Design und Synthese eines rekonfigurierbaren DNA-Akkordeon-Racks

Zusammenfassung

Wir beschreiben das ausführliche Protokoll für Konstruktion, Simulation, nass-Laborversuche und Analyse für eine rekonfigurierbare DNA Akkordeon Rack 6 mal 6 Maschen.

Zusammenfassung

DNA-Nanostruktur-basierte mechanische Systeme oder DNA Nanomaschinen, die komplexe nanoskaligen Bewegung in 2D und 3D in den Nanometer Ångström Auflösung zu produzieren, zeigen großes Potenzial in verschiedenen Bereichen der Nanotechnologie wie die molekulare Reaktoren, Drug-Delivery, und Nanoplasmonic Systeme. Rekonfigurierbare DNA Akkordeon Rack, die gemeinsam eine 2D oder 3D nanoskaligen Netzwerk Elemente, in mehreren Stufen in Reaktion auf die DNA-Eingaben ändern können, wird beschrieben. Die Plattform hat Potenzial, die Anzahl der Elemente zu erhöhen, die DNA Nanomaschinen maßstabsgetreu ein Netzwerk mit mehreren Stufen der Neukonfiguration von ein paar Elemente kontrollieren kann.

In diesem Protokoll beschreiben wir den gesamten experimentellen Prozess der rekonfigurierbare DNA-Akkordeon-Rack 6 mal 6 Maschen. Das Protokoll enthält ein Berechnungsvorgang Regel und Simulation der Strukturen und eine nass-Laborversuch für Synthese und Neukonfiguration. Darüber hinaus ist die Analyse der Struktur mit TEM (Transmissions-Elektronenmikroskopie) und FRET (Fluoreszenz Resonanz Energietransfer) im Protokoll enthalten. Die neuartige Konstruktion und Simulation Methoden fallen in diesem Protokoll unterstützen Forscher, die DNA-Akkordeon-Rack für weitere Anwendungen zu verwenden.

Einleitung

Mechanische Systeme auf Basis von DNA Nanostrukturen oder DNA Nanomaschinen^1,2,3,4,5 sind einzigartig, weil sie komplexe nanoskaligen Bewegung in 2D und 3D in den Nanometer zu produzieren Ångström Auflösung, nach verschiedenen biomolekularen Reize^2,3,6. Durch Anbringen von funktionalen Materialien auf diese Strukturen und ihre Positionen zu kontrollieren, können diese Strukturen in verschiedenen Bereichen angewendet werden. Zum Beispiel wurden DNA-Nanomaschinen für eine molekulare Reaktor⁷, Drug-Delivery-⁸und Nanoplasmonic Systeme^9,10vorgeschlagen.

Zuvor führten wir die rekonfigurierbare DNA-Akkordeon-Rack, die eine 2D oder 3D nanoskaligen Netzwerk Elemente¹¹ (Abbildung 1A) manipulieren kann. Im Gegensatz zu anderen DNA-Nanomaschinen, die nur wenige Elemente steuern, kann die Plattform gemeinsam periodisch angeordneten 2D oder 3D Elemente in verschiedenen Stadien zu manipulieren. Wir erwarten, dass eine programmierbare chemische und biologische Reaktion-Netzwerk oder einem molekularen Computersystem aus unserem System gebaut werden kann durch die Erhöhung der Anzahl der steuerbaren Elemente. Das DNA-Akkordeon-Rack ist eine Struktur, in der das Netzwerk mehrere DNA-Balken mit Gelenken bestehend aus einzelsträngiger DNA (Abbildung 1 b) verbunden ist. Das Akkordeon Rack durch die DNA-Balken erzeugt wird durch die DNS-Sperren neu konfiguriert die hybridisieren auf den klebrigen Teil der Strahlen und ändern Sie den Winkel zwischen den Balken entsprechend der Länge der Brücke Teil der Schleusen (gesperrten Zustand). Darüber hinaus zeigt mehrstufigen Neukonfiguration durch das Hinzufügen von neuen Schleusen nach Bildung des Freistaates durch DNA-Sperren durch Brückenkopf-basierte Strang Verdrängung^12,13abnehmen.

