Lentivirale Vektor-vermittelte Gentherapie von Hepatozyten Ex Vivo für autologe Transplantation bei Schweinen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll soll porcinen Hepatozyten Isolierung und ex-Vivo gen Lieferung um Modelle der metabolischen Krankheiten durch autologe Stammzelltransplantation heilen zu beschreiben. Obwohl dieses Modell einzigartige Vorteile, die erfolgreichen Therapie bevorzugen genießt, ist die Anwendung eine relevante Grundlage um weitere Krankheiten und Indikationen.

Zusammenfassung

Gentherapie ist eine ideale Wahl um viele angeborene Fehler des Stoffwechsels der Leber zu heilen. Ex-Vivo, Lentivirale Vektoren haben erfolgreich eingesetzt bei der Behandlung vieler hämatopoetischer Erkrankungen beim Menschen, da ihre Verwendung bietet stabile Transgene Ausdruck durch den Vektor Fähigkeit in das Wirtsgenom integrieren. Diese Methode demonstriert die Anwendung der ex Vivo Gentherapie von Hepatozyten, ein großes Tier Modell des erblichen Tyrosinemia Typ ich. Dieser Prozess besteht aus 1) Isolierung der primäre Hepatozyten von autologen Empfängerin/Tier, 2) ex Vivo gen Lieferung per Hepatozyten Transduktion Lentivirale Vektor mit 3) autologe Transplantation von korrigierten Hepatozyten-Portal Vene Injektion. Erfolg der Methode im allgemeinen stützt sich auf effiziente und sterile Entfernung der Leber Resektion, sorgfältiger Umgang mit der ausgeschnittenen Probe zur Isolierung von lebensfähigen Hepatozyten für wieder anwachsen, hochprozentigen Transduktion der isolierten Zellen ausreichend und aseptische Eingriffe durchweg um Infektionen zu vermeiden. Technisches Versagen bei jedem dieser Schritte führt zu niedrigen Ertrag von lebensfähigen ausgestrahlt Hepatozyten für autologe Transplantation oder Infektion des Tieres Spender/Empfänger. Das Schwein-Modell des menschlichen Typ 1 erbliche Tyrosinemia (HT-1) für diese Vorgehensweise gewählt ist eindeutig eine solche Methode, zugänglicher, wie auch ein kleiner Prozentsatz der Engraftment korrigierten Zellen zur Wiederbesiedlung der Leber mit gesunden Zellen basierend auf einem leistungsstarken führt selektiven Vorteil gegenüber Native-Kranke Hepatozyten. Obwohl dieses Wachstum-Auswahl nicht wahr für alle Indikationen werden, dieser Ansatz ist eine Grundlage für die Expansion in andere Indikationen und ermöglicht die Manipulation dieser Umgebung zu Adresse zusätzliche Krankheiten, sowohl in der Leber und darüber hinaus, während Steuerung für die Exposition gegenüber viralen Vektoren und Gelegenheit für Ziel-Toxizität und Tumorigenität.

Einleitung

Angeborene Fehler der Stoffwechsel der Leber sind eine Familie von Erbkrankheiten, die gemeinsam so viele wie 1 in 800 Lebendgeburten¹betreffen. Viele dieser Krankheiten sind einzelne gen Mängel² und funktional durch die Einführung einer einzigen korrigierten Kopie des betroffenen Gens in einer ausreichenden Anzahl von Hepatozyten³geheilt werden können. Der tatsächliche Prozentsatz der Hepatozyten, die korrigiert werden muss hängt von der Krankheit⁴ und ist weitgehend abhängig von der Art des Proteins, die es kodiert, zum Beispiel ausgeschiedenen Proteine gegen cytoplasmatische. In den meisten Fällen ist Wirksamkeit einer Behandlung für metabolische Krankheit leicht durch das Vorhandensein von Biomarkern, die oftmals auch in der Zirkulation untersucht.

