Herstellung einer Niere Cortex extrazelluläre Matrix abgeleitet Hydrogel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Niere Kortex extrazelluläre Matrix abgeleitet Hydrogel um die native Niere extrazelluläre Matrix (ECM) strukturelle und biochemische Zusammensetzung behalten zu fabrizieren. Den Fertigungsprozess und ihre Anwendungen werden beschrieben. Schließlich ist eine Perspektive auf die Verwendung dieses Hydrogel zur Niere-spezifische zelluläre und Geweberegeneration und Bioingenieurwissenschaften Unterstützung diskutiert.

Zusammenfassung

Extrazellulärer Matrix (ECM) bietet wichtige biophysikalische und biochemische Hinweise um Gewebe Homöostase. Aktuelle synthetischen Hydrogelen bieten robuste mechanische Unterstützung für in-Vitro Zellkultur aber fehlen die notwendigen Protein und Liganden Zusammensetzung physiologischen Verhalten von Zellen zu entlocken. Dieses Manuskript beschreibt ein Herstellungsverfahren für eine Niere Kortex ECM-abgeleitete Hydrogel mit richtige mechanische Robustheit und unterstützende biochemischen Zusammensetzung. Das Hydrogel ist von mechanisch Homogenisieren und Gefäss-decellularized menschliche Niere Kortex ECM hergestellt. Die Matrix bewahrt native Niere Kortex ECM Protein Verhältnisse Gelierung zu physiologischen mechanische Steifigkeit ermöglicht. Das Hydrogel dient als Substrat auf die Nieren Rinde gewonnenen Zellen unter physiologischen Bedingungen aufrechterhalten werden können. Darüber hinaus kann die Hydrogel-Zusammensetzung manipuliert werden, um eine kranke Umwelt-Modell ermöglicht die Zukunftsstudie von Nierenerkrankungen.

Einleitung

Extrazellulärer Matrix (ECM) bietet wichtige biophysikalische und biochemische Hinweise um Gewebe Homöostase. Die komplexen molekularen Zusammensetzung regelt die strukturelle und funktionelle Eigenschaften des Gewebes. Strukturproteine Zellen mit räumliches Vorstellungsvermögen und Adhäsion und Migration¹. Gebundene Liganden interagieren mit Oberfläche Zellrezeptoren, Zelle Verhalten²zu kontrollieren. Niere ECM enthält eine Fülle von Molekülen, deren Zusammensetzung und Struktur variiert je nach anatomischen Lage, Entwicklungsstufe und Krankheit Staat^3,4. Rekapitulation der Komplexität von ECM ist ein wichtiger Aspekt bei der Untersuchung der Nieren-abgeleitete Zellen in Vitro.

Frühere Versuche zur Replikation von ECM Mikroumgebungen konzentrierten sich auf einem ganzen Gewebe, Gerüste Recellularization zusammenzustellen. Decellularization mit chemischen Reinigungsmitteln wie Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) oder nichtionischen Reinigungsmitteln durchgeführt wurde, und es nutzt entweder ganze Organ Perfusion oder Eintauchen und Agitation Methoden^{5,6,7 ,8,9,10,11,12,13}. Die hier vorgestellten Gerüste bewahren die strukturelle und biochemische Signale in nativen Gewebe ECM gefunden; Darüber hinaus Recellularization mit Spender-spezifischen Zellen hat klinischen Relevanz in der rekonstruktiven Chirurgie^{14,15,16,17,18, 19}. allerdings diese Gerüste fehlen strukturelle Flexibilität und sind daher nicht kompatibel mit vielen aktuellen Geräten für in-vitro- Studien verwendet. Um diese Einschränkung zu umgehen, haben viele Gruppen decellularized ECM zu Hydrogele^{20,21,22,23,24}weiterverarbeitet. Diese Hydrogele sind kompatibel mit Spritzguss und Bioink und Mikrometer Skala räumliche Einschränkungen, die Gerüste auf Zellen statt decellularized umgehen. Darüber hinaus sind Molekulare Zusammensetzung und Verhältnisse in native ECM gefunden^3,25erhalten. Hier zeigen wir eine Methode, um ein Hydrogel, abgeleitet von Niere Kortex ECM (kECM) herzustellen.

