In-vitro- Test zur Untersuchung der Aggregation von Tau-Protein und Drogen-Screening

Zusammenfassung

Die Tau-Aggregation-Assay beschrieben in dieser Handschrift imitiert die erwarteten Features der in Vivo Tau Fehlfaltung und Aggregation.

Zusammenfassung

Aggregation von Tau-Protein und Bildung von gekoppelten spiralförmigen Fäden ist ein Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit und andere Tauopathies. Im Vergleich zu anderen Proteinen assoziiert mit neurodegenerativen Erkrankungen, die gemeldeten in-vitro- Aggregation-Kinetik für Tau-Protein sind weniger konsistent präsentieren eine relativ hohe Variabilität. Hier beschreiben wir die Entwicklung einer in-vitro- Aggregation Assays, die die erwarteten Schritte verbunden mit Tau Fehlfaltung und Aggregation in Vivoimitiert. Der Test verwendet die längste Tau-Isoform (huTau441) die N-terminale sauren Beilagen sowie vier Mikrotubuli binden Domänen (MBD) enthält. Die Aggregation in Vitro ausgelöst durch Zugabe von Heparin und kontinuierlich von Thioflavin T Fluoreszenz in einem 96 gut Mikrotestplatte Format gefolgt. Die Tau-Aggregation-Assay ist hoch reproduzierbare zwischen verschiedenen Brunnen, Durchläufe und Chargen des Proteins. Die Aggregation führt zu Tau PHF-ähnliche Morphologie ist sehr effizient bei der Aussaat der Bildung von de Novo fibrillären Strukturen. Neben seiner Anwendung bei der Untersuchung des Mechanismus der Tau Fehlfaltung und Aggregation ist der aktuelle Test ein robustes Werkzeug für das screening von Drogen, die die Pathogenese der Tau stören könnten.

Einleitung

Alzheimer-Krankheit ist eine verheerende Neurodegenerative Erkrankung, die durch die Anhäufung von extrazellulären senilen Plaques der aggregierten Amyloid Beta¹ histopathologisch definiert ist und intrazelluläre neurofibrillären Verschlingungen mit aggregiert hyperphosphoryliertem Tau Protein². Physiologische Tau ist Monomere und präsentiert als sechs einzigartige Isoformen mit 0-2 N-terminal-Einsätze und 3 oder 4 Mikrotubuli binden Domänen^3,4 durch Alternatives Spleißen und durchschnittlich 2-3 Phosphorylations entstehen. Es wird vermutet, dass Hyperphosphorylierung, Fehlfaltung und selbständige Aggregation in fibrillary Strukturen die Schlüsselelemente in Tau-Pathogenese als krankhaft veranlagten dementen Personen^{5,6 bilden}.

Die aggregierten neurofibrillären Tau Verwicklungen sind ein Markenzeichen für Anzeige, sondern auch für andere Tauopathies, einschließlich Frontotemporal lobar Degeneration (FTLD), Pick Krankheit, progressive Supranuclear Lähmung (PSP), Fronto-temporalen Demenz (FTD) und PV altersbedingte Tauopathie (Teil)². Aus Sicht der biochemischen Verständnis des Mechanismus der Tau Fehlfaltung und Aggregation könnte Aufschluss über den pathologischen Prozessen zugeordnet AD und andere Tauopathies. Neben dem wissenschaftlichen Aspekt sind robuste in-vitro- Aggregation-Assays wertvolle Werkzeuge für das Screening der Droge Kandidaten^7,8,9,10. Es wird vermutet, dass die Aggregation von Tau eine Keimbildung abhängigen Polymerisation Prozess (NDP)^11,12,13,14folgt. Die NDP-Kinetik ist sigmoidale und beginnt mit einer energetisch ungünstigen Keimbildung Schritt folgte eine schnelle energetisch downhill-Aggregation-Prozess.