HT-1 ist eine angeborene Fehler der Stoffwechsel der Leber, die durch einen Defekt im Fumarylacetoacetate Hydrolase (FAH)⁵, der letzte enzymatische Schritt in Tyrosin Stoffwechsel⁶entsteht. FAH-Mangel führt zum Build von toxischen Metaboliten in der Leber, die akutes Leberversagen und Tod verursachen können oder bei der chronischen Form der Erkrankung kann dazu führen, dass Zirrhose und hepatozellulären Karzinom. Die Krankheit wird klinisch durch Gabe von 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), ein niedermolekularer Inhibitor eines Enzyms stromaufwärts der FAH in Tyrosin-Stoffwechsel verwaltet. Die Krankheit bietet ein ideales Umfeld, um Gen-Therapie-Methoden zu testen, wie erfolgreiche Korrektur der auch eine kleine Anzahl von Hepatozyten schließlich die Wiederbevölkerung der gesamten Leber mit korrigierten Zellen in kleinen und großen Tiermodellen führt ^{7 , 8}. Dies geschieht, weil korrigiert Zellen haben einen tiefgreifenden Überlebensvorteil gegenüber unkorrigierte Zellen durch die Anhäufung von toxischen Metaboliten in der letzteren. Der Verlust der unkorrigierte Hepatozyten ermöglicht eine selektive Erweiterung korrigierte Hepatozyten entsprechen die Regenerationsfähigkeit der Leber. Behandlung kann leicht verfolgt werden, durch die Messung des Rückgangs der zirkulierenden Tyrosin und Urinspiegel Ebenen nach Transplantation.

Um die invasive Art des Verfahrens, zu rechtfertigen, die eine partielle Hepatektomie enthält, muss das Ziel dieses Ansatzes eine dauerhafte Heilung. Daher werden Replikation inkompetenten Lentivirale Vektoren verwendet, da sie stabil in den Hepatozyten Genom⁹zu integrieren. Bereitstellung des korrigierten Gens an alle Tochterzellen als die Leber wächst und erweitert um den schnellen Verlust der unkorrigierte Zellen zu ersetzen. Dies ist vorteilhaft über Adeno-verbundene Viren (AAV) Vektoren, bestehen in erster Linie als Episomes, die nur auf eine einzelne Zelle Tochter während der Mitose¹⁰ dadurch verlieren jede Wirkung der Therapie in einer Angelegenheit von Wochen übergeben werden können.

Obwohl eine wachsende Zahl von Literatur über die Sicherheit von Lentivirus¹¹, Anliegen unterstützt genotoxische Veranstaltungen gemildert durch die Begrenzung der Transduktion von Wirtszellen zu einer kontrollierten in-vitro- Umgebung. Kostenlose Vektor wird nie systemisch an den Host eingeführt, wenn diese Methode durchgeführt wird, Begrenzung der Exposition gegenüber der Hepatozyten, die mit autologen Transplantation über die Pfortader wieder eingeführt werden.

Dieser Bericht beschreibt die Methode der chirurgischen und ex Vivo Verfahren zum Isolieren von Hepatozyten für Gen-Therapie ex Vivo und anschließende autologe Transplantation¹² für die Behandlung des HT-1 Schwein⁸. Der vollständige Prozess umfasst (1) eine partielle Hepatektomie, das als eine Quelle von Hepatozyten und ein Wachstumsimpulse für die Host Leber, 2) Isolierung der Hepatozyten aus der ausgeschnittenen Leber, gefolgt von ex-Vivo gen Korrektur, und schließlich (3) die Wiedereinführung der dient der korrigierte Hepatozyten zurück in den Host. Das beschriebene Verfahren gilt für alle großen Tiermodellen mit einigen Änderungen, sondern nur die FAH-defizienten Schwein¹³ haben den Vorteil der selektiven Umweltgutachten korrigierte Hepatozyten.

Protokoll

Alle tierische Verfahren wurden wurden nach institutionellen Richtlinien durchgeführt und überprüft und genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) vor der Durchführung der Studie. Hier beschriebene Verfahren wurden auf männlichen und weiblichen großen weißen Bauernhof Schweine (50 % Landrace/50% Large White genetischen Hintergrund) bis zu 3 Monate alt durchgeführt, die gesund und für Chirurgie geeignet erachtet werden.  Die Tiere sind sozial untergebracht, es sei denn, durch institutionelle tierärztliche Versorgung Mitarbeiter als unvereinbar angesehen.  Tiere sind angemessene Höhe der Chow zweimal tägliche und beobachteten klinischen Anzeichen von Pflegepersonal mindestens einmal täglich gefüttert.