In diesem Protokoll beschreiben wir den Gesamtprozess für Design und die Synthese der rekonfigurierbare DNA-Akkordeon-Rack. Das Protokoll umfasst Konstruktion, Simulation, nass-Laborversuche und Analyse für die Synthese von DNA-Akkordeon Rack 6 mal 6 Maschen und eine Neukonfiguration von diesen. Die Struktur des Protokolls ist das Basismodell der bisherigen Forschung¹¹ und 65 nm von 65 nm Größe, bestehend aus 14 Strahlen. In Bezug auf die Konstruktion und Simulation unterscheidet sich der konstruktive Aufbau des Akkordeon Racks von konventionellen DNA Origami^14,15 (d. h. dicht gepackt). Daher wurden die Gestaltungsregel und molekulare Simulation von traditionellen Methoden modifiziert. Um zu demonstrieren, zeigen wir die Designtechnik mit der modifizierten Ansatz von CaDNAno¹⁴ und die Simulation des Akkordeon Racks mit zusätzliche Skripte OxDNA^16,17 . Schließlich sind beide Protokolle der TEM und Bund für die Analyse der konfigurierten Akkordeon Rack Strukturen beschrieben.

Protokoll

1. Aufbau der 6 von 6 DNA-Akkordeon-Rack mit CaDNAno¹⁴

1. Herunterladen und installieren CaDNAno 2.0 Software¹⁴ um ein DNA-Akkordeon-Rack zu entwerfen (CaDNAno 2.5 ist auch verfügbar auf https://github.com/cadnano/cadnano2.5). Öffnen Sie CaDNAno¹⁴ , und klicken Sie auf das Quadrat-Werkzeug fügen Sie ein neues Bauteil mit einem quadratischen Gitter.
2. Nummer jeder Strahl des Racks, Akkordeon und zeichnen Sie auf der linken Gitter des CaDNAno¹⁴ (Abbildung 2).
3. Klicken Sie auf das Bleistiftwerkzeug und ziehen Sie jeden Strahl auf die richtige Bearbeitungsfeld auf der CaDNAno¹⁴. Pause strahlt jede 32 bp, die für Fugen zwischen benachbarten Balken ist. Legen Sie Grundnahrungsmittel Frequenzweichen in der gleichen Position wie die Gelenke. Verwenden Sie das Tool einfügen und das Buntstift-Werkzeug in CaDNAno¹⁴ zusätzliche einsträngige Frequenzweichen haben Gelenke lassen.
4. Klicken Sie auf das Bleistift-Werkzeug und verbinden Sie die Gelenke zu. Jeder Strahl hat sieben Gelenke.
5. Gerüst Frequenzweichen um die einzelne Schleife die Gerüste zusammenführen, mithilfe der zuvor gemeldete Gerüst routing Algorithmus¹¹zu generieren. Lassen Sie sich nicht die minimale bindende Domäne zwischen Gerüst und Grundnahrungsmittel Stränge werden weniger als 8 bp (Abbildung 3).
6. Platzieren Sie die Gerüste, die nicht verwendet werden in der Baugruppe an den Scheitelpunkten auf gegenüberliegenden Seiten des Akkordeon Racks, gelegen, wie in Abbildung 3dargestellt.
7. Klicken Sie auf das Werkzeug zu brechen. Brechen die Stränge wo Grundnahrungsmittel Stränge kreisförmige oder länger als 60 sind bp.
8. Die DNA-Stränge Sperre zu entwerfen.
   1. Klicken Sie auf das Werkzeug zu brechen. Pause 8 bp ein Grundnahrungsmittel DNA-Region ein klebrigem Teil zu löschen 8 bp ein Grundnahrungsmittel DNA-Region. In der 6 x 6-Akkordeon-Rack gibt es 18 klebrigen Teile (Abbildung 1).
   2. Platzieren Sie Sequenzen, die umgekehrte sind an beiden Enden der Sperre Stränge komplementär zu den klebrigen Teile zu und verbinden sie durch eine Überbrückung Region, bestehend aus Poly T Stränge der gewünschten Länge (Abbildung 1 b).
   3. Für die Neukonfiguration hinzufügen 8 bp Brückenkopf Sequenzen am Ende des DNA sperrt für Strang Verschiebung. Die Brückenkopf-Sequenz verwendet, ist in Tabelle 2.
   4. Bereiten Sie Poly A Stränge, die komplementär zu der Überbrückung Region rückgängig zu machen sind.
   5. Design-Stränge, die komplementär zu der DNA-Schlösser für die Neukonfiguration Experiment rückgängig zu machen sind.
9. Klicken Sie auf die Sequenz-Werkzeug und klicken Sie auf Gerüst DNA. Wählen Sie das Gerüst als standard M13mp18. Klicken Sie auf das Export-Tool und speichern Sie die Sequenz im Csv-Format (Tabelle 1).

