Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bild Kalzium signalisieren in den Populationen der einzelnen Zelltypen bei der murinen neuromuskulären Synapse.

Zusammenfassung

Die elektrische Aktivität der Zellen in den Geweben durch elektrophysiologische Techniken überwacht werden kann, aber diese sind in der Regel auf die Analyse der einzelnen Zellen beschränkt. Da eine Erhöhung der intrazellulären Kalzium (Ca^{2 +}) in die Zellflüssigkeit oft aufgrund der elektrischen Aktivität tritt oder in Reaktion auf eine Vielzahl von anderen reizen, dieser Prozess sich durch lässt die Darstellung der Zellen mit fluoreszierenden Calcium-Sensitive geladen Farbstoffe.  Allerdings ist es schwierig, diese Antwort in einer einzelnen Zelle Art im gesamten Gewebe Bild, da diese Farbstoffe durch alle Zelltypen im Gewebe entnommen werden. Im Gegensatz dazu genetisch codierte Kalzium Indikatoren (GECIs) können durch eine einzelne Zelle Art ausgedrückt werden und fluoreszieren in Reaktion auf eine Erhöhung der intrazellulären Ca^{2 +}, erlaubt die Bildgebung von Ca^{2 +} in der gesamten Bevölkerung der Signalisierung einzelnen Zelltypen. Hier wenden wir die Verwendung von GECIs GCaMP3/6 auf der Maus neuromuskulären Synapse, eine dreigliedrige Synapse zwischen Motoneuronen, Skelettmuskel und Terminal/Perisynaptic Schwann-Zellen. Wir zeigen den Nutzen dieser Technik im klassischen ex Vivo Gewebe Vorbereitungen. Mit Hilfe eines optischen Splitters, führen wir Dual-Wellenlänge Bildgebung der dynamischen Ca^{2 +} Signale und eine statische Beschriftung der neuromuskulären Synapse (NMJ) in einem Ansatz, der an zwei zellspezifische GECI oder genetisch codierte Spannung überwachen leicht angepasst werden könnte Indikatoren (GEVI) gleichzeitig. Schließlich diskutieren wir die Routinen verwendet, um räumliche Karten der Fluoreszenzintensität zu erfassen. Zusammen, können diese optischen, transgenen und analytische Techniken eingesetzt werden, um die biologische Aktivität der Zelle unterschiedliche Subpopulationen bei NMJ in einer Vielzahl von Kontexten zu studieren.

Einleitung

NMJ, wie alle Synapsen besteht aus drei Elementen: ein präsynaptischen Terminal abgeleitet eines Neurons, einer postsynaptischen Neuron/Effektor-Zelle und eine Perisynaptic glial cell^1,2. Während die grundlegenden Aspekte der synaptischen Übertragung dieser Synapse³erstmals nachgewiesen wurden, bleiben viele Aspekte dieses Prozesses unbekannt, teilweise aufgrund der Ausdruck der gleichen Moleküle durch die ausgeprägte zelluläre Elemente dieser Synapse. Beispielsweise werden Rezeptoren für die Purin Adenin Nukleotide ATP und Acetylcholin (ACh), die von Motoneuronen bei Wirbeltieren NMJ Co freigesetzt werden, durch Muskel-, Schwann-Zellen und motorischen Neuronen, so erschwert die Interpretation eines ausgedrückt. funktionelle Wirkung ausgeübt durch diese Substanzen (z.B.Sender Freigabe oder Antwort, Muskel Krafterzeugung)⁴. Darüber hinaus die dreigliedrigen Komponenten der NMJ sind zwar einfach im Vergleich zu, z. B. Neuronen im zentralen Nervensystem die oft mehreren synaptischen Eingänge aufweisen ob die motorischen Nervenzellen, Muskelzellen oder Schwann-Zellen als Reaktion auf Reize, die Basis variieren auf ihre inneren Heterogenität (z.B., embryonale Ableitung, Faser-Subtyp, Morphologie) ist unklar. Um alle diese Probleme zu lösen, wäre es vorteilhaft, die Reaktion vieler Zellen innerhalb einer synaptischen Element sowie Track, zur gleichen Zeit, solch eine Reaktion auf die einzelnen Elemente gleichzeitig verfolgen. Konventionelle Strategien mit chemischen Farbstoffen zu Kalzium Signalisierung messen können diese zwei Ziele nicht erreichen, weil Bad angewendet Farbstoff durch mehrere Zelltypen nach Anwendung auf Gewebe aufgenommen wird und intrazellulär geladen Farbstoff nur verwendet werden, kann um zu visualisieren Person oder einer kleinen Kohorten von Zellen. Hier, mit Hilfe transgener Mäuse mit dem Ausdruck GECIs entworfen, um zellspezifische Kalzium Signalisierung zusammen mit bestimmten Bildgebung und Software Tools⁵, wir führen die erste dieser zwei allgemeine Ziele und erläutern wie die Zugabe von neu Transgene Werkzeuge würde helfen, die Sekunde zu erreichen. Diese Technik wird für alle interessierten bei der Verfolgung von Kalzium Dynamik oder andere zellulare signalisieren Ereignisse beobachten durch gen-kodierte optische Sensoren in mehrere Zellpopulationen zur gleichen Zeit nützlich sein.

