Induktion und Bewertung von Inzucht Kreuze mit Ant, Vollenhovia Emeryi

Zusammenfassung

In diesem Protokoll werden Methoden für die Durchführung von Inzucht Kreuze und zur Beurteilung des Erfolgs eines dieser Kreuze, die Ameise Vollenhovia Emeryibeschrieben. Diese Protokolle sind wichtig für Experimente zur Verständnis der genetischen Grundlagen von Geschlecht Bestimmung Systeme in Hymenoptera.

Zusammenfassung

Die genetischen und molekularen Komponenten der Geschlechtsbestimmung Kaskade haben ausgiebig in die Honigbiene, Apis Mellifera, hymenopteran Modellorganismus untersucht. Jedoch ist wenig bekannt über die Bestimmung des Geschlechts Mechanismen in anderen nicht-Modell hymenopteran Taxa, wie Ameisen gefunden. Aufgrund der Komplexität der Lebenszyklen, die in hymenopteran Spezies entwickelt haben, ist es schwer zu warten und experimentelle Kreuzungen zwischen diesen Organismen im Labor durchzuführen. Hier beschreiben wir die Methoden für die Durchführung von Inzucht Kreuze und für die Beurteilung des Erfolgs eines diese Kreuze in Ant Vollenhovia Emeryi. Inzucht im Labor mit V. Emeryiinduzieren, ist relativ einfach, wegen der einzigartigen Biologie der Arten. Insbesondere dieser Art produziert androgenetischen männlichen und weiblichen geschlüpften ausstellen Flügel Polymorphismus, die Identifikation der Phänotypen im genetischen Kreuze vereinfacht. Darüber hinaus ist die Bewertung des Erfolgs der Inzucht einfach, Männchen kontinuierlich hergestellt werden können, durch Inzucht Kreuze, während normale Männchen nur während einer genau definierten Paarungszeit im Feld angezeigt. Unser Protokoll ermöglichen den Einsatz V. Emeryi als Modell der genetischen und Molekulare Grundlagen der Sex-Bestimmung-System in Ameisenarten zu untersuchen.

Einleitung

Eusozialen Hautflügler Taxa, wie Ameisen und Bienen, haben eine diploide geschlechtermittlung System entwickelt, bei denen Personen, die an einem oder mehreren komplementären Geschlechtsbestimmung heterozygot sind (CSD) Loci Weibchen, während diejenigen geworden, die Homo- oder Hemizygous sind werden Sie Männchen (Abb. 1A)¹.

Genetischen und molekulare Komponenten der Geschlecht-Bestimmung-Kaskade beteiligt sind gut in die Honigbiene, Apis Mellifera, ein hymenopteran Modell Organismus^2,3,4untersucht worden. Vergleichende Genomik Untersuchungen deuten darauf hin, dass Ameisen und Bienen viele vermeintliche homologe in dem Geschlecht Bestimmung Weg, wie das erste Geschlecht Bestimmung gen, Csd⁵teilen. Beweise für die funktionelle Erhaltung dieser Homologen fehlt allerdings noch bei Ameisen.

Um dieses Problem zu beheben, Inzucht-Linien müssen entwickelt werden, da sie wichtig für genetische und molekulare Studien sind. Es ist jedoch schwer zu warten und Durchführung von experimentellen Kreuzungen zwischen diesen Organismen im Labor aufgrund der Komplexität der Lebenszyklen, die entwickelt haben.

Hier verwenden wir Vollenhovia Emeryi als Modell um zu untersuchen, die genetischen und Molekulare Grundlagen der Sex-Bestimmung-System in Ameisen^6,7. Die Inzucht-Linien dieser Art wurden bisher für Verknüpfung Zuordnung der quantitative Trait Loci (QTL) für Züge, die im Zusammenhang mit Geschlechtsbestimmung zum ersten Mal in Ameisen⁶entwickelt. Darüber hinaus wurde die molekulare Geschlechtsbestimmung Kaskade untersuchten⁷. Diese Sorte hat eine ungewöhnliche Reproduktionssystems entwickelt, die Gynogenesis und Androgenese (Abbildung 1B)^8,9beschäftigt. Die meisten neuen Königinnen und Männchen klonal aus der mütterlichen und väterlichen Genome, bzw. entstehen. Darüber hinaus sind Arbeitnehmer und einige Königinnen sexuell produziert⁸. Diese Reproduktion-System ist besonders gut geeignet für genetische Studien, weil die Inzucht Kreuze mit sexuell hergestellt Königinnen produziert und Männchen eine klassische Rückkreuzung genetisch entspricht sind. Da sich sexuell erzeugte Königinnen morphologisch von Königinnen produziert von mütterlichen Genome¹⁰ (Abbildung 1B), wird Durchführung und Auswertung von Inzucht Kreuze stark vereinfacht mit dieser Methode.

