Auswerfen der Medien auf der einen Seite und langsam kippen der Platte in einer Kreisbewegung, gleichmäßig zu verteilen.
5. Die Endkonzentration der Inhibitoren verwenden sind Imatinib bei 3 µM, DFC bei 0,2 µM und BCI bei 0,5 µM, allein oder in Kombinationen. Wo es zweckdienlich ist, löschen Sie c-Fos durch Ausplattieren der Zellen mit 4-Hydroxytamoxifen (1 µg/mL) hinzugefügt, um die Methylcellulose.
6. Nach der Beschichtung, setzen Sie die Platten in einer großen Petrischale mit eine offene Schale mit 2 mL steriles Wasser in der Mitte. Der große Petrischale zu decken und sorgfältig bei 37 ° C, 5 % CO₂ Inkubator inkubieren. Notieren Sie die Kolonie Zahlen nach einer Woche der Beschichtung durch die Gesamtzahl der Kolonien unter dem Mikroskop zählen.
7. Ein paar Kolonien von geeigneten Platten für c-Fos Löschung durch PCR zu analysieren. Sammeln Sie die Kolonien durch das Saugen sie mit einem P1000-Spitze. Die Zellen in 500 µL 1 X PBS durch Waschen der Spitze in die PBS mehrmals zu verdrängen. Zellsuspensionen bei 6.000 X g für 1 min drehen und die DNA aus der Zelle Pellet mit einem genomische DNA Isolierungskit extrahieren.
8. Verwenden Sie die genomische DNA für die PCR unter Verwendung der Primer mFos-FP3 und mFos-RP5, wie in Tabelle 2beschrieben. Analysieren Sie die PCR-Produkte auf einen 2 % Agarosegel und ein Bild mit einem Gel-Dokumentationssystem.
9. Färben Sie für eine grafische Darstellung der Kolonien die Kolonien, mit Iodonitrotetrazolium-Chlorid. Lösen Sie 10 mg von Iodonitrotetrazolium Chlorid in 10 mL Wasser, 1 mg/mL Lösung zu erhalten. Filter zu sterilisieren die Lösung mit einem Luer Lock mit einem 0,2 µm-Filter mit einer 10 mL Spritze unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekultur Haube verbunden.
10. Fügen Sie in der Gewebekultur Kapuze 100 µL der Färbelösung tropfenweise um die KBE-Platte; Achten Sie darauf, nicht zu rutschen oder Kolonien zu stören. Inkubieren Sie die Platten über Nacht in einem 37 ° C, 5 % CO₂ Zelle Kultur Inkubator. Die Kolonien werden dunkel rötlich braun. Mit einem weißen Hintergrund in der sterilen Gewebekultur-Haube, fotografieren Sie die gefärbten KBE-Platte.