1. Vorbereitung für die Operation

1. Verwaltung von 5 mg/kg Telazol und 2 mg/kg Xylazin intramuskulär, Sedierung zu induzieren. Verwalten von Buprenorphin SR subkutan in einer Dosis von 0,18 mg/kg für postoperative Analgesie (voraussichtlich Analgesie von dieser Dosis werden bis zu 72 h). Manuell überprüfen Sie das Tier zur Beantwortung Sedierung zu überprüfen.
2. Einmal sediert, legen Sie einen intravenöse Katheter in eine Vene der peripheren Ohr für pharmakologische Zugang.
3. Verwalten Sie 25 mg/kg intravenös Cefazolin und intramuskuläre 5 mg/kg Ceftiofur präoperativ.
   1. Verwalten Sie normale Kochsalzlösung intravenös um Blutdruck und Herzfrequenz innerhalb der normalen physiologischen Grenzen während des Verfahrens zu halten.
4. Statt einem orogastraler Rohr um den Magen zu dekomprimieren. Endotracheale Intubation mit einer entsprechend großen Endotrachealtubus durchzuführen, stellen Sie sicher die richtige Platzierung durch Kompression der Brust manuell um Ausatmung zu erkennen und dann mechanisch lüften das Tier mit 1 – 3 % Isofluran.
5. Elektrokardiogramm (EKG) führt, Blutdruckmanschette, Temperaturfühler und Pulsoximeter zu überwachen und aufzeichnen Vitalfunktionen zu platzieren. Legen Sie das Tier in Rückenlage, Bauch vom Brustkorb zum Becken mit Betadine scrub und Drapieren Sie steril.
6. Lüften Sie mit 1-3 % Isofluran während des Verfahrens um eine chirurgische Ebene der Narkose aufrechtzuerhalten. Weiterhin Vitalfunktionen auf Änderungen überwachen und Isofluran entsprechend anpassen, um Herzfrequenz auf Pre-Schnitt Ebenen zu erhalten, wenn Blutdruck sinkt dramatisch Isoflurane reduzieren und institutionell zugelassenen Agenten zur Vitalität, wie z. B. Wiederherstellung zu initiieren intravenöse Adrenalin.
   1. Zeichnen Sie auf, Herzfrequenz, Atemfrequenz, Blutdruck und Körpertemperatur auf einen chirurgischen Eingriff-Datensatz zum Nachverfolgen und Verwalten des Tierschutzes gemäß institutsspezifische zu großen Tierschutzstandards gewährleisten.

(2) laparoskopische partielle Hepatektomie

1. Führen Sie erste Einreise Website mit einer offenen Hassen Technik kopfwärts auf den Nabel. Wenn Bauchfell visualisiert wird, stellen Sie sicher eine 12 mm Trokar in die Bauchhöhle. Dieser Port durchlaufen Sie ein 5 mm, 30°, Umfang.
2. Insufflieren Sie den Bauch mit CO₂ bis 15 MmHg. Legen Sie unter direkter Visualisierung mit der laparoskopischen Kamera zwei zusätzliche 5 mm Anschlüsse auf der linken seitlichen Lappen der Leber Triangulation. Genaue Platzierung der Ports hängt von Größe und Anatomie des Tieres.
   1. An diesem Punkt setzen Sie das Laparoskop in einem der 5 mm Anschlüsse.
3. Identifizieren Sie das linke seitlichen Segment der Leber zum Zeitpunkt der großen Riss der linke Lappen. Diese Fissur trennt die medizinische und linken seitlichen Segmente. Die Portal Strukturen zusammen mit der Lebervene entlang dieser Riss mit einem chirurgischen Hefter zu sichern (siehe Tabelle der Materialien). Das Parenchym durch diesen Riss mit sequentiellen Zündungen von den Hefter mit 60, 45 oder 30 mm lange vaskulären Lasten Transekt.
   1. Bei parenchymatösen Resektion abgeschlossen ist, bewerten Sie die Überbleibsel Leber dafür ausreichende Blutstillung. Kontrollieren Sie jede Blutung aus dem Parenchym mit Cautery oder Naht.
4. Abrufen des Leber Abschnitts mit endoskopischen Graspers und eine endoskopische Gewebe Abruf Tasche.
5. Entfernen Sie die Ports und schließen Sie den 12 mm Port Schnitt in drei Schichten mit unterbrochenen Größe 0 Nahtmaterial für die Mittellinie Faszie, eine laufende 2-0 Naht für die tief dermalen Schicht und einer laufenden 4-0 Naht für die Subcuticular Schicht. Die 5 mm-Ports können in einer Schicht mit 2-0 geschlossen werden.
6. Legen Sie einen sterilen Verband auf die Einschnitte (siehe Tabelle der Materialien).
7. Wenn Zellen in weniger als 4 Stunden fertig sein werden, erhalten Sie die Tiere unter Vollnarkose postoperativ bis zum Zeitpunkt der Autotransplantation.
8. Alternativ, wenn Zelle Manipulationen längere Zeit erfordern (z. B. Bildung von Hepatozyten Sphäroide oder längere Transduktion/Auswahl basierend auf einzelne Anwendungen dieser Methode erlauben) erlauben das Tier wieder aus der Narkose und wiederholen Sie die Betäubungsmittel Induktion Schritte vor der Autotransplantation wenn die Zellen bereit sind.