(2) die Struktur mit dem OxDNA zu simulieren.

1. Downloaden Sie und installieren Sie der OxDNA^16,17. Die neuesten Quellcode ist verfügbar auf https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/.
2. Stellen Sie Start Konfigurations-Dateien aus der CaDNAno-¹⁴ -Datei mit Python-Skript "cadnano_interface.py", die in der OxDNA^16,-¹⁷ -Paket bereitgestellt wird. Die Nutzung ist wie folgt: 'Python cadnano_interface.py cadnano_file.json sq'. Jetzt werden die Topologie und Konfigurationsdatei generiert.
   Hinweis: Die topologiedatei enthält wie viele Stränge und Nukleotide sind in der Struktur und Informationen über Rückgrat-Backbone Verbindungen zwischen Nukleotiden. Die Konfigurationsdatei enthält allgemeine Informationen wie Zeitschritt, Energie und Boxgröße. Orientierungsinformationen wie Position Vektor, Rückgrat-Base Vektor, Normalenvektor, Velocity und Winkelgeschwindigkeit der Nukleotide ist auch enthalten (Abbildung 4).
3. Ändern Sie die Informationen in der Topologie und Konfiguration-Datei vom CaDNAno¹⁴ zu machen, die echte strukturelle Informationen des Akkordeon Racks zu reflektieren. Alle Balken sind parallel angeordnet, wenn die Topologie und Konfiguration-Dateien von CaDNAno¹⁴ visualisiert werden. Allerdings ist das Akkordeon Rack eine Gitterstruktur, so dass der Abstand zwischen verklebten Nukleotide sind weit für Simulation (Abbildung 5).
   1. Drehen Sie und verschieben Sie jeder Strahl auf die gewünschte Gitterstruktur. Die neun Spalten auf der linken Seite in der Konfigurationsdatei sind der Position Vektor, Rückgrat-Base Vektor und Normalenvektor (Abbildung 4). Um einen Lichtstrahl zu drehen, drehen Sie alle Stellung, Rückgrat-Base und normalen Vektoren mit rotatorischen Transformation. Dann bewegen Sie einen Strahl durch Veränderung des Position Vektors um es zu finden, wie in Abbildung 5dargestellt.
   2. Entspannen Sie die Struktur mit dem Skript in das OxDNA-Paket zur Verfügung gestellt (siehe Beispiel in $oxDNA/Beispiele/RELAX_INITIAL_CONFIGURATION für weitere Informationen).
4. Molekulardynamik-Simulation für 10 Millionen Schritte mithilfe der entspannten Konfigurationsdatei ausgeführt. Die Nutzung ist wie folgt: '. / OxDNA < Eingabe >' speichern Daten alle 5000 oder 10000 Schritte.
5. Visualisierung
   Hinweis: Die Strukturen wurden mit Cogli visualisiert.
   1. Downloaden Sie und installieren Sie die neueste Version von Cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/).
   2. Führen Sie die Cogli mit der Topologie und Konfiguration Dateien aus der OxDNA-Simulation. Die Nutzung ist wie folgt: '. / cogli1 -t < topologiedatei >< Konfigurations-Datei > ".
   3. Verstecken Sie die Box mit der Taste b.

