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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Salmonella SPP /Shigella spp. sind häufige Erreger Durchfall zugeschrieben. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp., mittels Real-Time PCR kombiniert mit geführten Kultur.

Zusammenfassung

Fäkal-orale Übertragung von akuter Gastroenteritis tritt von Zeit zu Zeit, vor allem, wenn Menschen, die Nahrung und Wasser behandelt von Salmonella spp./Shigella SPP infiziert sind Die Goldstandard-Methode zum Nachweis von Salmonella spp./Shigella SPP ist direkte Kultur, aber das ist arbeitsintensiv und zeitaufwändig. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Plattform für Salmonella spp./Shigella spp., screening, mittels Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kombiniert mit geführten Kultur. Es gibt zwei wichtige Phasen: Real-Time PCR und die geführte Kultur. Für die erste Stufe (Real-Time PCR) Wir erklären jeden Schritt der Methode: Sammlung, Voranreicherung, DNA-Extraktion und Real-Time PCR zu probieren. Wenn das Real-Time PCR-Ergebnis positiv ist, dann die zweite Stufe (geführte Kultur erfolgt): selektive Kultur, biochemische Identifizierung und serologischen Charakterisierung. Wir zeigen auch repräsentative Ergebnisse daraus generiert. Das hier beschriebene Protokoll wäre eine wertvolle Plattform für die schnelle, konkrete, sensible und Hochdurchsatz-Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Einleitung

Durchfall ist immer noch ein häufiges Gesundheitsproblem mit einer hohen Inzidenz bewerten weltweit1,2. Obwohl die Sterblichkeit relativ niedrig ist, einige Patienten zeigen verschiedene Symptome wochenlang (z. B. lose und wässrige Stühle, dringend auf die Toilette gehen), die machen die sozioökonomischen Auswirkungen sehr hoch3,4. Noch gravierender ist, können einige Patienten sogar Reizdarm-Syndrom entwickeln, bleibt unbehandelt5. Es gibt verschiedene Arten von Bakterien, Viren und Parasiten, die Durchfall6verursachen können. Salmonella SPP /Shigella spp. gehören zu den häufigsten Bakterien für die Übertragung von akuter Gastroenteritis7,8,9,10,11. Daher haben viele Landkreise veröffentlicht, Gesetze oder Verordnungen für regelmäßige Salmonella SPP /Shigella spp. screening unter Menschen, die Nahrung und Wasser umgehen würden. Zum Beispiel haben die chinesische Regierung erließ Gesetze für obligatorische Salmonella SPP /Shigella spp. screening jährlich.

Der Gold-Standard-Methode für Salmonella SPP /Shigella spp. Erkennung ist Bakterienkultur. Durch Bakterienkultur und aufeinander folgenden biochemische Identifizierung und serologischen Charakterisierung identifizieren wir die Spezies von Bakterien, die das Krankheitsmanagement Ausbruch und antimikrobielle profiling zur Unterstützung der Behandlung von Patienten erleichtert 12. es könnte auch helfen, die Quelle der Infektion während der Salmonella SPP verfolgen /Shigella spp. Ausbruch13. Diese Methode ist jedoch arbeitsintensiv (erfordern manuelle Bedienung) und zeitaufwändig (wobei mehrere Tage), vor allem für das Testen einer großen Anzahl von Proben7. Darüber hinaus lebensfähig aber nicht kultivierbarer (VBNC) Salmonella SPP /Shigella spp.möglicherweise gibt es in einigen Stuhlproben14. Angesichts dieser Nachteile haben viele Labors versucht, neue Techniken zum Nachweis von Salmonella SPP entwickeln /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. all diese Methoden verwenden nuklearen saure Verstärkung Test (NAAT), unter denen die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die häufigste ist. Eine wichtige Einschränkung dieser NAAT basierte Methoden ist, dass tote Bakterien, auch bakterielle Verunreinigungen enthält unvollständige genomischer DNA, positive Ergebnisse26, zeigen konnte, die vor allem die genaue Diagnose der Krankheit beeinflussen könnten. Blanco Et Al. zeigten, dass molekulare Tests sehr empfindlich, nicht nur für tragfähige Salmonellen in Kulturen, sondern auch mit teilweise Genomen und tot oder nicht lebensfähig Bakterien aus vergangenen Infektionen oder Kontamination26ist. Daher sollten neuer Technologien entwickelt werden.

Wir hier eine neuartige Methode, verbindet die NAAT Methode und Kultivierung basiert. Wie in Abbildung 1dargestellt, diese neue Methode gilt Real-Time PCR erste screening und positive Proben werden für die Bakterienkultur und Identifikation gesendet.