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Protokoll

Tierhaltung und Experimente wurden in Übereinstimmung mit den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und die IACUC an der University of Nevada durchgeführt.

1. Vorbereitung von Membranen und phrenicus Nerven von transgenen Mäusen

1. Kaufen Sie Transgene Mäuse und Oligonucleotide Zündkapseln, Genotyp dieser Mäuse.
   Hinweis: Die Primer werden für jede dieser Mäuse auf der Seite "Informationen" aufgeführt.
   1. Züchten von 3 bis 6 Monate alte Maus mit dem Ausdruck eine Kopie des entsprechenden transgene/Knock-in Cre-Fahrer-Allels und NULL Kopien des Allels bedingte GCaMP3/6 mit einer zweiten Maus im gleichen Alter mit dem Ausdruck ein oder zwei Kopien der Bedingung GCaMP3 / 6 Allel und NULL Kopien des Allels Cre-Treiber.
   2. Genotyp der Welpen und markieren Sie diejenigen, die Cre und bedingte GCaMP3/6 Allele haben – diese werden fortan Doppel-transgenen Mäusen aufgerufen werden (z.B. Myf5-Cre, bedingte GCaMP3)⁶.
      Hinweis: Auf diese Weise werden alle Daten von Mäusen mit dem Ausdruck eine Kopie der Cre und bedingte GCaMP3/6 Allele abgeleitet werden. Dies ist besonders wichtig, wenn Sie diese Kreuze in anderen Mutanten Mäusen (z.B., Knockouts) hinzufügen.
2. Wenn die Doppel-transgenen Mäuse sind im entsprechenden Alter (z.B., postnatale Tag 0 oder 5 [P0 oder P5] oder Erwachsene), einschläfern die Mäuse durch enthaupten sie mit einer Schere (für Mäuse jünger als P10) oder indem man sie in eine Kammer Isofluran Inhalation – Wann sind nicht mehr ansprechbar, Kneifen die Rute mit einer Zange, sind sie bereit für das Opfer.
3. Das Tier durch Enthauptung mit der Schere zu opfern.
4. Quer über das gesamte Tier direkt unterhalb der Leber und nur über das Herz und die Lungen mit Iridektomie Schere Abschnitt.
5. Sezieren Sie entfernt die Leber, das Herz und die Lunge, wobei Sie darauf achten, eine Länge des Nervus phrenicus beizubehalten, die lang genug, um in einer Saug-Elektrode (d.h. 1 – 2 cm) gezogen ist.
   Hinweis: Der linken phrenicus Nerv kann als ein weißes Stück Gewebe identifiziert werden, die den medialen Teil des linken Zwerchfells eingibt. Es muss nicht geschnitten werden, wenn die Lunge zu entfernen. Der Rechts phrenicus Nerv läuft in einer Faszie, die auch enthält die überlegene Vena Cava und ist dünner und weißer als der Vena Cava. Gemeinsam dringen sie beide rechts mediale Membrane.
6. Weiter entfernen Sie den Brustkorb und die Wirbelsäule, außer dem dünnen Grat um das Zwerchfell.
7. Legen Sie die Membrane und der phrenicus Nerv Probe in einem Microfuge Rohr mit Krebs-Ringer-Lösung mit 1 µg/mL 594-αBTX für 10 min in der Dunkelheit.
   Hinweis: Diese Konzentration von 594-αBTX Etiketten ACh-Rezeptoren (AChRs) ohne zu blockieren ihre Funktion (persönliche Beobachtung).