Dieses Protokoll soll ein Hydrogel zu produzieren, die die Mikroumgebung der Niere kortikalen Region repliziert werden. Nierengewebe Kortex ist in einer 1 % SDS-Lösung unter ständiger Bewegung, zelluläre Materie zu entfernen decellularized. SDS ist häufig verwendet, um Gewebe wegen seiner Fähigkeit, schnell zu entfernen, immunologische zellulären Material^6,7,9,26decellularize. Dann unterliegt die kECM mechanische Homogenisierung und Lyophilisation^5,6,9,11,26. Solubilisierung in einer starken Säure mit Pepsin führt zu einer endgültigen Hydrogel-Stammlösung^20,27. Native kECM Proteine, die wichtig sind für strukturelle Unterstützung und signal-Transduktion sind^3,25erhalten. Das Hydrogel kann auch in einer Größenordnung von nativen menschlichen Niere Kortex^28,29,30, geliert werden. Diese Matrix bietet eine physiologische Umgebung, die verwendet wurde, um die Ruhe der Niere-spezifischen Zellen im Vergleich zu Hydrogele aus anderen matrixproteine pflegen. Darüber hinaus Matrix Zusammensetzung manipuliert werden kann, zum Beispiel durch die Zugabe von Kollagen-I Modell Krankheit Umgebungen für die Studie der renalen Fibrose und andere Niere Krankheiten^31,32.

Protokoll

Menschliche Nieren wurden durch LifeCenter Nordwesten nach ethischen Leitlinien durch die Association of Organ Procurement Organizations lokalisiert. Dieses Protokoll folgt Tiere Pflege und Zelle Kultur genannten Richtlinien von der University of Washington.