Protokoll

Das Protokoll folgt die Richtlinien der Humanforschung Ethikkommission von Zhuhai International Travel Healthcare Center. Bitte verwenden Sie sterile Standardbetrieb während des Experiments.

(1) Kultur Medienkomposition und Vorbereitung

  1. Nährbouillon vorbereiten: Auflösen, 1 % Pepton, 0,3 % Rindfleisch-Extrakt, Natriumchlorid 0,5 %, 0,1 % Glukose in H2O, justieren pH 7,5 und Autoklaven in 121 ° C für 15 Minuten.
  2. Bereiten Sie Selenit Cystin Medium: auflösen 0,5 % Pepton, Wasserstoff Natriumselenit 0,4 % 0,4 % Laktose, 1 % Na2HCO30,001 % L-Cystin in H2O, pH-Wert auf 7,0 einstellen und für 5 min kochen.
  3. Vorbereiten der Xylose, Lysin, Deoxycholate Nährbodenplatte (XLD): auflösen 0,3 % Hefeextrakt, 0,5 % L-Lysin, 0.375 % Xylose, 0,75 % Laktose, 0,75 % Saccharose, 0,5 % Natrium-Chlorid, 0,008 % Phenol rot, 0,68 % Natriumthiosulfat, 0,08 % Ammonium ferric Citrat, Natrium 0,25 % Deoxycholate, 1,5 % Agar in H2O, und pH auf 7,4 einstellen. Dann für 5 min kochen Sie und gießen Sie sie in 90 mm Platten.
  4. Die Salmonellen chromogenen Nährbodenplatte Vorbereitung: Auflösen von 1,5 % Agar, 0,7 % Pepton und Hefe-Extrakt, 1,29 % selektive Reagenzien in H2O. Dann für 5 min kochen Sie und gießen Sie sie in 90 mm Platten.
  5. Vorbereiten die Nähragar Platte: auflösen, 1 % Pepton, 0,3 % Rindfleisch-Extrakt, 0,5 % Natrium-Chlorid, 1,5 % Agar in H2O, und passen Sie pH bis 7.3. Dann Autoklav in 121 ° C für 15 min und gießen Sie sie in 90 mm Platten.
  6. Vorbereiten die MacConkey-Agar (MAC)-Platte: auflösen 2 % Pepton, 1 % Laktose, Natriumchlorid 0,5 %, 0,5 % OX Galle Salz, 0,0025 % Neutral rot, 1,5 % Agar, 0,0001 % Kristallviolett in H2O, und pH-Wert auf 7,2 einstellen. Dann Autoklav in 115 ° C für 20 min und gießen Sie sie in 90 mm Platten.

(2) Real-Time PCR

  1. Entnahme von Proben
    1. Legen Sie eine anal Tupfer in der Patientin Anus 3-5 cm tief, und drehen Sie ihn um 360°.
    2. Setzen Sie den analen Tupfer in eine sterile Sammelröhrchen. Mark Probe-ID.
    3. Senden Sie die Probe so schnell wie möglich ins Labor.
      Hinweis: Proben konnten bei 4 ° C nicht mehr als 24 Stunden gelagert werden.
  2. Voranreicherung
    1. 3 mL Nährstoff Bouillon in jeder Probe in dem Sammelrohr hinzugeben.
    2. Bei 36 ° C für 6 Stunden in einem Inkubator inkubieren.
  3. Probe mischen (optional)
    1. Sammeln Sie 100 µL jeder Voranreicherung Kultur und ein 1,5 mL-Tube untermischen Sie 8-10 Proben 1 Probe, gibt es mehr als 10 Proben.
    2. Markieren Sie richtig.
  4. DNA-Extraktion
    1. Zentrifugieren der Voranreicherung Kultur 800 X g für 2 min erlauben große Partikel, sich niederzulassen, und Übertragung der Überstand auf eine neue Röhre und Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min. verwerfen des Überstands durch Absaugen.
    2. Fügen Sie 100 µL DNA-Extraktion-Lösung (0,01 M pH 8.0 Tris-EDTA, 0,01 % Nonidet P 40 (NP40)) zum Pellet. 1 min. kräftig vortexen.
    3. Kochen Sie bei 100 ° C für 5 min auf ein Trockenbad.
    4. Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min. sammeln des Überstands mit eine neue Röhre, die die Vorlage für die nachfolgenden Echtzeit-PCR-Analyse werden.
  5. Real-Time PCR
    1. Richten Sie das Reaktionsgemisch als folgen: für jede Probe hinzufügen 12,5 µL 2 x Reaktionsgemisch, 0,4 µM jeweils Fibel, 0,2 µM pro Sonde (Sequenzen in Tabelle 1)27, 5 µL der Vorlage in Schritt 2.4.4 vorbereitet und DdH2O um insgesamt bis zu 25 µL hinzuzufügen Volumen.
    2. Der Radsport Setupprogramm wie folgt: 95 ° C für 3 min, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 34 S. sammeln fluoreszierende Signale aus 6-Carboxy-Fluorescein (FAM) und Hexachlorofluorescein (HEX) Kanäle bei der Dehnung Schritt (72 ° C) automatisch durch die fluoreszierenden Echtzeit-PCR-Maschine.
    3. Führen Sie Real-Time PCR auf einer fluoreszierenden Echtzeit-PCR-Maschine gemäß den Anweisungen des Gerätes.
    4. Gehen Sie direkt zu Schritt 4 und negative Berichte, wenn negative Ergebnisse, auf die FAM/HEX-Kanäle, was bedeutet auftreten, dass Proben sind negativ für Salmonella SPP /Shigella spp.
    5. Gehen Sie zu Schritt 3.1 oder 3.2, wenn positive Ergebnisse auftreten auf die HEX und/oder FAM Kanäle, was bedeutet, dass die Probe bzw. für Salmonella SPP und/oder Shigella spp., positiv sein kann.
      Hinweis: Wenn Probe mischen im Schritt 2.3 durchgeführt wurde, sollte Real-Time PCR auf einzelne Proben, die einerseits positive gebildet durchgeführt werden, die echte positive Probe auf dem Bildschirm.