2. Stimulation und Aufnahme von Aktionspotentialen der Muskel

1. Mit Hilfe der Minutien Pins, die Membran zu immobilisieren durch Festhalten auf eine 6-cm-Schüssel beschichtet mit dielektrischen Silikongel gefüllt mit ~ 8 mL Sauerstoff Krebs-Ringer-Lösung und legen Sie es auf den Mikroskoptisch. Durchspülen Sie die Membran mit mehr Krebs-Ringer-Lösung (8 mL/min) für 30 min.
   Hinweis: Dies spült die ungebundenen 594-αBTX, sowie das Gewebe nach Dissektion gestalten.
2. Machen Sie eine Saug-Elektrode gemäß der etablierten Methoden⁷.
   1. Bewegen Sie bei 4 X Vergrößerung mit einem Mikromanipulator die Saug Elektrode über den linken phrenicus Nerv und wenden Sie Ansaugung durch Herausziehen des Laufes einer 5-mL-Spritze verbunden auf das Rohr, das an die Absaugung Elektrode angeschlossen ist an.
      Hinweis: Wenn erfolgreich in die Absaugung Elektrode gezeichnet, Nervus phrenicus ist straff. Schalten Sie den Stimulator und stimulieren den phrenicus Nerv durch Umklappen der manuellen Schalter 1 X.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Membran in Reaktion auf die 1-Hz-Stimulation Verträge, durch die Untersuchung es visuell mit Hellfeld-Beleuchtung. Wenn dies nicht der Fall ist, passen Sie die Spannung durch Drehen des Drehknopfes Spannung schrittweise um einen supramaximalen Impuls zu erreichen, die durch eine visuelle Prüfung der Muskelkontraktion nachgeprüft werden kann. Wenn noch nicht sichtbar, Ausblasen des Nervs mit der Spritze und versuchen Sie es ziehen wieder durch die Anwendung der sog.
3. Schalten Sie die Durchblutung und fügen Sie die Muskel-spezifische Myosin-Inhibitor BHC-⁶ oder der Voltage-gated Natrium Kanal Antagonisten µ-vor⁸ , eine Endkonzentration von 100 µM.
   1. Um 100 µM BHC, pipette 4 µL 200 mM Lager in DMSO und in Krebs-Ringer-Lösung 1 mL predilute.
   2. Entfernen Sie 1 mL der Krebs-Ringer-Lösung aus der Schale.
   3. Fügen Sie die vorverdünnten BHC auf den Teller.
      Hinweis: Diese Vorverdünnung verhindert, dass die Induktion von unverdünntem DMSO nicht flüchtigen fluoreszierende Antwort in GCaMP3 exprimierenden Zellen.
   4. Warten Sie 30 min und schalten Sie dann die Perfusion der frischen Krebs-Ringer-Lösung für weitere 20-30 Minuten.
4. Bereiten Sie die Aufnahme-Elektrode.
   1. Tragende von Handschuhen, einem Monofilen Borosilikatglas mit einem Außendurchmesser (OD) von 1 mm und einem Innendurchmesser (ID) von 0,4 mm in einer Mikropipette Puller und ziehen Sie die Regler um es in Position zu befestigen. Schließen Sie die Tür Puller.
   2. Mit einem Abzieher P-97 programmieren Sie die folgende Einstellung: Wärme bei 900, Pull bei 120, Geschwindigkeit bei 75, mal bei 250, Druck auf 500 und keine zusätzliche Schleifen.
      Hinweis: Resistance (R) wird mit Software-Steuerung des Verstärkers gemessen: der Datenerfassungs-Software bestätigt Widerstand durch das Lösen der Formel V = IR. Der Software Controller geht einen bekannten Strom (I) (in der Regel 1 nA) durch die Elektrode und misst die Veränderung der Spannung (V), so dass wir für R. lösen
   3. Embryonale Membranen stellen Sie sicher, dass der Widerstand in der Nähe von 60 MΩ und für ältere Membranen, 10-20 MΩ. Laden Sie die Aufnahme-Elektrode mit 3 M KCl.
5. Senken Sie bei 10-facher Vergrößerung die Elektrode in Muskeln, mit einem zweiten Mikromanipulator auf der gegenüberliegenden Seite der Bühne als eine anregende Elektrode.
6. Elektrophysiologische Datenerfassungs-Software verwenden, warten Sie, bis die Membran-Ruhepotential von 0 auf-65 ändert mV oder unten.
7. Bei 1 Hz stimulieren und überprüfen das Vorhandensein von einem Muskel-Aktionspotenzial indem auf ein großes Potenzial, das eine bescheidene Überschwingen aufweist (Potenzial, der sich über 0 erhebt mV bei einsetzendem bei-65 mV oder unten). Verwechseln Sie nicht die Anregung Artefakt mit ein Aktionspotential.
   Hinweis: Potenziale sind in Dauer (~ 5 ms) als Anregung Artefakte deutlich länger.