(7) Transplantation und Sterblichkeit Assay

1. Letal bestrahlen die Mäuse mit Split-Strahlung mit einem 137 Cs-basierte Gamma-Ray in einer Dosierung von 7,0 Gy gefolgt von 4,75 Gy (0,5 Gy/min), 3 h vor der Transplantation.
2. Transplant 4 x 10⁴ unsortiert YFP-positiv (berechnet anhand der Prozentsatz der YFP) Zellen mit 3 x 10⁵ normalen Knochenmarkzellen als Träger in jeder Maus durch Schweif Vene Injektion.
3. Bestimmen Sie nach einer Woche der Transplantation das Engraftment durch die YFP-positiven Zellen aus dem peripheren Blut mit FACS Analyse.
4. Durchführen Sie eine Rute Ader bluten und FACS Analyse.
   1. Wärmen Sie den Käfig von Mäusen unter einer Wärmelampe mit Vorsicht nicht zu überhitzen oder zu verbrennen.
   2. Eine Maus in eine Maus Restrainer zurückhalten und nick die Rute Vene mit einer sterilen Klinge. Melken Sie sanft die Rute von anterior Posterior, so dass einen Blutstropfen zu akkumulieren. Das Blut mit einer heparinisierten Kapillare zu sammeln, bis sie gefüllt ist (sammeln um 75-100 µL). Eine Blut-Sammelrohr mit EDTA Blut aus der gefüllten Kapillare eintauchen und gut mischen.
   3. Lyse der Erythrozyten durch Zugabe von 30 – 40 µL Blut auf 3 mL 1 X RBC Lyse Puffer (Ammoniumchlorid 150 mM, 10 mM Kaliumbicarbonat und 0,13 mM EDTA). Mischen Sie gut, Umkehrung der Röhre mehrere Male. Inkubation bei Raumtemperatur für 10 – 15 min. Spin bei 1.200 X g bei 4 ° C für 5 min. Entfernen der Überstand über ein Vakuum und das Pellet in 2 mL 1 X PBS für einen Waschgang auszusetzen.
   4. Schleudern bei 1.200 X g bei 4 ° C für 5 min. Überstands entfernen und hängen Sie es im FACS Puffer #1. FACS-Analyse durchführen Sie, wie oben beschrieben in Schritt 5.2.5–5.2.66. Kurzfristige Geschäft das restliche Blut in das Sammelröhrchen, die für verschiedene andere Zwecke, bei 4 ° c einsetzbar
5. Transplantierten Mäusen, die 10-40 % YFP-positiven Zellen im peripheren Blut zeigten wurden für das Experiment verwendet. Mäuse, die weniger als 2 % der YFP-positiven Zellen wurden aus der Studie ausgeschlossen.
6. Bereiten Sie Tamoxifen 20 mg/ml in Mais-Öl bei 60 ° C mit intermittierenden vortexen bis vollständig gelöst, und für die Dauer der Behandlung bei 4 ° C im Dunkeln zu speichern. Nach einer Woche der Transplantation, löschen das c-Fos^fl/fl -Allel von Tamoxifen (100 mg/kg in Maisöl) intraperitoneale Injektion (i.p.) in den Mäusen täglich an drei aufeinander folgenden Tagen. Es ist wichtig, dass die Mäuse gewogen werden, um festzustellen, wieviel Tamoxifen zu injizieren. Nach der Tamoxifen-Behandlung (gegebenenfalls) die Mäuse für medikamentöse Behandlungen-Gruppe (n = 5/Gruppe).
7. Überwachen Sie die Mäuse für Leukämie Fortschreiten und das Überleben und bestimmen Sie die leukämischen Belastung (YFP-positiven Zellen durch FACS) wöchentlich bis zu acht Wochen überleben Mäuse zu.
8. Analysieren Sie das Blut für die c-Fos-Löschung, wo es zweckdienlich ist, wie oben in Abschnitt 6 beschrieben. Notieren Sie die Anzahl der Überlebenden Mäuse täglich und zeichnen Sie die überleben Kurve am Ende des Experiments mit einem Grafik-Software.