(3) geführte Kultur

  1. Salmonella spp. PCR positiven Probe
    1. Selektive Kultur in medium
      1. Fügen Sie 100 µL Voranreicherung Kultur in 5 mL Medium Selenit Cystin in einem Reagenzglas. Bei 36 ° C für 18-24 h in einem Inkubator inkubieren.
    2. Trennung von Kultur auf Platte
      1. Eine Schleife der Kultur mit einer Mikro-Schleife zu sammeln und auf XLD Teller oder Salmonellen chromogenen Nährbodenplatte verteilt. Bei 36 ° C für 18-24 h in einem Inkubator inkubieren.
    3. Biochemische Identifizierung
      1. Wählen Sie verdächtige Kolonie auf XLD-Teller (rosa Kolonie mit/ohne dunkle Herz, dunkle Kolonie, gelbe Kolonie mit/ohne dunkle Herz) oder Salmonellen chromogenen Nährbodenplatte (lila oder Prunosus Kolonie, glatt und rund) (Abbildung 2).
      2. Thema verdächtige Kolonie für biochemische Identifikation auf automatisierte mikrobielle Identifikations-System gemäß den Anweisungen des Gerätes.
    4. Serologischen Charakterisierung
      1. O Antigen Charakterisierung
        1. Geben Sie einen Tropfen des O Antigen polyvalent Sera in eine saubere Folie.
        2. Eine Schleife der Kolonie mit einem Mikro-Schleife und Schleifen im Sera zu sammeln.
        3. Gehen Sie zu 3.1.4.1.4 Schritt, wenn es wie fließenden Sand aussieht, was bedeutet, dass die Kolonie reaktiv auf die Sera (Abbildung 3). Fahren Sie andernfalls mit Schritt 3.1.4.1.5.
        4. Verwenden Sie O Antigen monovalente Seren, wiederholen Sie die Schritte 3.1.4.1.1, 3.1.4.1.3 bis das O Antigen gekennzeichnet ist.
        5. Verwenden Sie Vi Sera 3.1.4.1.1, 3.1.4.1.3 Schritte wiederholen. Diese Vi Sera reaktive Kolonien in einem Rohr zu sammeln und kochen bei 100 ° C für 5 min in ein Trockenbad. Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min. sammeln die Pellets und wiederholen Sie die Schritte 3.1.4.1.1, 3.1.4.1.4, bis O-spezifisches Antigen gekennzeichnet ist.
      2. H-Antigen-Charakterisierung
        1. Geben Sie einen Tropfen des H Antigen polyvalent Sera in eine saubere Folie.
        2. Eine Schleife der Kolonie mit einem Mikro-Schleife und Schleifen im Sera zu sammeln.
        3. Gehen Sie zu 3.1.4.2.4 Schritt, wenn es wie fließenden Sand aussieht, was bedeutet, dass die Kolonie der Sera reaktiv ist.
        4. Verwenden Sie H Antigen monovalente Seren, wiederholen Sie die Schritte 3.1.4.2.1, 3.1.4.2.3 bis H-spezifisches Antigen gekennzeichnet ist.
          Hinweis: Manchmal kann Serum Induktion benötigt, um die zweite Phase H-Antigen zu charakterisieren. Wenn ja, sollten die folgenden optionalen Schritte durchgeführt werden.
        5. (Optional) Geben Sie einen Tropfen des spezifischen H Antigen Sera auf Nähragar Teller. Warten Sie, bis alle Seren absorbiert werden.
        6. (Optional) Sammeln Sie eine Schleife der Kolonie mit einem Mikro-Schleife und die Ausbreitung auf den Teller, wo bestimmte H Antigen Sera absorbiert werden. Bei 36 ° C für 18-24 h in einem Inkubator inkubieren.
        7. (Optional) Verwenden Sie H Antigen monovalente Seren, wiederholen Sie die Schritte 3.1.4.2.1, 3.1.4.2.3 bis zweite Phase H Antigen gekennzeichnet ist.
        8. Gehen Sie zu Schritt 4.
  2. Shigella spp. PCR positiven Probe
    1. Trennung von Kultur auf Platte
      1. Eine Schleife der Voranreicherung Kultur mit einer Mikro-Schleife zu sammeln und auf einem XLD Teller oder MAC Platte verteilt. Bei 36 ° C für 18-24 h in einem Inkubator inkubieren.
    2. Biochemische Identifizierung
      1. Sammeln Sie verdächtige Kolonie auf XLD Platte (glatt, rund, transparent und rote Kolonie) oder MAC Platte (glatt, rund, transparent und farblos Kolonie mit 2-3 mm im Durchmesser; Shigella Sonnei kann größer sein und schalten Licht rosa wie die Dehnung der Inkubationszeit) (Abbildung 4).
      2. Thema verdächtige Kolonie für biochemische Identifikation auf automatisierte mikrobielle Identifikations-System gemäß den Anweisungen des Gerätes.
    3. Serologischen Charakterisierung
      1. Geben Sie einen Tropfen des Shigella spp. polyvalent Sera in eine saubere Folie.
      2. Eine Schleife der Kolonie mit einem Mikro-Schleife und Schleifen im Sera zu sammeln.
      3. Gehe zu 3.2.3.4 Schritt, wenn es wie fließenden Sand aussieht, was bedeutet, dass die Kolonie der Sera reaktiv ist.
      4. Verwenden Sie Shigella spp. monovalente Seren 3.2.3.1 zu 3.2.3.3 Schritte wiederholen, bis bestimmte Shigella spp. geprägt ist.
      5. Gehen Sie zu Schritt 4.