(3) Synthese der Struktur

Hinweis: Die Synthese-Methode wird von der vorherigen Protokoll^15,18angepasst.

1. Erwerben Sie die gestalteten DNA-Klammern bei einem Oligonukleotid-Anbieter.
2. Passen Sie die Konzentration von diesen DNA-Klammern zu 100 μM mit Nuklease-freies Wasser.
   1. Bündeln Sie jeder DNA-Strang, die eine "free State" Struktur in eine Röhre bildet und passen Sie die Konzentration auf 2 μM für jeden Strang.
   2. Pool DNS Sperre Stränge durch Länge und Anzahl der Sperre Orte in Röhren und passen Sie die Konzentration auf 2 μM für jeden Strang. 18, 9 und 4 Sperre Websites dienen. Fügen Sie Poly-A-Stränge, die zu überbrückenden Region bei der gleichen Konzentration sind.
   3. Pool-Stränge, die komplementär zu der DNA umzukehren sind Sperren Stränge durch Länge in Röhren und passen Sie die Konzentration auf 2 μM für jeden Strang.
3. Bereiten Sie MgCl₂ Lösung von 300 nM durch Mischen von 70 μL der Nuklease-freies Wasser und 30 μl 1 μM MgCl₂ Lösung. Bereiten Sie eine 5 x Tris-EDTA-Lösung durch Mischen von 95 μL der Nuklease-freies Wasser und 5 μL der 100 X-Tris-EDTA-Lösung.
4. Fügen Sie 2 μL Heftklammer DNA, 1,1 μl MgCl₂ Lösung, 2 μl Tris-EDTA-Lösung, 7,6 μl der Nuklease-freies Wasser und 7,3 μL Gerüst DNA von denen die Konzentration beträgt 110 nM 20 μL des gemischten Materials zu machen. Setzen Sie die Endkonzentration des Gerüstes DNA auf 40 nM, Heften DNA zu 200 nM, MgCl₂ bis 16 mM und Tris-EDTA-Lösung 0,5 X.
5. Erhitzen Sie schnell gemischte Vorratslösung in einem Thermocycler bis 80 ° C und kühlen bis 60 ° C mit einer Rate von 4 min pro ° C und kühlen von 60 ° C bis 4 ° C mit einer Rate von 40 min pro ° C.

4. Reinigung der Struktur

Hinweis: Die Proben aller Strukturen wurden vor der Analyse gereinigt. In diesem Abschnitt beschreiben wir das Protokoll der PEG Reinigung, vom früheren Literatur¹⁹angepasst ist. Die Probe kann auch durch Gelelektrophorese gereinigt werden, wie im vorherigen Literatur^15,18beschrieben.

1. 5 M NaCl und 100 X Tris-EDTA vorzubereiten.
2. Bereiten Sie Niederschlag-Puffer durch das Mischen von 150 μL der PEG 8000, 500 μL 100 x Tris-EDTA und 101 μL 5 M NaCl und 249 μL der Nuklease-freies Wasser.
3. Bereiten Sie Ziel-Puffer durch das Mischen von 5,5 μl 300 nM MgCl₂ Lösung von Abschnitt 3.3, 10 μl 5 X Tris-EDTA-Lösung von Abschnitt 3.3 und 84,5 μL der Nuklease-freies Wasser.
4. Mix 20 μL der synthetisierten Struktur aus Abschnitt 3 und 20 μL des Niederschlag-Puffer von Abschnitt 4.2. Dann drehen Sie den gemischten bestand bei 16000 X g bei 4 ° c Entfernen des Überstands und Pellet in den Zielpuffer aus Abschnitt 4.3 auflösen.