(8) transgenen Mäusen Modell der BCR-ABL1 Leukämie

1. LSK-Isolierung
   1. Pflegen Sie die Scl-tTA transgene Mäuse auf Doxycyclin Chow, Ausdruck der BCR-ABL1 zu verhindern. Nehmen Sie vier Wochen vor der Transplantation, die Mäuse aus der Doxycyclin Chow für BCR-ABL1 Ausdruck.
   2. TMNCs von Scl-tTA transgenen Mäusen isolieren, wie oben in Abschnitt 4 beschrieben. Aussetzen der TMNCs im FACS Puffer #2 (1 X PBS + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA), 10⁶ Zellen/mL zu erhalten.
   3. Zum Abbau der TMNCs für Geschlecht-positiven Zellen durch Zugabe von 10 µL Abstammung Zelle Erkennung cocktail Biotin (Biotin-konjugierten monoklonalen Antikörpern gegen CD5 [Ratte IgG2a], CD11b [Ratte IgG2a], CD45R [B220] [Ratte IgG2a], Anti-7-4 [Ratte IgG2a], Anti-Gr-1 [Ly-6G/C, Ratte IgG2a] und Anti-Ter-119 [Ratte IgG2b]) pro 1 x 10⁶ Zellen. Inkubieren Sie die Zellen bei 4 ° C für 10 min in der Dunkelheit, gefolgt von einem waschen mit 5 mL FACS Puffer #2, und drehen sich mit 1.200 X g bei 4 ° C für 5 min. Aspirat überstand vollständig und Aussetzen der Zellen in 400 µL FACS Puffer #2.
   4. Hinzufügen von 5 µL Anti-Biotin Antikörper-FITC-Konjugat, 1,2 µL Ly-6A/E (Sca1) PECy7 und 2,4 µL CD117 (c-Kit) APC Antikörper für bis zu 10⁸ Millionen Zellen. Inkubieren im Dunkeln bei Raumtemperatur für 10 min. Waschen, indem man das Volumen bis zu 5 mL mit FACS Puffer #2; Anschließend Zentrifugieren bei 1.200 X g bei 4 ° C für 5 min. Überstands entfernen und Aussetzen der Zelle Pellet in 500 µL Puffer FACS #2.
   5. Filtern Sie die Zellsuspension in einem blauen Filterkappe FACS Rohr.
   6. Tor lebenden Zellen mit vorwärts- und seitliche Streuung. Wählen Sie dann die Lin^– -Zellen, die MFI zeigte (bedeuten Fluoreszenzintensität von weniger als 10²) LSK zu Zellen, c-Kit⁺ und Sca1⁺ auf einem Biexponential Grundstück von der übergeordneten Lin^– und sortieren (Abbildung 7 C).
   7. Die sortierten Zellen zu sammeln und sie bei 1.200 X g bei 4 ° C für 5 min zentrifugieren.
2. Transplantation
   1. Letal bestrahlen Sie die BoyJ Mäuse mit einem Split-Strahlendosis von 7,0 Gy gefolgt von 4,75 Gy nach 3 h vor der Transplantation.
   2. Injizieren Sie 3 x 10³ , 5 x 10³ BCR-ABL1-LSK Zellen mit 0,3 x 10⁶ Helfer Knochenmarkzellen von WT BoyJ Mäusen über Heck Vene (i.v.) in den bestrahlten Mäusen BoyJ.
   3. Vier Wochen Posttransplantation, analysieren die Empfänger Mäuse für CD45.1 und CD45.2. Erhalten Sie die TMNC aus dem peripheren Blut durch Rute Vene Blutungen, wie unter Punkt 7.4 beschrieben. Die Zellen in 100 µL Puffer FACS aufzuwirbeln. Inkubation der Zellen mit 1 µL der CD45.1-FITC und CD45.2-PE Antikörper bei Raumtemperatur für 1 h.
   4. Waschen Sie die Zellen, indem er herauf das Volumen bis 3 mL mit FACS-Puffer und drehen Sie sich mit 1.200 X g bei 4 ° C für 5 min. Überstands zu entfernen und in 200 µL 1 X PBS aufzuwirbeln.
   5. Analysieren Sie den Anteil an CD45.1 und CD45.2 von ersten Anspritzung der lebenden Zellen basierend auf vorderen und seitlichen streuen, gefolgt von Anspritzung FITC - und PE-positiven Zellen basierend auf die ungefärbten Probe.
   6. Gruppieren Sie die Mäuse in vier Gruppen (n = 6 pro Gruppe). Beginnen Sie die Behandlung mit Imatinib (75 mg/kg 2 x tägl.) allein und in Kombination mit DFC + BCI (beide Medikamente erhielten bei einer Dosis von 10 mg/kg 2 x täglich).
   7. Ebenso zu behandeln, andere Gruppen mit Kombinationen von Imatinib (75 mg/kg) + Curcumin (150 mg/kg) + BCI (10 mg/kg), BCI (10 mg/kg) und Imatinib (75 mg/kg) + NDGA (100 mg/kg) für drei Monate, 2 x pro Tag, durch eingespritzte i.p.
   8. Analysieren Sie die Mäuse 1 x im Monat für sechs Monate für leukämischen Chimerism durch die Bestimmung des Prozentsatz der CD45.2 positive Zellen im peripheren Blut Schwanz Vene Blutungen, wie beschrieben in Schritt 7.4.

