Kristallstruktur des N-terminale Domäne des Ryanodin-Rezeptoren von Plutella xylostella

Zusammenfassung

In diesem Artikel beschreiben wir die Protokolle der Proteinbestimmung Ausdruck, Reinigung, Kristallisation und Struktur der N-terminalen Domäne des Ryanodin-Rezeptoren von Diamondback Moth (Plutella Xylostella).

Zusammenfassung

Entwicklung von potenten und effiziente Insektiziden gezielt Insekt Ryanodin-Rezeptoren (RyRs) wurde von großem Interesse im Bereich der landwirtschaftlichen Schädlingsbekämpfung. Bis heute mehrere Diamide Insektizide targeting Pest, die RyRs in den Handel gebracht worden sind, generieren, die jährlichen Umsatz von 2 Milliarden US-Dollar. Aber Verständnis für die Wirkungsweise von RyR Zielversionen Insektiziden ist begrenzt durch den Mangel an strukturellen Informationen über Insekt RyR. Dies schränkt im Gegenzug Verständnis für die Entwicklung von Insektizid Widerstand in Schädlinge. Die Diamondback Moth (DBM) ist eine verheerende Pest zerstören Kreuzblütler Kulturen weltweit, die auch berichtet wurde, Widerstand gegen Diamide Insektizide zu zeigen. Daher ist es von großer praktischer Bedeutung, neuartige Insektizide, die Ausrichtung der DBM RyR, vor allem auf eine Region, die anders als die traditionelle Diamide-Bindungsstelle zu entwickeln. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die N-terminale Domäne von RyR von DBM strukturell zu charakterisieren. Die Röntgen-Kristallstruktur wurde gelöst durch molekulare Ersatz mit einer Auflösung von 2,84 Å, die zeigt, ein Beta-Kleeblatt Falten Motiv und eine flankierende Alpha-Helix. Dieses Protokoll kann in der Regel für den Ausdruck, Reinigung und strukturelle Charakterisierung von anderen Domänen oder Proteine angepasst werden.

Einleitung

Ryanodin-Rezeptoren (RyRs) sind spezifische Ionenkanäle, die die Permeation von Ca^{2 +} -Ionen über den sarkoplasmatischen Retikulum (SR)-Membranen in den Muskelzellen zu vermitteln. Daher spielen sie eine wichtige Rolle in der Erregung Kontraktion Kupplung Prozess. In seiner funktionalen Form RyR montiert wie ein Homo-Tetramer mit einer Molekülmasse von > 2 MDa mit jeder Untereinheit, bestehend aus ~ 5000 Aminosäurereste. Bei Säugetieren, gibt es drei Isoformen: RyR1 - Skelettmuskulatur Typ, Herzmuskel Typ RyR2- und RyR3-ubiquitär in verschiedenen Geweben¹ausgedrückt.

Bei Insekten gibt es nur eine Art von RyR, das Muskel- und Nervensystem Gewebe²ausgedrückt wird. Insekt RyR ist ähnlicher Säugetier RyR2 mit einer Sequenz-Identität von etwa 47 %³. Diamide Insektizide targeting RyR Lepidoptera und Coleoptera entwickelt und vermarktet von Großunternehmen wie Bayer (Flubendiamid), DuPont (Chlorantraniliprole) und Syngenta (Cyantraniliprole). Seit relativ kurzer Zeit sind Diamide Insektizide eines der am schnellsten wachsende Klasse von Insektiziden geworden. Derzeit haben die Verkäufe von diesen drei Insektizide jährlich 2 Milliarden US-Dollar mit einer Wachstumsrate von mehr als 50 % seit 2009 (Agranova) überschritten.

Jüngste Studien haben die Entwicklung von Resistenzen bei Insekten nach wenigen Generationen der Nutzung dieser Insektizide^4,5,6,7,8berichtet. Die Resistenzmutationen in der transmembrane Domäne des RyRs aus der Diamondback Moth (DBM), Plutella Xylostella (G4946E, I4790M) und die entsprechenden Positionen in Tomaten-Leafminer, Tuta Absoluta (G4903E, I4746M) zeigen, dass die region könnte Diamide Insektizid Bindung beteiligt sein, da diese Region bekannt ist kritisch für die Anspritzung von Channel^4,8,9. Trotz umfangreicher Forschung in diesem Bereich bleiben die genauen molekularen Mechanismen der Diamide Insektizide schwer. Darüber hinaus ist unklar, ob die Resistenzmutationen Interaktionen mit Diamides direkt oder allosterically betreffen.