In diesem Artikel, die Methoden für die Einrichtung von Labor Kolonien für Kreuzung Test kreuzt Anwendung von Inzucht mit voll-Sib Paare und Bewertung des Erfolgs der diese Kreuze mit Genotypisierung der Kolonie Mitglieder und sezieren von männlichen Nachkommen Genitalien sind in V. Emeryibeschrieben.

Unabhängig von der Reproduktion System beschäftigt ist die Anwendung von Inzucht Kreuze oft wichtiger erster Schritt in jeder Untersuchung Sex Bestimmung Systeme in der Hautflügler. Zum Beispiel zeigt das fast völlige Fehlen von diploiden Männchen nach 10 Generationen von voll-Sib Paarung im Labor in Cardiocondyla Obscurior, Abwesenheit von CSD Locus¹¹. Es ist möglich, die Anzahl der CSD Loci aus dem Verhältnis der Männer in Inzucht Kreuze^6,12,13produziert Vorhersagen.

Protokoll

1. Feld Erfassung und Pflege der V. Emeryi Kolonien im Labor

Hinweis: Nester der V. Emeryi findet man in faulenden Baumstämmen und gefallenen verfallenden Baum Branchesin sekundären Wäldern in ganz Japan. Diese Sorte zeigt zwei Arten von Kolonien, d. h. (1) Kolonien produzieren nur Long-winged Königinnen und (2) Kolonien produziert vor allem kurze geflügelten Königinnen neben kleinen Anzahl von langen geflügelten Königinnen^8,14. In diesem Protokoll sammelten wir die letztere Art von Kolonien in der Präfektur Ishikawa, Japan.

1. V. Emeryi Kolonien im frühen Sommer zu sammeln.
   Hinweis: Um während der Paarungszeit sexuellen Einzelpersonen in ausreichender Zahl zu erhalten, sind Kolonien mit mehr als 300 Personen bevorzugt.
2. Übertragen Sie die Ameise Exemplare von gesammelte Äste auf eine künstliche Gips-Nest mit einer Glasabdeckung über eine Absauganlage (Abbildung 2, Links).
3. Kolonien in das künstliche Nest bei 25 ° C unter einer 16:8 h Hell/Dunkel-Zyklus zu erhalten. Bieten Sie Leitungswasser mit einer Waschflasche zu Gips nass.
   1. Fügen Sie ca. 100 mg trocken Cricket Pulver eingewickelt in Alufolie und ein brauner Zucker Wasser gefüllten Tipp (20 µL Tip) jeden zweiten Tag bis neue geschlüpften (F₁ geflügelte-Queens und F₁ Männchen) entstehen.

2. Versuchslabor Kreuze

Hinweis: Neue geschlüpften beginnen sich vom Spätsommer bis Herbst (Abbildung 3). Lange-winged Königinnen sind sexuell produziert, und kurz-winged Königinnen werden klonal hergestellt und haben das mütterliche Genom (Abbildung 1). Verwenden Sie lange geflügelte Königinnen und Männchen für Inzucht Kreuze.