9. in Vivo Evaluation von BCI und DFC-Aktivität

1. Phospho-p38-Analyse
   1. Nehmen Sie drei leukämischen Mäusen (8 – 12 Wochen alt), die mit BCR-ABL1 mit dem Ausdruck c-Kit⁺ Zellen transplantiert wurden, wie in Abschnitt 7 beschrieben. Spritzen Sie die Mäuse mit BCI (10 mg/kg) durch die Injektion i.p vier Wochen Posttransplant.
   2. Messen Sie die Ebenen des peripheren Blutes Phospho-p38 TMNC mit dem Phosphorylierung Flow Cytometry Kit gemäß den Anweisungen des Lieferanten. Sammeln Sie das Blut von jeder Maus vor und 6 Stunden nach der Injektion von Drogen. Isolieren Sie die TMNCs von RBC Erschöpfung und beheben sie wie folgt.
   3. 4 mL RBC Lyse Lösung pro 100 µL des peripheren Blutes hinzugeben. Mischen Sie und inkubieren Sie auf Eis für 5 min zur lyse der Erythrozyten. Spin-down der Zellen bei 1.200 X g für 5 min bei 4 ° C und den Überstand zu entfernen. Wiederholen Sie die Lyse 1 x mehr.
   4. Waschen Sie nach dem zweiten Schritt der Lyse der Zelle Pellets mit 1 mL 2 % BSA in PBS. Die Zellen durch Zugabe von 100 µL der Fixierung und Permeabilisierung Lösungen zu beheben und 20 min bei 4 ° C im Dunkeln inkubieren. Pellet-die Zelle durch Zentrifugation bei 1.200 X g für 5 min bei 4 ° C.
   5. Waschen Sie die Pellets mit 1 mL 1 x Permeabilisierung waschen. Blockieren der Zellen durch Zugabe von 300 µL 2 % BSA in Permeabilisierung Waschpuffer bei Raumtemperatur für 20 min. teilen sich die Zellen in drei gleiche Aliquote von 100 µL (~ 1 X10⁶).
   6. Jedes aliquoten festen Zellen bzw. 1 µL total p-38 Antikörper, 1 µL Antikörper Phospho-p38 oder 1 µL Isotype IgG-Steuerelement hinzufügen und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
   7. Waschen Sie die Zellen 1 X mit 5 mL 2 % BSA mit PBS-Puffer und mit Sekundärantikörper (1 µL Alexa Fluor-488 konjugiert) für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Zellen 1 x erneut und in 200 µL 1 X PBS auszusetzen.
   8. Erfassen der Daten durch FACS und analysieren sie durch Flow-Zytometrie-Analyse-Software.
   9. Abziehen der MFI des Kontrollstreifens IgG aus dem MFI der experimentellen Proben. Die MFI-Werte des Phospho-p38 werden dann mit der insgesamt 38, die Phospho-p38 Ebenen bestimmen, nach der BCI-Injektion normalisiert.
2. Quantitative gen Expressionsanalyse von c-Fos Zielgene
   1. Nehmen Sie drei leukämischen Mäusen (8 – 12 Wochen alt), die mit BCR-ABL1 mit dem Ausdruck c-Kit⁺ Zellen wie in Abschnitt 7 beschrieben transplantiert wurden. Periphere Blut von jedem Mausklick sammeln und dann die Mäuse mit 10 mg/kg jeden DFC + BCI zu injizieren.
   2. Sammeln Sie das periphere Blut 6 h nach der Injektion von Drogen. TMNCs durch RBC Erschöpfung, isolieren, wie oben beschrieben. Pellet-die TMNCs und hängen Sie sie in einem Phenol-basierte Lyse-Puffer (siehe Tabelle der Materialien).
   3. RT-qPCR-Analyse (wie in Abschnitt 1 beschrieben) für Bcl2l11, Lif und IL-6 mit Gen-spezifische Primer (siehe Tabelle 1) durchführen.

10. langfristige Kultur initiieren Zelle Assay

Hinweis: Ein LTCIC Test wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben,²⁵.