(4) Bericht

  1. Positive oder negative Berichte nach den oben genannten Ergebnissen.

Ergebnisse

Das Protokoll wurde für das Screening von Salmonella spp. angewendet /Shigella spp. in anal Hocker Beispiele von Menschen, die Nahrung und Wasser umgehen würden.

In der Real-Time PCR-Schritt wie in Abbildung 5A, gab es eine erfolgreiche Verstärkung im HEX-Kanal, was bedeutete, dass die gemischte Probe positiv für Salmonella SPP war. Dann wurde eine wei...

Diskussion

Seit Salmonella SPP /Shigella spp. sind oft verbunden mit Lebensmittelvergiftung und fäkal-orale Übertragung von akuter Gastroenteritis28,29 und die Routine-Methode ist entweder arbeitsintensiv und zeitaufwändig 7, beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Plattform für Salmonella SPP /Shigella spp. Screening mittels Real-Time PCR kombiniert mit geführten Kultur.

Es gibt mehrere...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Wissenschaft und Technologie-Programm von Zhuhai, China (Grant Nummer 20171009E030064), die Wissenschaft und Technologie-Programm von Guangdong, China (Grant Nummer 2015A020211004) und Wissenschaft und Technologie-Programm von General Administration unterstützt. der Quality Supervision, Inspektion und Quarantäne der Volksrepublik China (Grant Nummer 2016IK302, 2017IK224).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
TrisSigma10708976001
EDTASigma798681
NP40Sigma11332473001
ddH2OTakara9012
PrimeSTAR HS (Premix)TakaraR040Q
Nutrient BrothLandBridgeCM106
Nutrient agarLandBridgeCM107
Selenite Cystine mediumLandBridgeCM225
XLDLandBridgeCM219
MAC LandBridgeCM908
Salmonella chromogenic agarCHROMagarSA130
Salmonella diagnostic serumTianrunSAL60
Shigella diagnostic serumTianrunSHI54
anal swab (collecting tube plus)Huachenyang
slideMingsheng7102
micro-loopWeierkangW511
incubatorJinghongDNP-9082
autoclaveAULSS-325
dry bathJinghongKB-20
automated microbial identification systembioMérieuxVITEK2other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machineThermoFisherABI7500other equivalent machine could be used

Referenzen

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