(3) Bildgebung der Fluoreszenz der Probe

1. Mit 20 X Vergrößerung, suchen die Endplatte Band in der Mitte des Muskels durch auf der Suche nach 594-αBTX – mit der Bezeichnung NMJs unter grün/gelb leichte Erregung (550 nm). Wechseln Sie in das blaue Licht Erregung (470 nm), Bild Ca^{2 +} Antworten im Muskel, Motoneuron oder Schwann-Zellen.
2. Falls gewünscht, die Bild-Splitter mit Bandpass-Filter und einen dichroitischen Single-Kante-Filter für die Dual-Wellenlänge Bildgebung eingerichtet.
3. Um die maximale Fluoreszenz (Fmax) ausgestellt von GCaMP3/6-Ausdruck Gewebe zu berechnen, addieren Sie 12 µL 3 M Kaliumchlorid (KCl) an die Membran Vorbereitungen⁶.
   1. Durchführen Sie Experimente mit der Helligkeit-Bar auf der Lookup Tabelle Bar auf 110 % des Niveaus an die GCaMP3/6-Ausdruck Gewebe Sättigung bei 20 X Vergrößerung ausstellt, ohne Reaktion auf KCl binning.
4. Mit 20 Bildern pro Sekunde nicht verpassen schnellen Ereignisse aufzeichnen.
5. Mit 1-45 s von 20-40 Hz von Nervenstimulation durch die Bereitstellung eines Zuges der Impulse mit der Saug-Elektrode stimulieren Sie oder fügen Sie pharmakologische Agonisten durch Bad Anwendung oder durch Perfusion und sammeln Sie dynamische fluoreszierende Ca^{2 +} Antworten in einer Zelle Subtyp zusammen mit den statischen 594-αBTX NMJ Signal.
   Hinweis: Wenn gewebespezifischen rot oder dunkelrote GECI oder GEVI Mäuse an den NMJ verfügbar, können sie verwendet werden, zwei dynamische Signale reflektiert zwei zelluläre Elemente an den NMJ zu sammeln.
6. Wenn die bildgebenden oder elektrophysiologische Experimente abgeschlossen sind, weil die gewünschten Ergebnisse erzielt wurden, durchspülen Sie Wasser durch die Perfusion Leitungen und saugen Sie Wasser 2 x - 3 X durch die Absaugung Elektrode um sicherzustellen, dass Salze baut nicht auf.