1. Wachsen Sie eine Maus Fibroblasten Zelllinie MS-5 in MEMα zur Konfluenz in einem T175 Gewebekultur Kolben. Trypsinize die Zellen wie oben beschrieben für HEK293T. Unterbrechen Sie die Zellen in MEMα bei 2 x 10⁶ Zellen/mL. 10 x 10⁶ Zellen in einem 50 mL konische Rohr nehmen und bei 80 Gy zu bestrahlen. Verdünnen Sie die Zellen auf 0,5 x 10⁶ Zellen/mL in MEMα mit 10 % FBS (M10) Medien ergänzt. Platte 2 mL pro Bohrloch in einer 12-Well-Platte und inkubieren Sie es in einem 37 ° C, 5 % CO₂ Inkubator über Nacht.
2. Am nächsten Tag bereiten Sie die Hydrocortison-Natrium-Hemisuccinate durch auflösen 2,5 mg in 5 mL MEMα (1 M Lösung). Sterilisieren Sie Filter-die Hydrocortison-Lösung mit einem 0,2 µm Spritze Filter in Biosafety Haube. Verdünnen Sie die Hydrocortison durch serielle Verdünnung in MEM eine 100 µM-Lösung zu erhalten. 25 mL der menschlichen langfristige Kulturmedium (HLTM) 250 µL dieses hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien) kurz vor, um eine Endkonzentration von 1 µM zu erreichen,.
3. Spin-down der CML-CD34⁺ und UCP3 TMNCs auszusetzen in der HLTM von kurz aufschütteln und die Grafen von einer Hemocytometer zu bestimmen.
4. Staubsauger aus der M10-Medien aus der 12-Well-Platte mit Stroma Zellen ausgesät und ersetzen Sie es mit 1 mL Patienten Zelle (CML-CD34⁺ [10.000] und UCP3 TMNCs [1 x 10⁶]) Aussetzung in HLTM. Verwenden Sie drei Brunnen pro Arzneimittelkombination pro Zelltyp.
5. Verdünnen Sie die Drogen-Bestände auf 2 X der erforderlichen Konzentration im HLTM. Fügen Sie 1 mL der Medien mit Drogen zu den oben genannten Zellen, ein 1 X Wirkstoffkonzentration zu erhalten. Ersetzen Sie die Hälfte der Medien mit frisch zubereiteten HLTM jede Woche fünf Wochen lang.
6. Am Ende der Frist von sechs Wochen LTC-IC-Assay sammeln Sie nonadherent Zellen in ein Rohr aus der Kulturen. Adhärente Zellen trypsinize und kombinieren sie mit den entsprechenden nonadherent Zellen.
7. Waschen Sie die Zellen und Assay für KBE in Methylcellulose mittlere enthält 30 % fetalen Kälberserum, Erythropoetin (3 Einheiten/mL), SF (50 ng/mL) und IL-3(20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL), G-CSF (20 ng/mL) und Granulozyten/Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) (20 ng / mL). die Grafen von einer Hemocytometer zu bestimmen.
8. Platte 5 x 10⁴ Zellen in drei Wiederholungen. Frieren Sie die restlichen Zellen in 20 % FBS und 10 % DMSO. Ordnen Sie die Platten in einer großen Petrischale mit eine offene Schale mit Wasser in der Mitte. Decken Sie der große Petrischale sorgfältig ab und inkubieren Sie es in einem 37 ° C, 5 % CO₂ Inkubator für zwei Wochen.
9. Zwei Wochen später die Kolonien der Gäste. In einigen Fällen ist nur ein Teil der Ernte für KBE untersucht). Berechnen Sie die Gesamtzahl der LTCIC im ersten Zellsuspension durch Extrapolation der KBE gewonnenen Bestandteil der Zellernte zugrunde. Die durchschnittliche Leistung der KBE pro LTC-IC ist 8.
   Hinweis: Zum Beispiel wenn zunächst 1 x 10⁶ Zellen in einen Brunnen, nach fünf Wochen überzogen waren 0,5 x 10⁶ Zellen geerntet wurden, KBE, 5 x 10⁴ Zellen waren vergoldet und 50 KBE stammen. Dies entspricht 500 KBE/1 million versilberte Zellen. Teilen Sie diese Zahl durch 8 die LTCIC raus was ist 62,5.