(3) Hepatozyten Isolation

1. Verbinden Sie einer peristaltischen Pumpe mit Perfusion auf warmen Streuung Lösungen (im Wasserbad 43 ° C gepflegt) festgelegt mit Katheter in den großen freiliegenden Gefäßen des Abschnitts Leber platziert werden, sodass Lösung Temperatur 38 ° C mit der Einführung des Gewebes ist. Alle Schläuche, Ausrüstung und Lösungen einzuhalten um sicherzustellen, dass die Zellen für die Transplantation geeignet sind steril.
   1. Prime die Pumpe und Schlauch mit Pro II bis ein Absperrhahn aufgestellt, um zwischen pro I und II pro Lieferung des Gewebes zu wechseln. Wechseln Sie den Absperrhahn in das KGV ich positionieren und prime den Rest der gesetzten Schläuche füllen eine Inline-Blase-Trap komplett um die Einführung zu verhindern Luftblasen in das Gewebe.
2. Bereiten Sie eine saubere quer Schnitt senkrecht auf die hepatische Zirkulation, Querschnitte der Pfortader Zweige zu offenbaren und hepatische Adern zur Katheterisierung.
3. Katheterisieren Sie verfügbaren freiliegenden Adern mit einem eng anliegenden Katheter austreten von dem Perfusat zu vermeiden. Cannulate mindestens 1 Portal und 1 Lebervene um ausreichende Durchblutung des Gewebes zu gewährleisten.
   1. Sicherstellen Sie, dass die Catheter(s) grundiert/freie Luft vor der Platzierung des Katheters in eine Vene.
4. Durchspülen Sie mit warmen pro ich bei 100 mL/min, bewegt das Auslaufrohr aus Ader, Vene alle 30 Sekunden, 1 min. Zyklus durch alle verfügbaren Adern für 15-20 min. Während pro ich setzen Infusion, eine Evakuierung Rohr, das Verfahren Fach in einen Abfallbehälter unter Vakuum zu leeren.
5. 100 mL/min, Radfahren durch die Adern als mit pro ich, für eine Gesamtmenge von 30 min pro II schalten. Pro II Nutzungszeit eine Rückförderpumpe pro II zurück in den Behälter für die Verabreichung, Vorbereitung für das aktive Enzym zu konservieren zu recyceln. Legen Sie die Rückförderpumpe auf weniger als die Abfluss-Pumpe (d. h. 94 mL/min), ohne dabei überschüssige Luft in die Flasche Quelle zurück.
   1. Wenn die Leber Kapsel bricht, kann dieser Zeit reduziert werden.
   2. Wenn die Leber nicht vollständig verdaut wird (bleibt nicht mit sanftem Druck fokale Grübchen) eine zusätzliche 5 min der Perfusion durchgeführt werden kann.
6. Gelegentlich (ca. alle 5 Minuten) dokumentieren Oberflächentemperatur der Blase Falle und/oder Leber zu gewährleisten, die Hepatozyten sind nicht kalt. Wenn die Leber kalt wird (< 35 ° C) erhöhen die Hitze des Wasserbads zur Wiederherstellung der Leber Temperatur näher bis 38 ° C. Die Leber sollte Blanche im weiteren Verlauf der Perfusion.
7. Leber, sterile Platte oder Petrischale für den Transport nach Zelle Kultur Haube zu entfernen. Sterilen Bereich mit einem sterilen Tuch Integrität in die Hepatozyten Verarbeitung weiterhin zu decken.
8. Aussetzen des Leber Abschnitts von sterilen Tuch und tauchen die Leber mit kalten Hepatozyten waschen Medien (HWM). Stören Sie die Kapsel durch Schere am oberen Rand ziehen. Mit sterilen Handschuhen, massieren Sie die Leber um die Hepatozyten in das Medium zu lösen.
9. Filtern Sie die HWM mit Hepatozyten durch sterile Gaze in großen (ca. 200 mL) Zentrifuge Flaschen. Waschen Sie die Hepatozyten durch das folgende Verfahren in dreifacher Ausfertigung, kombinieren die Zelle Pellet aus mehreren Flaschen nach der ersten Wiederfreisetzung (soweit zutreffend):
   1. Zentrifuge bei 50 x g, 5 min, 4 ° C.
   2. Aspirieren und in 150 mL HWM aufzuwirbeln.
   3. Lassen Sie das Pellet in HWM nach der 3^rd -Wäsche.
10. Graf Zellkonzentration mit einem Hemocytometer oder einem anderen Gerät als verfügbar. Diese Zellen sind nun bereit für die ex-Vivo Manipulation von Interesse, einschließlich der Gentherapie, Zellsortierung oder andere Spezialisierung vor Autotransplantation. Endvolumen von HWM kann angepasst werden, um gezielt eine bestimmte Konzentration (Zellen/mL).