(5) Neukonfiguration des Akkordeon Racks von einem "freien Staat" zu "Gesperrten Zustand"

1. Die Struktur ohne DNA-Schlösser für die Konfiguration-Experiment zu synthetisieren.
2. Bereiten Sie DNS-Sperre Stränge aus Abschnitt 3.
3. Fügen Sie 2 μL der DNA-Stränge der Sperre der gewünschten Länge in 20 μL der synthetisierten Struktur. Die DNA-Sperre Stränge Konzentration ist fünfmal höher als die Struktur.
4. Inkubation der Probe für 0, 10, 25, 50 oder 100 Minuten zu sehen, wie schnell Neukonfiguration auftritt.
   1. Für die Inkubation von 100 Minuten 30 Minuten Probe bei 50 ° C inkubieren und bis zu 25 ° C mit einer Rate von 0,33 ° C/min langsam abkühlen.
   2. Für die 50-minütige Inkubation Inkubation der Probe bei 50 ° C für 15 Minuten und bis zu 25 ° C mit einer Rate von 0,66 ° C/min langsam abkühlen.
   3. Für die 25 minütige Inkubation 7,5 Minuten Probe bei 50 ° C inkubieren und bis zu 25 ° C mit einer Rate von 1,32 ° C/min langsam abkühlen.
   4. Für die 10 Minuten Inkubation 3 Minuten Probe bei 50 ° C inkubieren und bis zu 25 ° C mit einer Rate von 3,3 ° C/min langsam abkühlen.
   5. Für die 0-minütige Inkubation speichern Sie Muster 4 ° C rechts nachdem Schleusen DNA-Stränge hinzugefügt werden.
5. Direkt nach dem anbringen Schritt rasch Abkühlen der Probe auf 4 ° C zu verhindern, dass unerwünschte Denaturierung.

6. Umgestaltung des Akkordeon Racks aus "Gesperrten Zustand" zu einem "freien Staat"

1. Die Struktur mit DNA-Schlössern der gewünschten Länge für die Konfiguration-Experiment zu synthetisieren.
2. Umgekehrte komplementäre Stränge aus Abschnitt 3 vorbereiten.
3. Fügen Sie 2 μL der Stränge, die komplementär zu der Sperre Stränge der gewünschten Länge in 20 μL der synthetisierten Struktur rückgängig zu machen sind. Die DNA-Sperre Stränge Konzentration ist fünfmal höher als die Struktur.
4. Inkubation der Probe für 0, 12, 60, 120, 240 Minuten zu sehen, wie schnell Neukonfiguration auftritt.
   1. Für die 12, 60, 120, 240 Minuten Inkubation, rasch die Probe auf 40 ° C erhitzen und langsam abkühlen auf 20 ° C für die Zeit, die für jede. Direkt nach dem Trennen Schritt rasch Abkühlen der Probe auf 4 ° C zu verhindern, dass unerwünschte Denaturierung.
   2. Für die 0-minütige Inkubation speichern Sie Muster 4 ° C rechts nach rückwärts komplementäre Stränge hinzugefügt werden.

(7) TEM Imaging

Hinweis: TEM-imaging-Protokoll wurde von früheren Literatur^18,20angepasst.

1. Bereiten Sie 1,25 M NaOH-Lösung durch Mischen von 87,5 μL der Nuklease-freies Wasser und 12,5 μl 10 M NaOH Lösung vor.
2. 50 μL der 2 %-Uranyl-Formiat-Lösung 1 μl 1,25 M NaOH-Lösung hinzufügen.
3. Vortex: die Lösung für 3 Minuten und Zentrifuge bei max. Drehzahl für 3 Minuten. Kaution 3 μL der gereinigten Probe in der Glut entladen TEM Startaufstellung für 3 Minuten und schnell auswaschen mit Filterpapier.
4. 7 μL bereit Uranyl Formiat Lösung für 30 Sekunden zu hinterlegen und schnell auswaschen mit Filterpapier.
5. Messen Sie die Länge und den Winkel der Akkordeon-Struktur durch TEM abgebildet.

