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In diesem Artikel

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  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Ein detailliertes Protokoll wird für die Trennung, Identifikation und Charakterisierung von Proteoforms in Proteinproben mit Kapillare Zone Elektrophorese-Electrospray Ionisierung-Tandem-Massenspektrometrie (CZE-ESI-MS/MS) beschrieben. Das Protokoll kann für die hochauflösende Charakterisierung von Proteoforms in einfachen Proteinproben und der großen Identifikation von Proteoforms in komplexen Proteom Proben verwendet werden.

Zusammenfassung

Kapillare Zone Elektrophorese-Electrospray Ionisierung-Tandem-Massenspektrometrie (CZE-ESI-MS/MS) wurde als ein nützliches Werkzeug für Top-Down-Proteomics anerkannt, die Proteoforms in komplexen Proteome charakterisieren soll. Jedoch die Anwendung der CZE-MS/MS für große Top-Down-Proteomics hat durch die niedrige Probenbeladung Kapazität behindert wurde und schmale Fenster Trennung von CZE. Hier wird ein Protokoll beschrieben mit CZE-MS/MS mit einem Mikroliter-Skala Probenbeladung Volumen und einem 90-min-Trennung-Fenster für große Top-Down-Proteomics. CZE-MS/MS-Plattform basiert auf einer linearen Polyacrylamid (LPA)-beschichtete Trennung Kapillare mit extrem niedrigen Elektroosmotischer Fluss, eine dynamische pH-Junction-basierte Online-Probe Konzentration Methode mit hohem Wirkungsgrad für Protein zu stapeln, ein Elektro-kinetisch gepumpten Scheide Fluss CE-MS Schnittstelle mit extrem hohe Empfindlichkeit und eine Ionenfallen-Massenspektrometer mit hoher Auflösung und Geschwindigkeit zu scannen. Die Plattform kann für die hochauflösende Charakterisierung von einfachen intakt Proteinproben und die groß angelegte Charakterisierung von Proteoforms in verschiedenen komplexen Proteome verwendet werden. Als Beispiel ist eine hocheffiziente Trennung einer standard Protein-Mischung und eine hochempfindliche Detektion der vielen Verunreinigungen, die Nutzung der Plattform unter Beweis gestellt. Ein weiteres Beispiel dieser Plattform produzieren über 500 Proteoform und 190 Protein Identifikationen von einer Escherichia coli Proteom in einem einzigen CZE-MS/MS führen.

Einleitung

Top-Down-Proteomics (TDP) zielt darauf ab, für die groß angelegte Charakterisierung von Proteoforms innerhalb einer Proteom. TDP stützt sich auf die effektive flüssig Phasentrennung von intakten Proteinen vor der Elektrospray-Ionisation-Tandem-Massenspektrometrie (ESI-MS/MS)-Analyse aufgrund der hohen Komplexität und große Konzentration Dynamikbereich des Proteoms1,2 ,3,4,5. Kapillare Zone Elektrophorese (CZE) ist eine leistungsfähige Technik für die Trennung von Biomolekülen, die anhand ihrer Größe-Ladungs-Verhältnis6. CZE ist relativ einfach und erfordert nur eine offene röhrenförmigen verschmolzen Silica Kapillare, ein Hintergrund-Elektrolyt (BGE) und ein Netzteil. Eine Probe von intakten Proteinen kann in der Kapillare mit Druck oder Spannung geladen werden, und Trennung wird durch beide Enden der Kapillare in das BGE eintauchen und Anlegen einer hohen Spannung eingeleitet. CZE kann extrem hohe Abscheideleistung Ansatz (> 1 Million theoretischen Platten) für die Trennung von Biomolekülen7. CZE-MS hat eine drastisch höhere Empfindlichkeit als weit verbreitete umgekehrt Phase Flüssigkeitschromatographie (RPLC)-MS für die Analyse von intakten Proteinen8. Obwohl CZE-MS ein großes Potenzial für große Top-Down-Proteomics hat, hat ihre breite Anwendung in Proteomics durch mehrere Themen, darunter eine geringe Probenbeladung Kapazität und schmale Trennung Fenster behindert worden. Das typische Beispiel Ladevolumen in CZE ist etwa 1 % des gesamten Kapillare, die normalerweise weniger als 100 nL9,10,11entspricht. Die Trennung-Fenster der CZE ist in der Regel weniger als 30 min durch den starken Elektroosmotischer Fluss (EOF)9,10. Diese Probleme beschränken CZE-MS/MS für die Identifizierung einer großen Anzahl von Proteoforms und niedrigen reichlich Proteoforms aus einer komplexen Proteom.