1. Vorbereitung des menschlichen Nierengewebe

1. Vorbereitung der Decellularization Lösung
   1. Ein 5000 mL-Becherglas und eine 70 x 10 mm Stir Bar zu sterilisieren.
   2. Mix 1: 1000 (Gewicht: Volumen) Natrium Dodecyl-Sulfat (SDS) in autoklaviert deionisiertes Wasser in den Becher geben. Lassen Sie die Lösung auf einem Teller rühren ca. 200 u/min für 24 h oder bis die SDS vollständig gelöst ist.
      Anmerkung: In der Regel reicht 2500 mL 1 % SDS-Lösung zu eine einzige menschlichen Niere decellularize.
   3. Die Lösung auf eine 500 mL sterile Vakuumfilter übertragen und in sterilisierte verschließbaren Behälter zu filtern.
2. Verarbeitung von nierengewebe
   1. Wasch- und Autoklaven ein paar Zangen, zwei Gefäßklemme Klemmen, der allgemeine Service Klasse Schere, Skalpell Klinge Tragegriffen, einen 1000-mL-Becherglas abgedeckt mit Alufolie und 36 x 9 mm Stir Bar.
   2. Linie eine Gewebekultur Kapuze mit Unterlage. Legen Sie die Becher, ein steriles Gewebe Kulturschale (150 x 25 mm) und die ganze Niere-Orgel in der Haube. Füllen Sie den Becher mit 500 mL 1 % SDS-Lösung.
      Hinweis: Die menschliche Nieren gingen am Eis aus LifeCenter Nordwesten.
   3. Legen Sie die Niere in der sterilen Gewebe Kulturschale (Abbildung 1A). Entfernen Sie alle Tubulussystem Fett durch das Rasieren leicht um die renale Kapsel mit einem Skalpell (Abbildung 1 b).
   4. Machen Sie einen flachen 8-10 cm Schnitt mit dem Skalpell, nur tief genug, um die renale Kapsel aufzubrechen ohne die zugrunde liegenden Kortex Gewebe, über das bessere Ende der Niere. Entfernen Sie die renale Kapsel durch Schälen es weg von der Rinde Gewebe mit zwei Gefäßklemme Klemmen (Abbildung 1).
   5. Halbieren Sie die Niere entlang der koronalen Ebene mit dem Skalpell entlang der lateralen Seite der Niere (Abbildung 1). Kortex Gewebe aus beiden Hälften durch Ausgliederung der medullären Region mit dem Skalpell (Abbildung 1E) zu isolieren und die Rinde Gewebe in 0,5 cm³ Stücke (Abb. 1F) Würfeln. Entfernen Sie alle sichtbaren Großschiffe.
3. Isolierung der extrazellulären matrix
   1. Füllen Sie in einer Gewebekultur-Haube einen 1000-mL-Becherglas mit 500 mL 1 % SDS-Lösung. Legen Sie die gewürfelte Kortex Gewebe und rühren Bar in das Becherglas mit SDS-Lösung. Decken Sie das Becherglas mit autoklaviert Alufolie ab und legen Sie sie auf einem Teller rühren ca. 400 u/min außerhalb der Gewebekultur-Haube.
   2. Nach das Kortex Gewebe auf dem Teller rühren für 24 h wurde, bringen Sie das Becherglas in einer Gewebekultur Kapuze und fügen Sie ein 40 µm sterile Zelle Sieb mit Nylon-Mesh gemacht. Füllen Sie einen separaten 1000 mL Becher mit 200 mL Bleichmittel und legen Sie sie in der Gewebekultur-Haube.
   3. Pipette, die SDS-Lösung durch das Sieb der Zelle in das Becherglas mit Bleichmittel. Pipette, alle SDS-Lösung bis nur decellularized Gewebe und Zelle Sieb im Becherglas bleiben.
      Hinweis: Die Zelle Sieb sollte jedem Gewebe verhindern entfernt während Lösung streben.
   4. Lassen Sie die Zelle Sieb in den Becher und füllt mit 500 mL frischem SDS-Lösung. Das Becherglas mit dem gleichen Alu-Folie abdecken und auf einen Teller rühren mit der gleichen Geschwindigkeit wie vor Ort.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.3 alle 24 Stunden mit frischem SDS-Lösung für insgesamt fünf Tage.
   6. Spülen Sie decellularized Gewebe mit autoklaviert DI Wasser alle 24 h für 3 Tage insgesamt, nach der Technik beschriebenen in Schritten 1.3.1-1.3.3.
   7. Spülen decellularized Gewebe mit Zellwasser Kultur Grade alle 24 h für 2 Tage, nach der Technik gemäß Schritte 1.3.1-1.3.3.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.2. Übertragen Sie das decellularized Gewebe (bezeichnet als kECM ab diesem Zeitpunkt auf) in eine 30 mL Selbststehend konischem Rohr zu und mit Kultur Grade Zellwasser füllen Sie, bis das Gewebe untergetaucht ist.

2. Herstellung von Hydrogel-Lager-Lösung

1. Mechanische Bearbeitung von decellularized Gewebe
   1. In einer Gewebekultur Haube mechanisch Homogenisieren Sie kECM innerhalb der konischen Röhre mit einem Gewebe-Homogenisator für 2 min.
      Hinweis: Homogenisierte kECM sollte eine opake Lösung mit keine sichtbaren Stücke von ECM ähneln.
   2. Tauchen Sie das konische Rohr mit kECM in flüssigem Stickstoff bis Kochen rund um das Rohr nicht mehr besteht. Speichern Sie die kECM bei-4 ° c über Nacht.
2. Gefriertrocknung von gefrorenen decellularized Gewebe
   1. Lösen Sie leicht konischem Rohr Kappe, damit für Gasaustausch und legen Sie das Rohr in eine Gefriertrocknung-Maschine. Die kECM lyophilize, drei Tage lang oder bis es ein feines, weißes Pulver ähnelt. Bei-4 ° c.
3. Chemische Verdauung und Solubilisierung Gel
   1. Autoklaven ein 20 mL-Fläschchen funkeln und GAP 15,9 x 7,9 mm rühren und eine Bar, ein paar feine Spitze Pinzetten.
   2. Wiegen die lyophilisierten kECM und berechnen Sie das Volumen von HCl und Pepsin musste solubilisieren kECM zu einer 3 % (30 mg/mL) Lösung mit den folgenden Gleichungen, wo m_Pepsin ist die Masse von Pepsin Masse, m_Gewebe ist die Masse des lyophilisierter Gewebe und V_HCl ist das Volumen von 0,01 N HCl:
      