(8) Bund-Analyse

1. Verwenden Sie Atto 550 und Atto 647N Farbstoff, wofür die Förster-Entfernung 6,5 beträgt nm. Ersetzen Sie Grundnahrungsmittel 58 und Grundnahrungsmittel 117 in Tabelle 1 mit Gewebekulturen gekennzeichneten Adern. Dann synthetisieren Sie die Struktur mit Gewebekulturen gekennzeichneten Adern durch die in Abschnitt 3 beschriebenen Methode.
2. Die Konzentration der gereinigten Probe zu messen.
3. Normalisieren Sie die Probe 10 nM und Last 50 μL, 384 Mikroplatten gut.
4. Begeistern Sie die Probe mit Donor und Akzeptor Farbstoffe bei 550 nm und messen die Fluoreszenz-Spektrum von 570 nm bis 800 nm mit einem Fluorometer.
5. Die Fluoreszenz-Spektrum der Spender nur Probe auf die gleiche Weise zu messen.
6. Begeistern die Farbstoffe der Probe bei 650 nm und die Fluoreszenz-Spektrum und Messen von 670 nm bis 800 nm. Dies ist zur Messung der Konzentration der Akzeptor.
7. Erhalten Sie die Standardabweichungen durch Wiederholung des gleichen Experiments mit drei Proben, die synthetisiert werden und separat gereinigt.
8. Berechnung der FRET-Effizienz mit dem Verhältnis eine Methode wie beschrieben durch die Gleichung unten²¹.
   
   DA₅₅₀: Akzeptor-Peak-Fluoreszenz-Intensität der Probe mit Donor und Akzeptor bei 550 nm Anregung.
   D-₅₅₀: Fluoreszenz-Intensität an den Akzeptor Emissionsbereich der Spender nur Probe bei 550 nm Anregung.
   DA₆₅₀: Akzeptor-Peak-Fluoreszenz-Intensität der Probe mit Donor und Akzeptor bei 650 nm Anregung.

Ergebnisse

Gestalteten 6 mal 6 DNA Akkordeon Rack wird von den OxDNA^16,17 simuliert und die Ergebnisse sind in Abbildung 6dargestellt. Aus dem Simulationsergebnis bestätigte sich, dass die beabsichtigte Struktur ohne Verzerrung der Struktur gebildet wird.

Die TEM-Bilder in Abbildung 7 sind Bilder der konfigurierten Strukt...

Diskussion

Dieses Protokoll stellt den gesamten Prozess aus Konstruktion, Simulation, Synthese und Analyse von der 2D DNA Akkordeon Grundregal. Das geänderte Design und Simulation Regeln sind beschrieben worden weil standard DNA Origami Design Rule anders, dass die DNA-Akkordeon-Rack zusätzliche Nukleotide an die Frequenzweichen für Flexibilität^14,15hat. Aus diesem Grund erwarten wir, dass das Protokoll verschiedene Forschungen mit DNA-Akkordeon Regale beschleunigen kan...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
M13mp18 Single-stranded DNA	NEB	N4040s
1M MgCl2 Solution	Biosesang	M2001
Tris-EDTA buffer	Biosesang	T2142
Nuclease-Free Water	Qiagen	129114
5M Sodium Chloride solution	Biosesang	s2007
PEG 8000	Sigma Aldrich	1546605
10N NaOH	Biosesang	S2038
Uranyl formate	Thomas Science	C993L42
Thermal cycler C1000	Biorad
Nanodropic 2000	Thermo Fisher Scientific
TEM (LIBRA 120)	Carl Zeiss
Fluorometer Enspire 2300	Perkin-Elmer
Centrifuge	Labogene	LZ-1580