Viel Anstrengungen wurden unternommen, um die Probe Ladevolumen von CZE über Online-Probe Konzentration Methoden (z.B., Solid Phase Microextraction [SPME]12,13, Feld-erweiterte Probe Stapeln [FESS]9 zu verbessern , 11 , 14, und dynamische pH Kreuzung15,16,17,18). FESS und dynamische pH Junction sind einfacher als SPME, erfordert nur einen signifikanten Unterschied zwischen dem Probenpuffer und das BGE in pH-Wert und Leitfähigkeit. FESS beschäftigt ein Probenpuffer mit viel geringere Leitfähigkeit als die BGE, führt zu eine Stapelung von Analyten an der Grenze zwischen der Probe Zone und die BGE-Zone in der Kapillare. Dynamische pH Junction nutzt ein einfaches Beispiel-Stecker(z. B.50 mM Ammonium Bicarbonat, pH 8) und einen sauren BGE (z.B., 5 % [V/V] Essigsäure, pH 2,4) auf beiden Seiten des Steckers Probe. Auf Antrag eine hohe positive Spannung am Ende der Kapillare Injektion Auftritt Titration von den grundlegenden Beispiel Stecker, Konzentration des Analyten in einen engen Stecker bevor Sie irgend eine CZE-Trennung. Vor kurzem, die Sonne-Gruppe systematisch verglichen FESS und dynamische pH Junction zum Online-Stapeln von intakten Proteinen, demonstrieren, dass dynamische pH-Kreuzung könnte viel bessere Leistung als FESS für die Online-Konzentration von intakten Proteinen produzieren wenn Das Probenvolumen Injektion war 25 % des Gesamtvolumens Kapillare19.

Neutral beschichteten Trennung Kapillaren (z.B.lineares Polyacrylamid [LPA]) sind eingesetzt worden, um die EOF in der Kapillare, verlangsamt sich die CZE-Trennung und Verbreiterung der Trennung Fenster20,21zu reduzieren. Vor kurzem entwickelte sich die Dovichi Gruppe ein einfaches Verfahren zur Herstellung von stabilen LPA-Beschichtung auf der inneren Wand der Kapillaren, Verwendung von Ammonium Bleichen (APS) als Initiator und Temperatur (50 ° C) für die Produktion freier Radikale und Polymerisation22 . Vor kurzem beschäftigte der Konzern Sonne die LPA-beschichtete Trennung Kapillare und dynamische pH Kreuzung Methode zur Trennung von intakten Proteinen, CZE, eine Mikroliter-Skala Probe laden Volumen und einem 90-min Trennung Fenster19zu erreichen. Dieses CZE-System öffnet die Tür zur Verwendung von CZE-MS/MS für große Top-Down-Proteomics.