Frühere Studien haben berichtet, die mehrere Domänen RyR Säugetierarten und Struktur in voller Länge Säugetier-RyR1 und RyR2 durch Röntgen-Kristallographie und Kryo-Elektronenmikroskopie, bzw.^{10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21} . Aber bisher keine Struktur des Insekts RyR wurde berichtet, das verbietet uns vom Verständnis der molekularen Feinheiten der Rezeptor-Funktion sowie die molekularen Wirkmechanismen Insektizid und Insektizid Resistenzentwicklung.

In diesem Manuskript präsentieren wir eine generalisierte Protokoll für die strukturelle Charakterisierung der N-terminale β-Kleeblatt-Domäne des Ryanodin-Rezeptoren von Diamondback Moth, zerstörerischen Schädling infiziert Kreuzblütler Kulturen weltweit²². Das Konstrukt wurde nach den veröffentlichten Kaninchen RyR1 NTD Kristall Strukturen^23,24, Cryo-EM Strukturmodellen^16,17,18,19, entwickelt. ^{20 , 21}. Dies ist die erste hochauflösende Struktur für Insekt RyR, die zeigt des Mechanismus für die Anspritzung Kanal und stellt eine wichtige Vorlage für die Entwicklung der artspezifischen Insektizide mit Struktur-basierte Wirkstoffdesign gemeldet. Für die Strukturaufklärung beschäftigten wir Röntgen-Kristallographie, die als "Goldstandard" für Protein Strukturaufklärung an in der Nähe von atomarer Auflösung gilt. Obwohl die Kristallisation unberechenbar und arbeitsintensiv ist, wird dieser Schritt für Schritt-Protokoll den Forschern helfen, zum Ausdruck bringen, zu reinigen und zu anderen Domänen von Insekten RyR oder andere Proteine im Allgemeinen zu charakterisieren.