11. humanisierten Mausmodell mit CML CD34 Zellen⁺

1. Sublethally bestrahlen die 8 Wochen alten NOD scid Gamma Mäuse, mit dem Ausdruck menschlicher IL3, GM-CSF und SCF (NSGS) mit einer Einzeldosis von 7,0 Gy (700 rads) mit 50 rads/min.
2. 3 x 10⁶ CD34 injizieren⁺ markierte Zellen von BCR-ABL1-positiven CML chronische Phase Patienten in den bestrahlten Mäusen durch intravenöse Injektion.
3. Bestimmen Sie nach zwei Wochen der Transplantation leukämischen Engraftment im Knochenmark durch Verwendung von Maus und Mensch-spezifische Antikörper gegen CD45 FACS.
4. Durchführen Sie eine FACS-Analyse.
   1. Nehmen Sie das Knochenmark Absaugen aus den Oberschenkelknochen von transplantierten Mäusen. Lyse von Erythrozyten mit RBC Lyse Puffer, wie oben beschrieben und sammeln Sie die TMNCs durch Zentrifugation. Waschen Sie die Tablette 1 X mit kalten 1 X PBS.
   2. Blockieren Sie die Zellen mit dem menschlichen FcR sperren und Maus FcR gefolgt von Färbungen mit Anti-Human CD45 FITC und Anti-Maus CD45 APC^Cy7 über Nacht bei 4 ° C. Führen Sie die FACS-Analyse auf LSRII und analysieren Sie die Daten mithilfe von Flow-Zytometrie-Analyse-Software.
5. Gruppieren Sie die Mäuse in vier verschiedenen Kohorten (n = 6/Gruppe) für die Behandlung mit Fahrzeug, Imatinib (75 mg/kg), DFC BCI (sowohl bei 10 mg/kg), oder Imatinib (75 mg/kg) DFC + BCI (beide bei 10 mg/kg). Verdünnen Sie die Lager Drogen mit 1 X PBS-Puffer (Fahrzeug) und verwalten sie durch Injektion von ihnen i.p. 2 x täglich.
6. Behandeln Sie die Mäuse für sechs Wochen zu und bestimmen Sie die leukämischen Last alle zwei Wochen, bis zu acht Woche nach der Transplantation zu, wie oben beschrieben in 11.4.

Ergebnisse

Onkogen sucht hat bei der therapeutischen Wirksamkeit von TKIs verwickelt. Allerdings sind die Mechanismen, die fahren der Onkogen Abhängigkeit nicht verstanden. Wir führten mehrere unvoreingenommene Genexpressionsanalysen um die genetische Komponente beteiligt orchestrieren die sucht zu identifizieren. Diese Analysen ergaben die Hochregulation von drei Genen, c-Fos, Dusp1 und Zfp36, in Krebszellen, die sind nicht abhängig von onkogenen Signalisierung für überleben und sind daher une...