Im Gegensatz zu anderen Amyloidogenic Proteinen, einschließlich des Prion-Proteins, Amyloid Beta und α-Synuclein Tau aggregiert nicht spontan unter physiologischen Bedingungen und auch extreme pHs oder hohen Temperaturen sind nicht förderlich für die Aggregation¹⁵. Dies ist wahrscheinlich auf die Hydrophylic Interaktionen in der Tau-Aggregation-Schnittstelle vorhanden. Jedoch aggregiert Tau effizient bei physiologischen Konzentrationen, wenn Induktoren wie Heparin¹⁶ oder anderen Polyanions^17,18 verwendet werden.

Frühere Bemühungen, in-vitro- Tau-Aggregation-Assays eingerichtet haben etwas Licht auf die Details der Tau Fehlfaltung und Aggregation, aber sie kamen hinter dem imitiert, was geglaubt wird, um die in-Vivo -Tau-Aggregation-Kinetik werden. In den meisten Fällen fehlte die Tau-Aggregation-Kinetik die anfängliche Verzögerung Phase mit Tau Keimbildung verbunden. Dies könnte die Folge der Verwendung von sehr hohen Tau Proteinkonzentrationen, Präsenz von Aggregaten in den Start Tau Protein Vorbereitungen und/oder Nutzung von Tau Fragmente mit viel höhere Aggregation Neigung als physiologischer voller Länge Tau gewesen sein Eiweiß^{19,20,21,22,23}. Des weiteren frühere Studien nicht die Reproduzierbarkeit und Robustheit Aspekt der Tau Aggregation Kinetik eingegangen.

Hier beschreiben wir eine robuste in-vitro- Tau Aggregation Probe, die die wichtigsten Merkmale der eine Keimbildung abhängigen Polymerisation mit einer anfängliche Verzögerung Phase entspricht der Tau Nukleation, gefolgt von einer exponentiellen Wachstumsphase imitiert. Darüber hinaus die generierte rekombinante Tau-Aggregate sind fibrillären in der Natur und haben einen extrem hohen Ausgangswerten Potenz. Der Test ist sehr reproduzierbar auch zwischen Tau Chargen und stellt ein wertvolles Werkzeug für Aggregation-Hemmer auf den Bildschirm.

Protokoll

(1) Reagenz Vorbereitung

1. Reaktion-Puffer
   1. Bereiten Sie Reaktion Puffer: 0,5 mM DÄMMUND mit PBS-Puffer, pH 6,7 durch auflösen DÄMMUND Trockenpulver (MW = 286.65 g/Mol) in PBSstock Lösung, pH 7.4.
      Hinweis: Die Anwesenheit von DÄMMUND ist durch Überbrückung Aggregation Studien mit Wildtyp-Tau-Protein enthält Cysteine. In das aktuelle Protokoll DÄMMUND dient nur zur Einstellung des pH-Wertes von PBS von 7,4 auf 6,7 und spielt keine Rolle bei der Regulierung Redox-Reaktionen.
   2. Gründlich mischen und die Lösung durch einen sterilen 0,22 μm Pore Größe PES Membranfilter filtern.
   3. Aliquoten und bei-80 ° c.
   4. Tauwetter auf der Bank und stabilisiert bei RT vor Gebrauch.
2. huTau441
   1. Entfernen Sie huTau441 (für Protein-Expression und Reinigung siehe Apetri Et al. ²⁴) von-80 ° c Gefrierschrank.
   2. Tauwetter auf der Bank und equilibrate auf Raumtemperatur (RT).
   3. Spin-Rohr mit Protein-Vorrat für 5 min bei 12.000 x g bei 20-25 ° c um Luftblasen zu beseitigen.
   4. Messen der Konzentration der huTau441by Absorption bei 280 nm mit einem Aussterben Koeffizienten von 0,31 mL mg^-1cm^-1
3. Thioflavin T
   1. Bereiten Sie 500 μM Thioflavin T (ThT) Stammlösung durch Auflösen von 10 mg Trockenpulver ThT (MW = 318.86 g/Mol) in 35 mL Reaktion Puffer.
   2. Gut durchmischen, Vortex 3 Mal für 20 Sekunden mit maximaler Geschwindigkeit und die Lösung durch einen sterilen 0,22 μm Pore Größe PES Membranfilter filtern.
   3. Konzentration zu bestimmen, durch Absorptionsmessungen an 411 nm mit einem Aussterben Koeffizienten von 22.000 M^-1 cm^-1 und passen Sie ThT Konzentration bis 500 μM. Bei RT vor Licht geschützt aufbewahren. Bereiten Sie alle 2 Monate frisch.
4. Heparin
   1. Bereiten Sie frische 55 μM Heparin-Lösung durch Auflösen von 1 mg HMW Heparin Trockenpulver (MW = 17-19 kDa) in 1 mL Reaktion Puffer bei RT
   2. Kräftig schütteln und Vortex 2 Mal für 5 Sekunden.
   3. Filtern Sie die Lösung durch einen sterilen 0,20 μm Pore Größe PES Membranfilter (Spritze).