      
   3. In einer Gewebekultur-Haube das Funkeln Fläschchen porcinen Magen Pepsin, 0,01 N HCl und Stir Bar hinzu, und lassen Sie es auf einer Platte unter Rühren auf ca. 500 u/min, bis alle Pepsin aufgelöst hat. Transfer der gefriergetrockneten kECM zum Funkeln Fläschchen und lassen Sie die Lösung auf einem Teller rühren bei ca. 500 u/min für drei Tage.

3. Hydrogel Gelierung

1. Niere ECM Hydrogel Vorbereitung
   1. Das Hydrogel durch Mischen der kECM Hydrogel-Stammlösung mit 1 N NaOH, 10 x Medien Ergänzung (M199), Gel und Zell-Kultur, Medien. Halten Sie die Lösungen auf dem Eis.
      Hinweis: Letzte Gel Konzentrationen von 7,5 mg/mL waren für die Zellkultur verwendet. 1 mL kECM Gel war ausreichend für Zellexperimente Kultur vorgestellt.
   2. Bestimmen Sie die Lautstärke praktikable kECM Gel produziert und Volumen der Lager kECM Hydrogel benötigt mithilfe der folgenden Gleichung, wo V_final ist das Volumen des Gels erstellt, V_{Lager kECM} ist das Volumen der Lager kECM Hydrogel benötigt, C_{Lager kECM} ist die Konzentration Lager kECM Hydrogel und C_final ist die Konzentration des endgültigen Gels:
      
   3. Bestimmen Sie die Lautstärke mithilfe der folgenden Gleichungen, wo V_NaOH ist das Volumen von 1 N NaOH benötigte Reagenzien zu neutralisieren, _{10 X} V ist das Volumen des M199 10 X Medien ergänzen und V_{1 X} ist die Volumen von Zellkulturmedien:
      
      
      
   4. In einer Gewebekultur-Haube pipette die neutralisierenden Reagenzien (NaOH, M199 und Zellkulturmedien) in eine sterile 30 mL Selbststehend konischem Rohr. Mischen Sie die neutralisierende Reagenzlösung mit einer Microspatula.
   5. Verwenden Sie eine sterile 1 mL Spritze, um das entsprechende Volumen der Lager kECM Hydrogel zu neutralisierende Reagenzlösung übertragen. Verwenden Sie eine Microspatula, um die Lösung vorsichtig mischen, bis eine homogene Farbe Hydrogel Lösung erreicht ist.
      Hinweis: Vermeiden Sie Luftblasen unter Rühren langsam und vorsichtig einführen.
   6. Um Zellen in kECM Hydrogel enthalten, subtrahieren Sie 10 µL Zellkulturmedien (V_{1 X}) aus die neutralisierende Lösung Mengenberechnungen im Schritt 3.1.1.3.
      1. Suspendieren Sie Zellen in 10 µL Zellkulturmedien. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen ausgesetzt werden mithilfe der folgenden Gleichung, wo #_Zellen bedeutet die Anzahl der Zellen, auszusetzen und V_final ist das Volumen des Gels erstellt:
         