Diskussion

Für den Großteil der Krebszellen ist die therapeutische Reaktion zu TKI durch eine Blockade der Tyrosin-Kinase-Oncoprotein Signale vermittelt, bei denen der Tumor süchtig ist. Jedoch ist relativ wenig bekannt über wie eine Minderheit von Krebszellen, die einen Beitrag zur MRD escape das Onkogen Abhängigkeit und Therapie⁴. Neuere Studien gezeigt, dass Wachstumsfaktor Signalisierung Resistenzen in Leukämie und solide Orgel Tumoren vermittelt. Dies deutet darauf hin, dass verschiedene molekular...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Materials
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment	Takara	T100B
MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU)	Stem Cell	3434
MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU)	Stem Cell	4434
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	H6278
Recombinant Murine SCF	Prospec	CYT-275
Recombinant Murine Flt3-Ligand	Prospec	CYT-340
Recombinant Murine IL-6	Prospec	CYT-350
Recombinant Murine IL-7	Peprotech	217-17
DFC	LKT Laboratories Inc.	D3420
BCI	Chemzon Scientific	NZ-06-195
Imatinib	LC Laboratory	I-5508
Curcumin	Sigma	458-37-7
NDGA	Sigma	500-38-9
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biological	S11150
Trypsin EDTA 1x	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamine	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL stock in water
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
HEPES	Sigma	H7006
Na2HPO4.7H2O	Sigma	S9390
Protamine sulfate	Sigma	P3369	5 mg/mL stock in water
Trypan Blue solution (0.4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
WST-1	Roche	11644807001
0.45 μM acro disc filter	PALL	2016-10
70 μm nylon cell stariner	Becton Dickinson	352350
FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)	Simga	1083
PBS	Corning	21040CV
LS Columns	Miltenyi	130-042-401
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	CO-RO
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5762
Nitrocullulose Membrane	Bio-Rad	1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)	Thermo Scientific	34075
CD5	eBioscience	13-0051-82
CD11b	eBioscience	13-0112-75
CD45R (B220)	BD biosciences	553092
CD45.1-FITC	eBioscience	11-0453-85
CD45.2-PE	eBioscience	12-0454-83
hCD45-FITC	BD Biosciences	555482
Anti-Biotin-FITC	Miltenyi	130-090-857
Anti-7-4	eBioscience	MA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)	eBioscience	13-5931-82
Anti-Ter-119	eBioscience	13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7	BD	558612
CD117 APC	BD	553356
BD Pharm Lyse	BD	555899
BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution)	BD	554714
BD Perm/Wash  (permeabilization and wash solution for phospho flow)	BD	554723
phospho p38	Cell Signaling Technologies	4511S
total p38	Cell Signaling Technologies	9212
Mouse IgG control	BD	554121
Alexa Flour 488 conjugated	Invitrogen	A-11034
Calcium Chloride	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
EDTA	Ambion	AM9261
BSA	Sigma	A7906
Blood Capillary Tubes	Fisher	22-260-950
Blood Collection Tube	Giene Bio-One	450480
Newborn Calf Serum	Atlanta biological	S11295
Erythropoiein	Amgen	5513-267-10
human SCF	Prospec	CYT-255
Human IL-3	Prospec	CYT-210
G-SCF	Prospec	CYT-220
GM-CSF	Prospec	CYT-221
MyeloCult (media for LTCIC assay)	Stem Cell Technologies	5100
Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate	Stem Cell Technologies	7904
MEM alpha	Gibco	12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortor pestle	Coor tek	60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicillin	Sigma	A0166	100 mg/mL stock in water
Bacto agar (agar)	Difco	214050
Terrific broth	Becton Dickinson	243820
Agarose	Genemate	E-3119-500
Doxycycline chow	TestDiet.com	52662	modified RMH1500, Autoclavable 5LK8  with 0.0625% Doxycycline
Tamoxifen	Sigma	T5648
Iodonitrotetrazolium chloride	Sigma	I10406
Kits
Dneasy Blood & tissue kit	Qiagen	69506
GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)	Promega	M1722
miRNeasy Mini Kit  (RNA isolation kit)	Qiagen	217084
DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR)	Ambion, Life Technologies	AM1906
Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis)	Invitrogen	18080051
SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR)	Bio-Rad	1725270
CD117 MicroBead Kit	Miltenyi	130-091-224
Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay	Stemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator	Thermo scientific
Swing bucket rotor cetrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 automated cell counter	Bio-RAD
C-1000 Thermal cycler	Bio-RAD
Mastercycler Real Plex 2	Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots)	Bio-RAD	17001401
Hemavet (boold counter)	Drew-Scientific
LSR II (FACS analyzer)	BD
Fortessa I (FACS analyzer)	BD
FACSAriaII (FACS Sorter)	BD
Magnet Stand	Miltenyi
Irradiator	J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA	Mark I Model 68A	source Cs 137
Mice
ROSACreERT2	Jackson Laboratory
Scl-tTA	Dr. Claudia Huettner’s lab
BoyJ	mouse core facility at CCHMC
C57Bl/6	Jackson Laboratory
NSGS	mouse core facility at CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-	Made in house
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Made in house
Cells
BaF3	Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHI	Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ and Normal CD34+ cells	University Hospital, University of Cincinnati