(2) Dauerbetrieb ThT Aggregation Assay ein Multimode Mikrotestplatte Leser

Hinweis: Die Reaktion auf huTau441-Aggregation-Kinetik in einem kontinuierlichen Modus (automatische Messungen) zu überwachen ist ThT Farbstoff hinzugefügt. Obwohl die Reaktion von einem regelmäßigen Fluorometer verfolgt werden kann mit einem konventionellen Küvette, die manuelle Art der Operation schränkt die Häufigkeit der Messungen und beeinträchtigt die Genauigkeit der kinetischen aufgezeichneten Kurven. Aus diesem Grund wird ein automatische Multimode Mikrotestplatte Leser verwendet.

1. Gerät einrichten
   1. Schalten Sie den Computer und den Multimode Mikrotestplatte Leser. Lassen Sie das Gerät 10 Minuten lang zu stabilisieren.
   2. Starten Sie die Software und erstellen ein Protokoll.
      1. Wählen Sie den Protokolltyp: standard-Protokoll (Datenreduktion erfolgt unabhängig für jede Platte).
      2. Stellen Sie die Temperatur bei 37 ° c und wählen Sie Preheatment bevor Sie fortfahren das Protokoll aus.
      3. Festlegen der kinetischen Flucht: Laufzeit 50 h / Messintervall: 15 min.
      4. Orbital Schütteln bei 425 cpm (3 mm) im kontinuierlichen Modus eingestellt.
      5. Wählen Sie die Lesemethode: Fluoreszenz Intensität Endpunkt/Kinetik - Monochromatoren Wellenlängen: Erregung 440 nm (20 nm Bandbreite) / Emission 485 nm (20 nm Bandbreite) - Optik position: Top - Normal Speed - lesen Höhe: 4,50 mm
      6. "Start" die Verwendung des erstellten Protokolls ausführen. Benennen Sie das Experiment, wählen Sie das Ziel der neu erstellten Datei und erlauben Sie das Instrument, um vorab auf gewünschte Temperatur equilibrate.
2. Spontane huTau441 Umwandlung
   1. Die Reaktion Probe in einem 1,5 mL Röhrchen vorbereiten. Einsatz 200 μL Mischung pro Reaktion und mindestens 4 Wiederholungen (Reaktionsvolumen für 4 Wiederholungen = 800 μl).
   2. 800 μl Reaktion Probe (bei 4 Wiederholungen) mit 15 μM huTau441, 8 μM Heparin und 50 μM ThT. Start durch Mischen das Protein mit der Reaktion Puffer, Heparin und ThT dazugeben und mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter 5 Mal. Einhaltung der angegebenen Reihenfolge für Reagenz Zusatz.
   3. Spin-Proben bei 12.000 x g und 25 ° c für 5 min um Luftblasen zu beseitigen.
   4. Verzichten 200 μL der Reaktion Probe pro Bohrloch in 96-Well-Mikrotiterplatten (96-Well schwarz solid Mikrotestplatte, Brunnen-Volumen 360 μL, flachen Boden). Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
   5. Versiegeln Sie Mikrotestplatte um Verdunstung zu vermeiden.
   6. Mikrotestplatte in Multimode Mikrotestplatte Leser und beginnen Sie Messungen.
   7. Entfernen Sie nach Abschluss des Experiments von der Ausrüstung und exportieren Sie Daten nach einem Datenverarbeitungs-Software.
3. Qualitäts-Check der Konvertierung, Samen-Kollektion und Lagerung.
   1. Die Versiegelung von der Platte zu entfernen und bündeln der verschiedenen Wiederholungen in 1,5 mL-Tuben. Mischen Sie gut die aggregierte Probe in den Vertiefungen durch Pipettieren oben und unten 2 Mal vor es zu sammeln. Aggregate sind in der Regel auf der Unterseite des Brunnens zu hinterlegen.
   2. Mischung gründlich in 1,5 mL tube durch nach oben und unten 5 Mal pipettieren und 10-20 μl auf ein Glimmer-Oberfläche für die Analyse der Aggregate von AFM (für weitere Details siehe Apetri Et Al. zu verzichten ( ²⁴).
   3. Ernten Sie die Aggregate durch Drehen der 1,5 mL Tube von 20,000 x g und 4 ° c für 1 Stunde. Aggregate bilden ein Pellet.
   4. Trennen Sie und analysieren Sie überstand von S-MALS, das Fehlen von Monomeren Tau in der Probe zeigt eine erfolgreiche Konvertierung zu Aggregaten (für weitere Details siehe Apetri Et Al. bestätigen ( ²⁴).
   5. Beschriften Sie die 1,5 mL Röhrchen mit der verbleibenden Aggregate (Pellet), erste huTau441 Proteinkonzentration und Probenvolumen angibt. Snap frieren die Aggregate und bei-80 ° c lagern.
4. Gesetzte Reaktion
   1. HuTau441 Aggregate von-80 ° c Gefrierschrank zu entfernen. Fügen Sie das Volumen der Reaktion Puffer auf dem Etikett (Erstmuster Volumen) angegeben und lassen Sie den Schlauch zu RT Aufschwemmen der Aggregate durch pipettieren und ab 5 bis 8 Mal stabilisieren.
   2. Beschallen Sie die aggregierte Probe. Für eine 200 μl Probe (15 μM huTau441), auf Eis mit einem 1/8" Microtip beschallen (aus 100 μL bis 10 mL) für einen Gesamtzeitraum von 15 s mit Pulse von 1 s und Pausen von 2 s bei 30 % Amplitude (Sonikator 250 Watt). Re equilibrate Probe, RT
      Hinweis: Die Beschäftigten Beschallung Bedingungen führen zu einer homogenen Bevölkerung von Tau Fibrillen mit einer Länge von 20-50 nm²⁴.
   3. Die Reaktion Probe in 1,5 mL Tuben vorbereiten. Einsatz 200 μL Mischung pro Reaktion und mindestens 4 Wiederholungen (Reaktionsvolumen für 4 Wiederholungen = 800 μl).
   4. 800 μl Reaktion Probe mit 15 μM huTau441, 8 μM Heparin und 50 μM ThT. Start durch Mischen das Protein mit der Reaktion Puffer, Heparin und ThT dazugeben und mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter 5 Mal. Einhaltung der angegebenen Reihenfolge für Reagenz Zusatz.
   5. Spin-Proben bei 12.000 x g und 25 ° c für 5 min um Luftblasen zu beseitigen.
   6. 200 μL der Reaktion Probe pro Bohrloch in 96-Well (96-Well schwarz solid Mikrotestplatte, Brunnen-Volumen 360 μL, flachen Boden) zu verzichten. Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
   7. Homogenisieren Sie gründlich die vorgeformten Fibrille Probe von sich wiederholenden Up und down Pipettieren (5 Mal) und jeweils auch der Betrag, der den gewünschten Prozentsatz der Samen hinzu. Für ein 200 μL gut Gesamtvolumen ist 2 μL der vorgeformten Samen Zusatz 1 % (V/V). Mix von oben und unten Pipettieren 3 Mal beim Hinzufügen zu dem Brunnen und Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
   8. Versiegeln Sie Mikrotestplatte um Verdunstung zu vermeiden.
   9. Mikrotestplatte in Multimode Mikrotestplatte Leser und beginnen Sie Messungen.
   10. Entfernen Sie Platte von Geräten und exportieren Sie Daten in eine Tabelle.