CZE-MS erfordert eine sehr robuste und sensiblen Schnittstelle paar CZE, MS. Drei CE-MS Schnittstellen wurden gut entwickelt und vermarktet in der Geschichte der CE-MS, und sie sind der co-axial Mantel-Flow Schnittstelle23, die sheathless-Schnittstelle mit einer porösen Spitze wie die ESI-Strahler24, und der Elektro-kinetisch gepumpte Scheide fließen Schnittstelle25,26. Die Elektro-kinetisch gepumpten Scheide-Fluss-Schnittstelle-basierte CZE-MS/MS hat eine niedrige Zeptomole Peptid Erkennung Grenze9erreicht, mehr als 10.000 Peptid Identifikationen (IDs) von der HeLa Zelle Proteom in einem einzigen laufen14, eine schnelle Charakterisierung Intakte Proteine11und extrem stabile und reproduzierbare Analysen von Biomolekülen26. Vor kurzem, LPA-beschichtete Trennung Kapillare, die dynamische pH-Kreuzung-Methode und das Elektro-kinetisch gepumpten Scheide Fluss Interface für große Top-Down-Proteomics ein Escherichia coli (E. Coli) Proteoms19 verwendet ,27. CZE-MS/MS-Plattform näherte sich über 500 Proteoform IDs in einem einzigen laufen19 und fast 6.000 Proteoform IDs über Kupplung mit Größe-Exclusion Chromatography (SEC)-RPLC-Fraktionierung27. Die Ergebnisse zeigen deutlich die Fähigkeit der CZE-MS/MS für große Top-Down-Proteomics.

Hier ist ein detaillierte Verfahren unter Verwendung von CZE-MS/MS für große Top-Down-Proteomics beschrieben. CZE-MS/MS-System beschäftigt die LPA-beschichtete Kapillare zur Verringerung der EOF in der Kapillare, die dynamische pH Kreuzung Methode für die Online-Konzentration von Proteinen, die Elektro-kinetisch gepumpten Scheide Fluss Schnittstelle für Kupplung CZE, MS, eine Orbitrap Masse Spektrometer für die Sammlung von MS und MS/MS Spektren von Proteinen und eine anregen (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform Identifizierung und Charakterisierung) Software für Proteoform-ID per Datenbanksuche.

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Protokoll

1. Vorbereitung des LPA-Beschichtung auf der inneren Wand der Kapillare Trennung

  1. Vorbehandlung der Kapillare
    1. Spülen einer Fused-Silica Kapillare (120 cm lang, 50 µm im Innendurchmesser [ID], 360 µm im Außendurchmesser [o.d]) sukzessive mit 500 µL 1 M Natronlauge, deionisiertes Wasser 1 M Salzsäure, deionisiertes Wasser und LC-MS Grade Methanol mittels einer Spritzenpumpe.
    2. Trocknen Sie die Kapillare mit Stickstoffgas (10 Psi, ≥ 12 h) und füllen Sie die Kapillare mit 50 % (V/V) 3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylat in Methanol mittels einer Spritzenpumpe. Versiegeln Sie beide Enden der Kapillare mit Silikon-Kautschuk zu und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für mindestens 24 h.
      Hinweis: Während dieses Schrittes, die innere Wand der Kapillare wird funktionalisiert mit C = C. Longer Inkubation Ergebnisse in bessere Kapillare Beschichtung durch eine vollständige Reaktion.
    3. Geschnitten Sie einen kleinen Teil (ca. 5 mm) der Kapillare von beiden Enden mit einem anhaftenden Stein. Spülen Sie die Kapillare mit Methanol (500 µL) über eine Spritzenpumpe, um nicht umgesetzten Reagenzien zu bereinigen. Trocknen Sie die Kapillare mit Stickstoffgas (10 Psi, ≥12 h).
  2. Vorbereitung der LPA-Beschichtung
    Hinweis: Dieses Verfahren basiert auf Zhu Et al. 22 mit geringfügigen Änderungen.
    1. Bereiten Sie eine Acrylamid-Lösung (40 mg von Acrylamid in 1 mL Wasser) und Ammonium Bleichen (APS) Lösung (5 % [w/V] in Wasser).
    2. 500 µL der Acrylamid-Lösung, Wirbel die Mischung 2-3 µL der APS-Lösung hinzu und entgasen sie mit Stickstoffgas für 5 min um den Sauerstoff in der Lösung zu entfernen.
    3. Laden Sie die Mischung in die vorbehandelte Kapillare mit Vakuum, versiegeln Sie beide Enden der Kapillare mit Silikon-Kautschuk zu und in einem Wasserbad bei 50 ° C für 40 min inkubieren.
    4. Einen kleinen Teil (ca. 5 mm) der Kapillare von beiden Enden mit einem anhaftenden Stein zu entfernen. Drücken Sie die umgesetzte Lösung aus der Kapillare mit Wasser (200 µL), mit der Spritzenpumpe.
      Hinweis: Achten Sie darauf, das Polymer aus der Kapillare geschoben eine Agarose-Gel-artige Konsistenz ist. Eine längere Inkubationsschritt (bis zu ~ 45-50 min) kann dazu führen, dass eine bessere Kapillare Beschichtung. Bei längerer Reaktion die Kapillare werden blockiert und hoher Druck ist erforderlich, um push-out das Polymer mit Wasser. Eine HPLC-Pumpe kann für diesen Zweck verwendet werden.