Protokoll

1. Gen-Klonieren, Proteinexpression und Reinigung

1. PCR DNA entspricht Protein des Interesses zu verstärken (1-205 Rückstände von DBM RyR, Genbank gem. keine. AFW97408) und Klon in Haustier-28a-HMT Vektor durch Ligation-unabhängige Klonen (LIC)²⁵. Dieser Vektor enthält ein Histidin-Tag, MBP-Tag und ein TEV Protease-Spaltstelle am N-Terminus¹⁵.
   1. Entwerfen Sie LIC Primer für die Amplifikation des Zielgens mit LIC-kompatiblen 5' Erweiterungen:
      Nach vorne LIC-Primer:
      5' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3'
      Rückwärts LIC-Primer:
      5' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3'
   2. Kombinieren Sie die Reaktionskomponenten (50 μL): 1 μl DNA-Templates (100 ng/μl), 1 μL forward Primer (10 μM), 1 μL der rückwärts-Primer (10 μM), 0,5 μL der DNA-Polymerase (NEB), 5 μl 10-fach Reaktion-Puffer, 1 μl dNTP (25 mM) , 40,5 μl RNase frei DdH₂O.
      1. Legen Sie das Reaktionsgemisch in einer PCR-Maschine und führen Sie das folgende Programm.
      2. Bei 95 ° C für 3 min inkubieren, und führen Sie dann 30 Zyklen (95 ° C für 30 s, 58 ° C für 15 s, 72 ° C für 1 min). Bei 72 ° C für 5 min inkubieren Sie und halten Sie dann bei 4 ° C.
      3. Die gesamte Reaktion Mischung (50 μl) auf ein 2 % Agarosegel laufen und mit einem Gel Extraction Kit extrahieren. Protokoll des Herstellers zu folgen.
   3. Ligatur-unabhängige Klonen (LIC)
      1. Führen Sie SspI Verdauung (60 μL): 20 μL der Vektor-DNA (50 ng/μl), 6 μl 10 x Reaktion Puffer, 4 μL der SspI und 30 μl DdH₂O. Inkubation bei 37 ° C für 3 h laufen die gesamte Reaktion auf 1 % Agarose-Gel mischen und mit einem Gel Extraction Kit extrahieren. Protokoll des Herstellers zu folgen.
      2. T4-DNA-Polymerase Behandlung des Vektors führen und DNA einfügen. Kombinieren Sie die folgenden: 5 μl Vektor oder Insert DNA (50 ng/μl), 2 μL der 10 x T4 DNA-Polymerase-Puffer, 1 μL der dGTP (25 mM) für Vektor oder 1 μL der dCTP (25 mM) für Einsatz DNA, 1 μL von DVB-t (100 mM), 0.4 μl des T4 DNA-Polymerase (LIC-qualifiziert) , und 9,6 μL DdH₂O. Incubate Reaktionen bei Raumtemperatur für 40 min. Hitze inaktivieren Enzym bei 75 ° C für 20 Minuten.
         Hinweis: Die LIC Vektor und Einfügen DNA müssen in separaten Reaktionen behandelt werden.
      3. Führen Sie der LIC Glühen Reaktion. Kombinieren Sie die folgenden: 2 μL der T4-behandelten Einsatz DNA, 2 μL der T4-behandelten LIC Vektor-DNA. Inkubieren Sie Reaktion bei Raumtemperatur für 10 min.
2. Verwandeln Sie BL21 (DE3) E. Coli Zellen mit dieses rekombinante Plasmid.
   1. Kompetente Zellen (50 μL in Mikro-Zentrifugenröhrchen) auf Eis auftauen.
   2. Fügen Sie ca. 1 μl (50 ng) des Plasmids in die Röhre. Mischen Sie die Zellen und die DNA durch sanft streichen die Röhre 2 – 3 Mal. Legen Sie den Schlauch für 20 min auf Eis.
   3. Erhitzen Sie Schock bei 42 ° C für 40 S. Ort das Rohr auf dem Eis wieder für 2 min. Add 1 mL der Raumtemperatur LB Medien am Rohr.
   4. Ort der Mischung Rohr im Shaker 250 u/min bei 37 ° C für 45 min. verteilt 150 – 200 µL der Mischung auf die Auswahl-Platten. Drehen Sie die Platte und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
3. Wählen Sie eine einzelne Kolonie und die Kultur der Zellen in 100 mL 2YT Medium mit 50 µg/mL Kanamycin bei 37 ° C über Nacht. Am nächsten Morgen, 1 L 2YT Medium mit 50 µg/mL Kanamycin mit 10 mL der Nacht Kultur zu impfen und Inkubation bei 37 ° C Shaker Inkubator an 250 u/min, bis die OD₆₀₀ ~ 0,6 erreicht. Danach induzieren die Kultur mit IPTG in einer Endkonzentration von 0,4 mM und wachsen für eine weitere 5 h bei 30 ° C.
4. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 8.000 X g für 10 min bei 4 ° C, die Zellen zu sammeln und jeden 10 g-Zellen in 40 mL Lyse-Puffer (10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl, 10 mM β-Mercaptoethanol, 25 μg/mL Lysozym, 25 μg/mL DNase Aufschwemmen 1 mM PMSF).
   1. Stören sie durch Ultraschallbehandlung bei 65 % Amplitude für 8 min mit 1 s ein und 1 s aus. Entfernen Sie die Zellenrückstand durch Zentrifugation bei 40.000 X g für 30 min bei 4 ° C. Den Überstand von 0,22-μm-Filter auf der Durchreise zu filtern und in die Probenschleife laden.
5. Reinigen Sie des Fusionsproteins, Spalten Sie das Tag und wieder reinigen Sie das Zielprotein.
   1. Reinigen des Fusionsproteins über Ni-NTA-Spalte (Bindung Puffer: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl; Elution Buffer: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl, 500 mM Imidazol) und durch ein Reinigungssystem mit einem linearen Farbverlauf von 20-250 mM Imidazol zu reinigen.
   2. Spalten der eluierten Zielprotein mit TEV Protease (01:50 Verhältnis) über Nacht bei 4 ° C.
   3. Reinigen die Spaltung Reaktionsmischung mittels Amylose Harz Spalte (Bindung Puffer: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl; Elution Buffer: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl, 10 mM Maltose) und Ni-NTA-Spalte, die Tag und TEV Protease zu entfernen. Das Zielprotein werden im Durchflussverfahren Bruch der beiden Spalten.
   4. Dialyse der Probe gegen Dialyse-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,8, 50 mM KCl, 10 mM β-Mercaptoethanol, die Salzkonzentration zu reduzieren. Reinigen Sie die Probe auf einem Anion-Austausch-Spalte (Bindung Puffer: 10 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM β-Mercaptoethanol; Elution Buffer: 10 mM Tris-HCl pH 8,8, 1 M KCl, 10 mM β-Mercaptoethanol) durch einen linearen Verlauf von 20-500 mM KCl im Elution Puffer.
   5. Als letzten Schritt in den Reinigungsprozess das Protein mit zentrifugalen Konzentrator (10 kDa MWCO) zu konzentrieren und Spritzen in eine Superdex 200 26/600-Gel-Filtration-Spalte, die Homogenität zu überprüfen.
6. Untersuchen Sie die Reinheit des Proteins, indem Sie auf eine 15 % SDS Seite ausgeführt.
   Hinweis: Alle Spalten werden auf ein Protein-Reinigungsanlage mit einer verbindlichen Flussrate von 2 mL/min und eine Elution Durchflussmenge von 4 mL/min mit Ausnahme von Gel-Filtration bei 1 mL/min. ausgeführt werden.