Ergebnisse

Rekombinante huTau441 mit den C291A und C322A Mutationen und N-terminale seine C-terminalen C-Tags zum Ausdruck gebracht und gereinigt wie zuvor beschrieben²⁴. Die huTau441 Chargen sind hochreine als visualisierte auf SDS-PAGE und nahezu 100 % Monomeren wie S-MALS (Abbildung 1) bewertet. Die Reaktion erfolgte kontinuierlich durch ThT Fluoreszenz mit einem multimode Mikrotestplatte Reader, die Aggregation von 15 µM huTau441 wurde durch die Zugabe von 8 µM HMW Heparin induzierte. Die Erregung Wellenlänge war 440 nm (Bandbreite 20 nm) während Emission bei 485 gemessen wurde nm (Bandbreite 20 nm). Der Test ist sehr reproduzierbar, mit Ergebnissen aus 10 einzelnen Brunnen wird praktisch nicht zu unterscheiden (Abbildung 2A). Die Morphologien der ThT positive huTau441 Aggregate wurden nach 50 h von AFM bewertet. Aggregierte hutau441 ist eine homogene Mischung aus fibrillären Strukturen ähnlich gemeldeten ex Vivo Morphologien (Abbildung 2 b) unterschiedlicher Länge. Darüber hinaus enthält die endgültige Reaktionsmischung nicht Monomer, schlägt eine vollständige Umwandlung zu Aggregaten, dargestellt durch S-MALS Messungen (Abbildung 2). Die Kinetik der huTau441 Aggregation im unabhängigen Durchläufe sind sehr ähnlich wie ähnliche sigmoidale Kurven und nisht zu unterscheidend Lag und Wachstum Phasen (Abbildung 3) betont. Die hohe Reproduzierbarkeit wird beibehalten, wenn verschiedene Chargen des Proteins verwendet werden (Abbildung 4). Darüber hinaus sind vorgeformte huTau441 Aggregate sehr effizient bei der Rekrutierung von Tau Monomer und Induktion der Bildung von de-Novo -Tau-Aggregaten. Beträge, die der vorgeformten Tau Aggregate so niedrig wie 0,0025 % (V/V) sind in der Lage, Keimbildung und Trigger Generation von de Novo Fibrillen (Abbildung 5) zu umgehen.