1. Um Personen aus bewegen zu stoppen, legen Sie Kolonien in einem konstanten Umwelt Raum bei 4 ° C für 15 Minuten.
2. Mitte der Beine 30 Arbeiter mit Pinzette stereoskopische Mikroskop zu entfernen und in neue kleinere Putz Nest (Abbildung 2, rechts) für Inzucht Kreuze überführen.
   Hinweis: Die Beine werden entfernt, um die heutigen Arbeitnehmer von den Arbeitern zu unterscheiden, die durch die anschließende Inzucht Kreuze produziert wird.
3. Fügen Sie ca. 3-4 Larven oder Puppen in ein Gips-Nest mit Arbeiter.
   Hinweis: Arbeitnehmer zeigen exploratorische Aktivität in F₀ Königinnen-weniger Kolonie. Larven oder Puppen können effektiv diese Arbeitnehmer und neue geschlüpften in der Mitte der Kolonie während der Überfahrt Test ziehen. Infolgedessen halten der experimentellen Kolonie in der Nähe der normalen Kolonie.
4. Übertragen Sie eine Königin mit langen Flügeln und einem Mann in ein Gips-Nest in Schritt 2.3 für Inzucht Kreuze vorbereitet.
5. Halten Sie Kolonien bei 25 ° C unter ein 16:8 h-Hell/Dunkel-Zyklus mit Nahrung und Wasser versorgt werden, wie unter 1.3, bis die Königin ihre Flügel verlieren und legen ihre Eier.
   Hinweis: Dies dauert eine Woche bis zu einem Monat.
6. Überprüfen Sie jeden Tag das experimentelle Kolonie unter dem stereoskopische Mikroskop. Nach Durchführung von Inzucht zwischen der F-₁ -Nachwuchs kreuzt, können Eier unter dem stereoskopische Mikroskop beobachtet werden.
7. Nach der F₁ Königin beginnt der Eiablage, F₁ Männchen und Larven oder Puppen aus dem Nest in Schritt 2.3 hinzugefügt, um zu vermeiden, Mischen von F-₁ Generation (Männchen und Weibchen für Inzucht Kreuze verwendet) und die F-₂ -Generation (Nachkommen zu entfernen hergestellt aus Inzucht Kreuze).
   Hinweis: Wenn in der Kolonie gibt es wenige Männer, ist es möglich, Inzucht Kreuze mit einem Männchen und 1 bis 3 Königinnen in der gleichen experimentellen Kolonie zu induzieren.
8. Halten Sie Kolonien unter der gleichen Conditionsas beschrieben in 1.3, bis F₂ Nachkommen entstehen.
   Hinweis: Transfer F₁ Königin und F₂ Nachkommen in neue größere Putz Nest (Abbildung 2, Links) zur langfristigen Aufbewahrung der Kolonie.