4. Export und Analyse der Daten durch eine Standardabweichung Karte der Fluoreszenzintensität (SD-_iu16)

1. Nehmen Sie Bildsequenzen als 16-Bit TIFF-Stapel auf und laden sie in die gewünschten Daten Analyse Abbildungssystem zur Analyse.
2. Wählen Sie in die Software 8D Menü "Datei" Bildstapel von Interesse , und klicken Sie, um zu laden.
   1. Sobald das Video geladen wird, Durchsuchen Sie die Zeit, um einen Abschnitt zu identifizieren, der keine fluoreszierenden Zellaktivität hat.
      Hinweis: Zum Erstellen eines Hintergrund-Beispiels wird dieser Region verwendet werden.
   2. Halten Sie die UMSCHALTTASTE und klicken Sie auf um eine Region of Interest (ROI) Feld im Bereich als den Hintergrundbereich Probe zu ziehen.
   3. Nach dem Erstellen der Box, drücken Sie die LEERTASTE um eine Darstellung der Hintergrundänderung Aktivität zu erstellen.
   4. Rechtsklicken Sie auf die Spur und sortierten die Option die Option Dump ROI als Text die Spur als Xy-Koordinate Textdatei zu präsentieren.
3. Umzug zurück in das Video von Interesse, Scannen Sie erneut um die Zeit-Region zu identifizieren, wo die Aktivität des Interesses auftritt.
   1. Mit der mittleren Maustaste, wählen Sie dieses Mal Region in das gelbe Feld.
   2. Mit der rechten Maustaste auf das Video und wählen Sie Stapel-OPS und dann Stat Karte Option 5.
      Hinweis: Dadurch wird eine Standardabweichung (SD Karte) im linken Fenster generiert.
   3. Klicken Sie auf die SD-Karte und dann Taste drücken die [ ] 19 X, um die entsprechende Farbe Heatmap anwenden.
   4. Mit der rechten Maustaste der SD-Karte und wählen Sie STM laden und speichern, die die Option Stm als Tiff speichern auf der SD-Karte zu speichern, präsentieren wird.
   5. Dann, drücken Sie die [ Schlüssel 19 X wieder ein Graustufen-Farbkarte.
   6. Drücken Sie die Taste C und dann D Dichte-Mapping-Tools bringen. Verwenden Sie die linke Maustaste gedrückt und die Mitteltaste der Maus, passen Sie den Schwellenwert um alle fluoreszierenden Aktivität gezeigt in der SD-Karte erweitert.
   7. Drücken Sie C , um die Dichte Werkzeuge schließen und gleichzeitig die Schwellenwerteinstellungen.
   8. Mit der rechten Maustaste der SD-Karte und wählen Sie STM Partikel und dann PTCLS zu finden.
      Hinweis: Dies erkennt einzelne Zellen fluoreszierende Tätigkeit zum Ausdruck zu bringen.
   9. Rechtsklicken Sie die SD-Karte erneut und wählen Sie Erstellen Partikel ROIs.
      Hinweis: Dadurch werden die ausgewählten Zellen auf das original-Video von Interesse überlagern.
   10. Bei gedrückter Shift, mit der rechten Maustaste auf einen der jetzt identifizierte Teilchen ROIs auf das original-Video.
   11. Wählen Sie ROI Marker und Maßnahme Int in ROI.
       Hinweis: Dies erzeugt individuelle fluoreszierende Aktivität Grundstücke für jeden identifizierten ROI in dem Video von Interesse. Diese können mit der rechten Maustaste eine von diesen gespeichert und Auswahl sortiert, gefolgt von Dump ROI als Text.
4. Detaillierten Logik dieser Operationen entnehmen Sie bitte der Source-Code-Datei⁹.