2. Protein Vorbereitung und Kristallisation

1. Konzentrieren der gereinigten Protein Probe 10 mg/mL mit Zentrifugal-Konzentrator (10 kDa MWCO) und Buffer Tausch auf Kristallisation Puffer vor der Lagerung bei-80 ° C.
2. Kristallisation Screening durchführen (Verhältnis 1:1, 200 nL von Protein und 200 nL Reservoir Puffer) durch die Sitzung fallen Dampf-Diffusion-Methode bei 295 K mit mehreren Kristallisation Kits mit einer automatisierten Flüssigkeit Umgang mit Robot-System in einem 96-Well-Format.
   Hinweis: Wir nutzten Kits von molekularen Dimensionen und Hampton Forschung und der Greif automatisiert liquid Handling-System.
3. Versiegeln Sie die Kristallisation 96-Well-Platte um Verdunstung zu vermeiden und ermöglichen die Gleichgewichtherstellung der Protein-Tropfen mit dem Reservoir-Puffer. Halten Sie dann die Platten in den Kristall-Inkubator bei 18 ° C.
4. Überprüfen Sie die 96-Well-Platten, die in regelmäßigen Abständen mit einem Lichtmikroskop Kristallbildung und Wachstum zu überwachen.
5. Zur Unterscheidung von Proteinkristallen von Salzkristallen, verwenden Sie einen Protein-Farbstoff. Fügen Sie 1 µL Farbstoff zum Drop-Ziel. Warten Sie ca. 1 h und unter dem Mikroskop beobachten. Die Proteinkristallen werden blau.
6. Nutzungsbedingungen der positiven Kristallisation (1,5 M Ammoniumsulfat, 0,1 M Tris pH 8.0) zur weiteren Optimierung der Kristalle mit hängenden drop-Dampf-Diffusion-Methode in 24-Well-Platten.
   1. PH-Wert von 7,0 bis 8,5 mit 0,5 pH-Einheit-Intervall jeden Schritt zu optimieren. Optimieren Sie Konzentration von Ammoniumsulfat von 1,2 M bis 1,7 M mit 0,1 M Intervall jeden Schritt. (In unserem Fall war die beste Voraussetzung, die Herstellung von großen plattenförmigen Kristallen 0,1 M HEPES pH 7.0 und 1,6 M Ammoniumsulfat)