3. Bewertung der Inzucht Erfolg

1. DNA-Extraktion und Genotypisierung der elterlichen Generation (F₀)
   1. Ein Bein einer F₀ Königin mit Pinzette entfernen und das Bein auf einer 1,5 mL reaktionscup mit 100 µL Chelat-Agent übertragen.
   2. Unter dem stereoskopische Mikroskop sezieren eines weiblichen Bauches in Glasschale gefüllt mit 300 µL Reinstwasser mit Pinzette und isolieren die samentasche, enthält das Sperma aus begatteten Männchen.
   3. Ziehen Sie das Gewebe der samentasche und isolieren Sie das Sperma aus dem Gewebe der weiblichen Insekten Stifte verwenden.
      Hinweis: Zur Erleichterung der Spermien Extraktion aus der samentasche aufbewahren weiblichen Exemplare in 100 % EtOH für mehr als einen Tag vor der Präparation.
   4. Mit einer Mikropipette übertragen Sie das Sperma in einem 1,5 mL reaktionscup mit 100 µL Chelat-Agent.
   5. Inkubieren Sie Proben von F₀ Königin und Spermien im Schritt 3.1.1 und 3.1.3, jeweils vorbereitet, bei 95 ° C für 20 min. Flash Zentrifugieren die reaktionscup und Lagerung bei 4 ° C.
   6. An anderer Stelle beschrieben Genotyp alle Proben mit Methode⁴.
2. DNA-Extraktion aus dem paar Ameisen zur Inzucht Kreuze (F₁)
   1. Nach Bestätigung der Ei-Produktion durch das Sib F₁ Königin verpaart, extrahieren Sie die DNA der Königin mit ihren Schuppen Flügeln oder Mid Einbein- und Genotyp mit derselben Methode beschrieben in Abschnitt 3.1 genannten.
   2. Extrahieren von DNA von F₁ Männchen mit nur einem Bein und Genotyp mit gleichen in Abschnitt 3.1 oben beschriebene Methode.
      Hinweis: Proben in 100 % speicherbar EtOH vor DNA-Extraktion und DNA in Chelat-Agent für zwei Monate bei 4 ° c gelagert werden können
3. Beurteilung der männlichen Fruchtbarkeit bei Männern produziert von Inzucht Kreuze
   Hinweis: Diploide Männchen produziert von Inzucht Kreuze sind oft steril.
   1. Inneren Geschlechtsorgane in eine Glasschale mit 400 µL PBS-Lösung mit Pinzette zu sezieren.
   2. Entfernen Sie PBS zu, und fügen Sie 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit einer Mikropipette.
   3. Befestigen Sie das Gewebe durch Inkubation in PFA für 30 min bei Raumtemperatur (15-25 ° C).
   4. Waschen Sie Gewebe 5 Mal mit 400 µL PBS mit einer Mikropipette.
   5. Verdünnen Sie die 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Lösung bis 1 µg/mL in PBS.
   6. Entfernen Sie PBS zu und fügen Sie ca. 300 µL dieser verdünnten Färbelösung DAPI Gewebe.
   7. Inkubieren Sie 15 min unter dunklen Zustand bei Raumtemperatur (15-25 ° C).
   8. Gewebe 5 Mal mit 400 µL PBS waschen und Gewebe auf Mitte der Folie Glas mit Pinzette zu übertragen.
   9. Montieren Sie Gewebe auf Montage mittlerer enthaltenden Tetramethylrhodamine TRITC konjugiert Phalloidin.
   10. Beobachten Sie Proben durch konfokale Laser-scanning-Mikroskop 20 X oder 63 X-Objektive verwenden.
   11. Verwenden Sie 405 nm Anregung Laser und einem Hybrid-Detektor bei 410-530 nm für DAPI-Erkennung.
   12. Verwenden Sie 561 nm Anregung Laser und einem Hybrid-Detektor bei 565-650 nm für TRITC Erkennung.
   13. Verwenden Sie eine Scan-Geschwindigkeit von 400 Hz (400 Zeilen/s) mit einer Auflösung von 1024 × 1024 Pixel.
   14. Die Aufnahmen Sie mit Hilfe einer Softwareplattform.

Ergebnisse

Mit F₀ bis F₁ Generationen Mikrosatelliten-Analyse ergab, dass Inzucht Kreuze erfolgreich produziert wurden (Abbildung 4)⁶. Infolgedessen wurden begatteten Königinnen von Inzucht Kreuze, innerhalb eines Monats nach der experimentellen Kreuzung Kolonien erhalten. Eine Viertel (27,1 ± 8,91 % SD) aller Nachkommen (F₂) von der Inzucht Kreuze war männlich, während der Rest weiblich (Arbeitnehmer und eine...

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt die Protokolle, die verwendet werden können, zu induzieren Inzucht Kreuze und das Auftreten von Inzucht in die Ameise V. Emeryizu bewerten. In den Experimenten ist Genotypisierung der Individuen für Kreuze verwendet muss sichergestellt werden, dass Inzucht Kreuze erfolgreich waren. Allerdings ist die Wirksamkeit dieser Kreuzung Tests deutlich wie diploide Männchen das ganze Jahr produziert werden können, während haploide Männchen nur im Herbst im Feld und Labor-^6...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaster powder	N/A	N/A	Any brand can be used
Charcoal, Activated, Powder	Wako	033-02117,037-02115
Slide glass	N/A	N/A	Any brand can be used
Dry Cricket diet	N/A	N/A	Any brand can be used
Brown shuger	N/A	N/A	Any brand can be used
Styrene Square-Shaped Case	AS ONE	Any size	Size varies by number of ants
Incbator			Any brand can be used
Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B	TAITEC	0014035-000
1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom	WATSON	131-715CS
Ethanol (99.5)	Wako	054-07225
Stereoscopic microscope	N/A	N/A	Any brand can be used
Forseps	DUMONT	0108-5-PO
Chelex 100 sodium form	SIGMA	11139-85-8
Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4	TaKaRa	T9181
Paraformaldehyde	Wako	162-16065
-Cellstain- DAPI solution	Dojindo Molecular Technologies	D523
ABI 3100xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems		Directly contact the constructor formore informations.
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
Leica HyDTM	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Directly contact the constructor formore informations.