         Hinweis: 300.000 Zellen/mL ist die Konzentration der Zellen in der kECM Gel verwendet.
      2. Pipette 10 µL der Zelle gesperrt-Lösung in das endgültige kECM Gel nach kECM-Stammlösung vermischt worden ist, mit Reagenzlösung zu neutralisieren. Rühren Sie die Lösung mit einer Microspatula, bis die Zellen gleichmäßig verteilt sind.
2. Verwenden Sie eine 1 mL Spritze, um eine gewünschte Zelle Kultur Gerät mit kECM Hydrogel auszufüllen.
3. Lassen Sie das Gel auf 37 ° c für 1 h vor dem übertragen oder galvanischen Zellen festgelegt.

Ergebnisse

KECM Hydrogel stellt eine Matrix für Niere Zellkultur mit ähnlicher chemischer Zusammensetzung als die native Niere Mikroumgebung. Um das Hydrogel zu fabrizieren, ist Cortex nierengewebe mechanisch isoliert aus eine ganze Niere Orgel und gewürfelte (Abbildung 1). Decellularization mit einem chemischen Reinigungsmittel (Abbildung 2A.1-a. 3), gefolgt von Spülungen mit Wasser Spülmittel Partikel (

Diskussion

Matrizen liefern wichtige mechanische und chemische Signale, die Zelle Verhalten steuern. Synthetische Hydrogele sind in der Lage, komplexe 3-dimensionale Musterung unterstützen, aber nicht die vielfältigen extrazelluläre Signale in physiologischen Matrix Mikroumgebungen gefunden. Hydrogele native ECM abgeleitet sind ideale Materialien für in Vivo und in Vitro Studien. Frühere Studien haben decellularized ECM Hydrogele verwendet, um synthetische Biomaterialien zur Vermeidung Host Immunreaktionen

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Preparation of Kidney Tissue
5000 mL Beaker	Sigma-Aldrich	Z740589
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	436143
Sterile H2O			Autoclaved DI H2O
Stir Bar (70 x 10 mm)	Fisher Science	14-512-128
500 mL Vacuum Filter	VWR	97066-202
Stir Plate	Sigma-Aldrich	CLS6795420D
1000 mL Beaker	Sigma-Aldrich	CLS10031L
Forceps	Sigma-Aldrich	F4642	Any similar forceps may be used
Scissor-Handle Hemostat Clamp	Sigma-Aldrich	Z168866
Dissecting Scissors	Sigma-Aldrich	Z265977
Scalpel Handle, No. 4	VWR	25859-000	Any similar scalpel handle may be used
Scalpel Blade, No. 20	VWR	25860-020	Any similar scalpel blade may be used
Stir Bar (38.1 x 9.5 mm)	Fisher Science	14-513-52
Absorbent Underpad	VWR	82020-845
Petri Dish (150 x 25 mm)	Corning	430597
Autoclavable Biohazard Bag	VWR	14220-026
Sterile Cell Strainer (40 um)	Fisher Science	22-363-547
Cell Culture Grade Water	HyClone	SH30529.03
30 mL Freestanding Tube	VWR	89012-778
Fabrication of ECM Gel
Tissue Homogenizer Machine	Polytron	PCU-20110
Freeze Dryer	Labconco	7670520
20 mL Glass Scintillation Vials and Cap	Sigma-Aldrich	V7130
Stir Bar (15.9 x 8 mm)	Fisher Science	14-513-62
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa	Sigma-Aldrich	P7012
0.01 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water
Kidney ECM Gelation
1 N NaOH (Sterile)	Sigma-Aldrich	415413	Dilute to 1 N in cell culture grade water
Medium 199	Sigma-Aldrich	M4530
15 mL Conical Tube	ThermoFisher	339651
Cell Culture Media	ThermoFisher	11330.032	Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10082147
Antibiotic-Antimycotic 100X	Life Technologies	15240-062
Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X	Life Technologies	51300-044
1 mL Syringe	Sigma-Aldrich	Z192325
Microspatula	Sigma-Aldrich	Z193208