3. Crystal Montage, Röntgen-Datenerfassung und Strukturaufklärung

1. Montieren Sie Kristalle in einer Cryoloop und Blitz-Cool in flüssigem Stickstoff mit Reservoir-Lösung mit 20 % Glycerin als Cryo-Schutzmittel. Legen Sie die Kristalle in Unipuck für Lagerung und Transport.
2. Vor dem Bildschirm Proteinkristallen mit einer Rigaku Inhouse Röntgen-Diffractor. Wählen Sie die besten mit den höchsten Auflösungen für die Datenerfassung am Synchrotron Einrichtungen (unseres Datensatzes wurde von BL17U1 in Shanghai Synchrotron Radiation Facility erhoben).
   1. Verwenden Sie die Strahlrohr Steuerungssoftware BluIce²⁶ zu montieren und in der Mitte der Kristalle durch automatische oder manuelle Zentrierung Funktion. Führen Sie Test-Aufnahmen um Daten-Collection-Strategie, einschließlich dem Starten Winkel, Belichtungszeit, Detektor-Abstand, Rahmenbreite und Zahlen zu bestimmen.
   2. Dataset entsprechend zu sammeln (erhobenen 180 Frames mit 1 s Belichtungszeit, 1° Rahmenbreite und der Detektor-Abstand von 350 mm).
3. Index, zu integrieren und skaliert das Dataset mithilfe HKL2000 Suite²⁷. Führen Sie die Spitze-Suchfunktion, die Beugung Spots zu finden und dann index die Spots und wählen Sie die richtigen Raum-Gruppe. Skalieren Sie nach Peak-Integration das Dataset mit der richtigen Fehlermodell und speichern Sie die Ausgabedatei .sca.
4. Lösen Sie die Phase-Problem, indem molekulare Ersatz mit Phaser²⁸ in PHENIX²⁹.
   1. Berechnen Sie die mögliche Kopienzahl des Protein-Moleküle in der asymmetrischen Einheit von Xtriage³⁰.
   2. Suchen Sie die richtige Struktur-Vorlagen mit hoher Identität und strukturelle Sequenzähnlichkeit als das Zielprotein mit bekannten Strukturen von Literatur oder die Modelle von Struktur Vorhersage Server wie Phyre2³¹ erzeugt (Wir verwendeten Kaninchen RyR1 NTD als Ein Suchmodell, PDB-ID 2XOA).
   3. Führen Sie Phaser mit Beugung-Datendatei, die Template-Struktur-Datei und die Protein-Sequenz, um die Lösung zu finden.
5. Führen Sie AutoBuild³² in PHENIX²⁹ , das erste Modell mit der Ausgabedatei von Phaser und die Sequenz-Datei aus dem Zielprotein zu generieren.
6. Manuell die Struktur in der modifizierten experimentelle Elektronendichte mit Coot³³ erstellen und verfeinern mit phenix.refine³⁴ in iterativen Zyklen.
7. Das letzte Modell mit der Validierungs-Tools in PHENIX¹⁸zu validieren.

Ergebnisse

Reinigung

Die N-terminale Domäne des DBM RyR wurde als ein Fusionsprotein mit einem Hexahistidine Tag, ein MBP-Tag und ein TEV Protease-Spaltstelle ausgedrückt. Wir folgten eine fünf-Stufen-Reinigung-Strategie um ein sehr reines Protein, geeignet für Kristallisation Zweck zu erhalten. Anfangs war Fusionsproteins aus der löslichen Fraktion von Zelle lysate durch Ni-NTA-Spalte (HisTrap HP) gereinigt. Als nächstes Fusionsprotein...

Diskussion

In diesem Artikel beschreiben wir das Verfahren um rekombinant express, reinigen, kristallisieren und bestimmen die Struktur der DBM RyR NTD. Für die Kristallisation ist eine entscheidende Voraussetzung um Proteine mit hohen Löslichkeit, Reinheit und Homogenität zu erhalten. In unserem Protokoll haben wir pET-28a-HMT Vektor verwenden, denn es enthält ein Hexahistidine Tag und MBP-Tag, die genutzt werden könnte, für Reinigung, eine höhere Falte Reinheit zu erhalten. Darüber hinaus die MBP-Tag hilft in der Löslich...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET-28a-HMT vector			This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strain	Novagen	69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL)	GE Healthcare	45-000-325
Amylose resin column	New England Biolabs	E8021S
Q Sepharose high-performance column	GE Healthcare	17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO)	Millipore	UFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column	GE Healthcare	28-9893-36
Automated liquid handling robotic system	Art Robbins Instruments	Gryphon
96 Well CrystalQuick	Greiner bio-one	82050-494
Uni-Puck	Molecular Dimensions	MD7-601
Mounted CryoLoop - 20 micron	Hampton Research	HR4-955
CryoWand	Molecular Dimensions	MD7-411
Puck dewar loading tool	Molecular Dimensions	MD7-607
Nano drop	Thermo Scientific	NanoDrop One
Crystal incubator	Molecular Dimensions	MD5-605
X-Ray diffractor	Rigaku	FRX
PCR machine	Eppendorf	Nexus GX2
Plasmid mini-prep kit	Qiagen	27104
Gel extraction kit	Qiagen	28704
SspI restriction endonuclease	NEB	R0132S
T4 DNA polymerase	Novagen	2868713
Kanamycin	Scientific Chemical	25389940
IPTG	Genview	367931
HEPES	Genview	7365459
β-mercaptoethanol	Genview	60242
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall LYNX 6000
Sonnicator	Scientz	II-D
Protein purification system	GE Healthcare	Akta Pure
Light microscope	Nikon	SMZ745
IzIt crystal dye	Hampton Research	HR4-710
Electrophoresis unit	Bio-Rad	1658005EDU
Shaker Incubator	Zhicheng	ZWYR-D2401
Index crystal screen	Hampton Research	HR2-144
Structure crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-01
ProPlex crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-38
PACT premier crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-29
JCSG-plus crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-37