Abbildung 1: rekombinante huTau441 ist Monomere und hochreinen. (A) Reinheit Bewertung unter denaturierenden Bedingungen auf einem 4-12 % SDS-PAGE Gel einschließlich Molekulargewicht standard Protein Ladder (kDA) (Spur 1); Durchströmung von der letzte C-Tag Affinität Reinigung Schritt (Bahn 2); Spalte Waschen Bruchteil (Spur 3), huTau441 Protein Peak vor (Bahn 4) eluiert und nach Puffer tauschen (Bahn 5), beziehungsweise). (B) S-MALS Analyse der huTau441. Protein zeigt > 99,9 % Monomere mit einer molaren Masse von 51 kDa und enthält keine Aggregate oder Fragmente. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Aggregation von rekombinanten huTau441 ist sehr reproduzierbar und quantitativ führt zu fibrillären Strukturen. (A) Kinetik der Heparin induzierte huTau441 Aggregation in 96 gut Mikrotestplatte Format von ThT Fluoreszenz kontinuierlich überwacht. Konzentrationen von huTau441 und Heparin sind 15 µM und 8 µM. Die 10 Einzelkurven zur Umwandlung des gleichen Protein Batch in zehn Vertiefungen der gleichen Mikrotestplatte entsprechen und zeichnen sich durch eine durchschnittlich (mit SD) Lag-Phase von 14,2 ± 0,38 h und t₅₀ von 18,8 ± 0,40 h. kinetische Daten war ausgerüstet mit einer 5-Parameter Logis- C-Kurve mit einer linearen Abnahme der obere Asymptote. Lag-Phase und t-₅₀ wurden durch Interpolation zwischen den Sollwerten durch lineare Regression berechnet. Lag-Phase errechnet sich die 3 % Erhöhung des ThT-Fluoreszenz-Signals. Kurve passende und zusammenfassende Statistiken stammen mit IBM SPSS Statistics Version 20.0.0.2. (B). Tau Aggregate PHF-ähnlichen Morphologien zu zeigen, wie durch AFM Bildgebung bei 50 h; (C). S-MALS Analyse der Monomere huTau441 (t = 0 h) und der Überstand des Reaktionsgemisches nach Abschluss der Reaktion (t = 50 h). Zum Zeitpunkt von 50 h war das Reaktionsgemisch für 1 h bei 20.000 X g und 4 ° c und der führte Überstand auf S-MALS injiziert zentrifugiert. Das Verschwinden des Monomer Peak bestätigt die vollständige Zusammenfassung der Tau. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: der Tau-Aggregation-Test zeigt hohen Reproduzierbarkeit zwischen unabhängigen Durchläufe. Die beiden Platten Anzeigen von vier einzelnen Kinetik Spuren für spontane huTau441 Aggregation gesammelt in zwei unabhängigen Experimenten mit der gleichen Charge von huTau441 Protein. Konzentrationen von huTau441 und Heparin sind 15 µM und 8 µM. Kinetik zeichnen sich durch eine (mit SD) durchschnittliche Verzögerung von 12,2 ± 0,18 h und t₅₀ von 17,8 ± 0,8 h (Ausführung 1) und 11,6 ± 0,52 h und t₅₀ von 17,8 ± 0,23 h (Run 2), beziehungsweise. Kinetische Daten wurde mit einem 5-Parameter logistische Kurve mit einer linearen Abnahme der obere Asymptote ausgestattet. T-₅₀ wurden durch Interpolation zwischen den Sollwerten durch lineare Regression berechnet. Lag-Phase errechnet sich die 3 % Erhöhung des ThT-Fluoreszenz-Signals. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: der Tau-Aggregation-Test zeigt hohen Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Chargen des huTau441 Proteins. Jedes Panel zeigt vier repliziert entspricht einer bestimmten huTau441 Charge. Die Aggregation von jeder Charge folgte im unabhängigen Experimenten. Konzentrationen von huTau441 und Heparin sind 15 µM und 8 µM. Aggregation Kinetik entspricht den vier einzelnen Tau Chargen sind gekennzeichnet durch eine durchschnittlich (mit SD) Lag-Phase von 15,3 ± 0,38 h und t₅₀ von 21,1 ± 0,46 h (Batch 1); Lag-Phase von 12,5 ± 0,07 h und t₅₀ von 19,8 ± 0,34 h (Batch 2); Phase von 15,1 ± 0,34 h und t₅₀ von 21,9 ± 0,86 h (Batch 3) hinken und lag Phase von 11,5 ± 0,29 h und t₅₀ von 17,8 ± 0,29 h (Batch-4), beziehungsweise. Kinetische Daten wurde mit einem 5-Parameter logistische Kurve mit einer linearen Abnahme der obere Asymptote ausgestattet. Lag-Phase und t-₅₀ wurden durch Interpolation zwischen den Sollwerten durch lineare Regression berechnet. Lag-Phase errechnet sich die 3 % Erhöhung des ThT-Fluoreszenz-Signals. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: vorgeformten hutau441 Aggregate haben hohe Aktivität Aussaat. Zur Einleitung des Aussaat wurden beschallten Tau Aggregate Monomer hutau441 hinzugefügt. Von Rot nach blau, jede Farbe der unterschiedlichen kinetischen Kurven repräsentiert die unterschiedliche Höhe der zusätzlichen Samen: 1,25 %, 0,63 %, 0,31 %, 0,16 %, 0,08 %, 0,04 %, 0,02 %, 0,01 %, 0,005 % und 0,0025 % (V/V), beziehungsweise. Spontane Umwandlung von hutau441 wird in schwarz dargestellt. In vervierfacht wurden alle Bedingungen getestet. Die vier kinetische repliziert, verbunden mit einer bestimmten Konzentration von Samen sind sehr reproduzierbar und in den meisten Fällen nicht zu unterscheiden. Konzentrationen von hutau441 und Heparin sind 15 µM und 8 µM. Die Zugabe von geringen Mengen von vorgeformten beschallten fibrillären Strukturen beseitigt die anfängliche Verzögerung Phase bei der spontanen Umwandlung beobachtet und die Wirkung ist proportional mit der Menge an Samen. Von Rot nach blau ist der Unterschied in t₅₀ beobachtet (t₅₀ spont.conv-t₅₀ Aussaat) bzw. 18,9, 18.40, 17,8, 17.3, 16,6, 16.1, 15,4, 14.7, 14,2 und 13,7 Stunden. Spontane Umwandlung von hutau441 zeichnet sich durch eine durchschnittliche t-₅₀ (mit SD) von 19.85 ± 0,54 h. kinetische Daten wurde mit einem 5-Parameter logistische Kurve mit einer linearen Abnahme der obere Asymptote ausgestattet. t-₅₀ wurden durch Interpolation zwischen den Sollwerten durch lineare Regression berechnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Trotz zahlreicher Versuche berichtet die Tau-Aggregation-Kinetik in der Literatur, Datum fehlt das gewünschte Maß an Reproduzierbarkeit und/oder einige der Features einer Keimbildung abhängigen Polymerisation^{19,20,21 , 22 , 23 , 25}. Dies wird oft durch das Fehlen eines Lag-Phase, ineffiziente Aussaat und nicht-fibrillären Natur Tau Aggregate unterstrichen. Der Grund für diese Mängel kann variieren und suboptimale Tau Protein-Qualität (Fragmentierung, Aggregate, geringe Reinheit, etc.), Wahl des Proteins und induzieren und Reagenzien oder experimentellen Bedingungen enthält. Ein weiterer erschwerender Faktor sind die zwei Cystein-Rückstände befindet sich in der Tau-Aggregation-Benutzeroberfläche, die bilden Intra- oder inter - molekulare Disulfid überbrückt, abhängig von der Redox-Umwelt und beeinflussen die Effizienz der Tau-Aggregation. In den meisten Ansätzen, die Verringerung der Reagenzien wie DVB-t oder DÄMMUND wurden verwendet, um die Cystein-Rückstände in reduzierten Formen zu pflegen und somit erhöhen Reproduzierbarkeit²⁵. Darüber hinaus ist die vom Aussterben bedroht-Koeffizient von Tau sehr gering, das führt zu Schwierigkeiten bei der Messgenauigkeit der Proteinkonzentration.