4. Hepatozyten Transduktion

1. Aufschwemmen Hepatozyten in Medien (Dulbeccos modifizierten Eagle Medium [DMEM], 10 % fötalen Rinderserum [FBS], Penicillin-Streptomycin, 4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic Säure [HEPES], Dexamethason, epidermalen Wachstumsfaktor [EGF] und NTBC) bei 1 – 2 Million Zellen pro mL in einem konischen Rohr auf Eis.
2. Tauen Sie Lentivirale Vektor bei Raumtemperatur auf und verleihen Sie konischem Rohr auf Eis am Ziel 20 Multiplizität der Infektion (MOI), die Zellen zu binden. Drehen Sie die Zellen bei 4 ° C bei 10 u/min für 90 min der viralen Vektoren an der Zelloberfläche binden.
3. Übertragen Sie Röhren auf 37 ° C für 30-40 min. invertieren, mischen Sie alle 5 Minuten um den Vektor transducing gebundenen Zellen zu erleichtern.
4. Zentrifugieren Sie Zellen bei 50 X g bei 4 ° C für 4 min. Aufschwemmen Zelle Pellet in Kochsalzlösung bei gewünschten Konzentration auf Eis. Wiederholen Sie diese waschen zur Entfernung von jedem ungebundenen Vektor von der Vorbereitung zu gewährleisten.
5. Wenn möglich, Platte ausreichend Aliquote von Zellen (z.B. 500.000 Zellen pro Bohrloch in einem 6 Zellen gut Kultur Platte) auf Tragfähigkeit, Adhäsion, Transduktion Effizienz, etc. zu überprüfen
   Hinweis: Es ist oft nicht möglich, diese Parameter vor dem Autotransplantation, vor allem für taggleiche Verfahren zu beurteilen. Zum Beispiel beschäftigt das hierin beschriebene Verfahren einen unmarkierten Fah cDNA unter der Kontrolle des Alpha-1 antitrypsin Leber-spezifischen Promotors, die nicht ohne weiteres assayable in den Hepatozyten vor der Transplantation war. Jedoch können diese vergoldeten Zellen im Anschluss an die Autotransplantation als Indikator für den Erfolg der Transduktion (d. h. per Western blotting) oder ein Indikator für den allgemeinen Erfolg des Verfahrens geprüft werden.

5. Hepatozyten Transplantation

1. Identifizieren Sie die Pfortader per Ultraschall mit einer 2 bis 5 MHz-Schallkopf. Richten Sie eine 18 G, 5-Zoll-Nadel in Richtung Portal Hauptader proximal zu seiner Gabelung.
2. Beginnen Sie langsam manuelle Infusion von bis 1 x 10⁹ Hepatozyten (ca. 10 g) mit einer Spritze. Monitor Portal Druck während der Transplantation mit einer Infusion-Katheter.
   1. Wenn Portal Druck mehr als 8 MmHg über dem Ausgangswert erhöhen, pause Infusion und ermöglichen den Druck auf den Ausgangswert zurück.
   2. Wenn Portal Druck nicht zur Grundlinie nach dem Anhalten wieder Infusion für fünf Minuten, die Infusion einzustellen.
3. Nach der Transplantation und Katheter entfernen verwenden des Ultraschalls auf das Vorhandensein von thrombotischen Ereignisse zu bewerten und fließen in die Pfortader weiterleiten.