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Ergebnisse

Mehrere Beispiele für Fluoreszenz Intensität Änderungen, vermittelt durch einen Anstieg der intrazellulären Ca^{2 +} in bestimmten Zelltypen von NMJ, zeigt das Dienstprogramm dieses Ansatzes. Diese Ergebnisse werden als räumliche Fluoreszenz Intensität Karten, präsentiert die geben die Position der antwortenden Zellen sowie die Intensität ihrer Antworten, so dass für die Bewertung von wie viele Zellen reagieren und wie viel jeder Zelle reagiert auf ein bestimmtes Reiz. Zu...

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Diskussion

Hier stellen wir einige Beispiele für Ca^{2 +} Antworten in bestimmte Zellen in intaktem neuromuskuläre Gewebe mit Hilfe von GECI exprimierenden Mäusen zu messen. Um diese Experimente erfolgreich durchführen zu können, ist es nicht unbedingt Nervus phrenicus während der Präparation zu verletzen. Um Ca^{2 +} Antworten in Schwann-Zellen bei hohen oder niedrigen Leistung (d.h.20 X oder X 60) Bild, ist es notwendig, BHC oder µ-vor Block Bewegung zu verwenden. Für Niederleistungs-Bildgebung v...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myf5-Cre mice	Jax	#007893	Drives muscle cell expression as early as E136
Wnt1-Cre mice	Jax	#003829	Drives expression into all  Schwann cells at E13 but not P209
Sox10-Cre mice	Jax	#025807	Drives Schwann cell expression at older ages
Conditional GCaMP3 mice	Jax	#029043	Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion
Conditional GCaMP6f mice	Jax	#024105	Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)	Hit2Lead	#5102862	Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ
µ-conotoxin GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG	Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins
Minutien pins (0.1mm diameter)	Fine Science Tools	26002-10	Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel
Eclipse FN1 upright microscope	Nikon	MBA74100	Allows staging and observation of specimen
Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator	Autom8	MXMScr	Allows movement of specimen
Manual micromanipulator	Narishige	M-152	Holds recording and stimulating electrodes
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Axoclamp 900A	Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording
Microelectrode low-noise data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1550	Allows electrophysiological data acquisition
Microelectrode data analysis system	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	Performs electrophysiological data analysis
Square wave stimulator	Grass	S48	Stimulates nerve to excite muscle
Stimulus Isolation Unit	Grass	PSIU6	Reduces  stimulation artifacts
Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter	Sutter	FG-GBF100-50-15	Impales and records nerve-evoked muscle potentials
Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter	Sutter	BF150-117-15	Lengthened and used for suction electrode
Micropipette Puller	Sutter	P-97	Pulls and prepares recording electrodes
1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera	Photometrics	Prime 95b	Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging
Light Source	Lumencor	Spectra X	Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation
Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm	Nikon	CFI60	Provide long working distances for visualization of specimen
Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp	Sumita	LS-DWL-N	Provides illumination for brightfield observation
W-View Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera
Single-band Bandpass Filters  (512/25-25 and 630/92-25)	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	Permits dual band imaging
560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging
Imaging data acquisition system	Nikon	NIS Elements - MQS31000	Allows imaging data acquisition
Wavelength control module	Nikon	MQS41220	Module for imaging data acqusiition
Emission splitter hardware module	Nikon	MQS41410	Module for imaging data acqusiition
Imaging data analysis system	NA	Volumetry 8D5, Fiji	Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data