Wir standen vor allem ein paar Parameter und Qualitätsmerkmale, die wir entscheidend für eine stabile, reproduzierbare und repräsentative Aggregation Profil von Tau-Protein als: Beseitigung der Möglichkeit der Intra- und inter-molekulare Disulfid Anordnung, Generieren einer hochreinen Tau-Monomer und Erhöhung der Genauigkeit der Konzentrationsbestimmung. Diese Reagenz bezogene Fragen mögliche Aufmerksamkeit Punkte sind, die wir für optimale Assay-Entwicklung kritisch betrachtet. Um diese Probleme zu beheben, wurde in voller Länge huTau441 mit zwei Mutationen, C291A und C322A, und mit N - und C-terminalen Tags ausgedrückt. Mutation der Cystein-Reste hat minimale Auswirkungen auf das Tau-Protein und ersparen sich die sonst sehr schwer zu steuern Disulfid überbrückt. Mit dem Ausdruck des Proteins mit relativ kurzen N und C-terminalen Tags erlaubt uns, eine zweistufige Affinität Reinigung Protokoll führte zu sehr hohen Reinheit, Integrität und Monomer Inhalte zu verfolgen. Darüber hinaus haben wir eine F8W-Mutation, die vom Aussterben bedroht-Koeffizient des Proteins erhöht und erlaubt sehr viel genauer Konzentration Messungen²⁴eingeführt.