6. postoperative Erholung und Pflege

1. Unterliegt eine richtige Recovery-Bereich bewegen Sie und beobachten Sie, bis das Tier vollständig ambulante, Überwachung von Herzfrequenz, Sauerstoffsättigung und Temperatur des Körpers alle 15 – 30 min. Maintain Körpertemperatur mit warme Decken oder eine Luft erwärmt Wrap Bedarf ist.
2. Verwalten Sie Omeprazol 1 mg/kg oral täglich (bis zum Ende der Studie) zur Verringerung der Chancen der gastrischen Geschwürbildung, die auftreten können mit Anfällen von Appetitlosigkeit.
3. Postoperativ, das Tier ist durch Labor- und Tierärzten überwacht und erfordert in der Regel keine zusätzliche Schmerzmittel getrennt von der präoperativen Buprenorphin-Dosis.  Wenn Anzeichen von Stress/Schmerzen durch qualifizierte tierärztliche Versorgung Personal (Einschnitt Bewachung, Appetitlosigkeit, Lethargie) eingehalten werden, können entzündungshemmende Mittel (z.B. Carprofen) verabreicht werden.

7. Rezepte

1. In diesem Protokoll verwendeten Rezepte finden Sie unter Tabelle 1 .

Reagenz	HWM	Reagenz	Pro ich (10 X)	Pro II (10 X)
Williams'-E Pulver (g/L)	10.8	NaCl (g/L)	83	39
Nahco33 (g/L)	2.2	KCl (g/L)	5	5
HEPES (g/L)	2.6	HEPES (g/L)	24	240
Pen/Strep (100 X, mL/L)	10	EGTA (g/L)	9.5	-
Fetale Rinderserum (mL/L)	100	N-Acetyl-L-Cystein	8	8
pH	7.3	(N-A-C, g/L)
		Nitroglycerin (mL/L)	5	5
		CaCl2 2 H2O (g/L)	-	7
		Kollagenase D (mg/mL)	-	0,2
		pH	7.4	7.6

Tabelle 1: Rezepte für Lösungen in Hepatozyten Isolation von Leber Abschnitte verwendet.

Ergebnisse

Die Leber Resektion und autologe Transplantation sind schematisch in Abbildung 1dargestellt. In einer repräsentativen Gruppe von 5 Schweine, die hepatischen Resektion unterzogen, hatten die meisten Erträge von > 1 x 10⁹ Hepatozyten mit ca. 80 % Lebensfähigkeit (Tabelle 2), bietet viele Zellen für jede Art von gewünschten Manipulationen, einschließlich gen Therapie. Nachfolgende Kultur nicht transplantiert Teil der vorbereitet...

Diskussion

Dieser Bericht beschreibt eine ex Vivo autologe gen Therapieansatz um ein porcinen Modell HT-1 zu heilen. Es geht um eine partielle Hepatektomie, gefolgt von ex-Vivo Hepatozyten Isolation und Transduktion von isolierten Hepatozyten mit Lenti Virus tragen das korrigierende Transgen. Korrigierte autologe Hepatozyten sind dann zurück zum FAH mangelhaft Tier durch die Pfortader⁸transplantiert. Obwohl die beschriebenen Verfahren auf alle großen Tiermodellen mit einigen Änderungen a...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Yecuris	20-0027
12 mm Trocar	Covidien	B12STS
5 mm Trocar	Covidien	B5SHF
Endo Surgical Stapler 60	Covidien	EGIA60AMT
Endo Surgical Stapler 45	Covidien	EGIA45AVM
Endo Surgical Stapler 30	Covidien	SIG30AVM
Endo catch bag	Covidien	173050G
0 PDS	Ethicon	Z340H
2-0 Vicryl	Ethicon	J459H
4-0 Vicryl	Ethicon	J426H
Dermabond	Ethicon	DNX12	Sterile Dressing
Williams’-E Powder	Gibco	ME16060P1
NaHCO3	Sigma Aldrich	S8875-1KG
HEPES	Fisher	BP310-1
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Fetal Bovine Serum	Corning	35-011-CV
NaCl (g/L)	Sigma Aldrich	S1679-1KG
KCl (g/L)	Sigma Aldrich	P3911-500G
EGTA (g/L)	Oakwood Chemical	45172
N-acetyl-L-cysteine	Oakwood Chemical	3631
(N-A-C, g/L)	Sigma Aldrich	A9165-100G
CaCl2 2H2O (g/L)	Sigma Aldrich	223506-500G
Collagenase D (mg/mL)	Crescent Chemical	17456.2
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Corning	15-013-CV
Dexamethasone	Fresenius Kabi	NDC6337
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0314