Neben der Verwendung von qualitativ hochwertigen Protein Reagenzien, wurden auch andere Test-Parameter optimiert. Die optimale Tau: Heparin-Verhältnis wurde identifiziert, um rund 0,5 (M/M) werden die bisher veröffentlichten Studien²⁶entspricht. Mechanische und optische instrumental Einstellungen sind entscheidend, um sicherzustellen, dass die Reproduzierbarkeit und die optimalen Parameter zu einem gewissen Grad je nach Hersteller abweichen können.

Die Aggregation der Tau in diesem Assay beschrieben zeigt Merkmale, die in AD Tau Pathogenese zugeordnet sind und im Zusammenhang mit Tauopathies. Der Prozess beginnt mit einer anfängliche Verzögerung entspricht die Bildung von energiereichen Kerne und ist gefolgt von einer rasanten Wachstumsphase, die entspricht Fibrille Wachstum. Die Verzögerungszeit ist lang genug, um in einem breiten Fenster um die Aussaat Prozess mit einem breiten Spektrum an Samen Konzentrationen (Abbildung 5) zwar noch nicht allzu langer Zeit so Proteinabbau und/oder unspezifische Aggregation vermieden werden (Abbildung im Detail zu studieren 2). diese sekundären Ereignisse könnte vor allem passieren, wenn eine intrinsisch ungeordnete Protein wie huTau441 für längere Zeit zu physiologischen Bedingungen ausgesetzt ist. Die erhaltenen Tau Aggregate Anzeige die Morphologie der PHFs von Gehirnen von Alzheimer-Patienten isoliert und sind sehr effizient bei der Rekrutierung von Monomeren Tau und konvertieren es in de Novo generiert Aggregate, einen Prozess als seeding bezeichnet. Der Assay ist hoch reproduzierbare, die kinetischen Kurven wird praktisch nicht zu unterscheiden zwischen Brunnen, Durchläufe und Eiweiß Chargen. Obwohl der aktuelle Test konzentriert sich nur auf die längste Tau Isoform, huTau441, kann die Anwendung angepasst werden, um die Umwandlung von anderen Formen der Tau (Ameijde Et Al., Acta Neuropathologica Kommunikation, im Druck) zu studieren ermöglicht es zudem mechanistische Studien konzentriert sich auf das Zusammenspiel von Tau Isoformen und möglicherweise Aufschluss über die Unterschiede zwischen Tau Pathogenese n. wo 3R und 4R Isoformen sind in PHFs und PICK Krankheit oder frontotemporale Demenz wo enthält hauptsächlich Tau Pathologie 3R und 4R Tau Isoformen, bzw.²⁷.

Die sehr hohe Reproduzierbarkeit des Assays sollte Leser es mit relativer Leichtigkeit in ihren spezifischen Labor Einstellungen implementieren lassen. Der Assay imitiert, was geglaubt wird, um die in Vivo Fehlfaltung und Aggregation von Tau zu werden, stellt ein wertvolles Werkzeug für das screening von Wirkstoffkandidaten und bewerten deren Einmischung mechanistische Studien, die Aufschluss über Tau Pathogenese und es wird mit den verschiedenen Schritten des Prozesses Pathogenese.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thioflavin T	Sigma-Aldrich	T3516-5G	dry powder (Mw = 318.86 g/mol)
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393-50KU	dry powder (Mw = 17-19 kDa)
TCEP	Sigma-Aldrich	75259-1G	dry powder (MW= 286.65 g/mol)
PBS	Gibco-Life Technologies	10010-015	Sterile, pH 7.4 (1X)
0.22 μm sterile filter	Corning	431160	PES membrane
0.20 μm sterile serynge filter	Corning	431229	PES membrane
96-well microplates	Thermo Scientific	9502867	Black, flat botton
Microplate sealers	R&D Systems	DY992	Adhesive strips
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader	Biotek	Synergy Neo2	Hybrid Technology, Gen5 Software
Eppendorf Tubes	Eppendorf	0030 120.086	1,5 ml tubes
Ultrasonics-Branson SFX250	Branson	101-063-966R	1/2" Solid Horn and 1/8" microtip