(2) Ätzen der Kapillare mit Flusssäure

Achtung: Verwenden Sie geeignete Sicherheitsmaßnahmen beim Umgang mit Flusssäure (HF) Lösungen. Alle HF-bezogenen Vorgänge in einem chemischen Abzug durchgeführt werden müssen. Stellen Sie vor jedem Eingriff HF-bezogenen sicher, dass 2,5 % Kalzium Gluconat Gel im Falle der Exposition zur Verfügung steht. Doppelte Handschuhe sind erforderlich, ein typisches Nitril-Handschuh innen und einem schweren Neopren Handschuh außerhalb. Tragen Sie ein Laborkittel und chemische Schutzbrille. Bewahren Sie nach der HF-Operationen flüssigen und festen Sonderabfällen getrennt auf. HF-Abwasser muss sofort mit einer hoher Konzentration Natriumhydroxid-Lösung für die temporäre Speicherung vor Abfall Pick-up neutralisiert werden. HF-Abfall muss in einem Kunststoff-Behälter zwischengelagert, die gesäumt ist von zwei dicken Eingallone Ziploc Plastiktüten und einem Deckel. Sowohl die festen und flüssigen Abfälle muss ordnungsgemäß gekennzeichnet sein.

  1. Einen Teil der Kapillare mit einer sanften Flamme zu brennen (z.B.Tasche leichter), der Polyimid-Außenschicht (1 cm in der Länge) ca. 4 cm von einem Ende der Kapillare zu entfernen. Sanft reinigen des verbrannten Teils der Kapillare um die Polyimid Beschichtung vollständig zu entfernen.
    Hinweis: Mit Vorsicht gehen Sie vor, als der Teil der Kapillare ohne die Polyimid-Beschichtung ein wenig zerbrechlich werden.
  2. Bohren Sie ein kleines Loch am Ende einer 200-µL-Röhre etwa die gleiche Größe wie der Kapillare äußeren Durchmesser die Kapillare ausreichend im Ort zu halten, sobald es durch dieses Loch eingefädelt ist. Fädeln Sie das Ende der Kapillare, die liegt in der Nähe der verbrannte Teil durch das Loch, bis die verbrannte Teil in der Röhre ist.
    Hinweis: Es wird empfohlen, die Größe des Loches mit dem Ende der Kapillare Weg von den verbrannten Teil um die richtige Größe zu gewährleisten zu testen, wie die verbrannte Teil der Kapillare zerbrechlich ist.
  3. Die 200-µL-Röhre fügen Sie hinzu ~ 150 µL des HF (48-51 % Lösung in Wasser), dass die HF-Lösung auf halbem Weg die verbrannte Teil auf die Kapillare geht. Inkubieren Sie die Kapillare in der HF-Lösung bei Raumtemperatur für 90-100 min.
    Hinweis: Es empfiehlt sich, ein weiteres Loch in den Deckel des Rohres entsteht und einigen kleinen Gegenstand (z.B. eine kleine Pipettenspitze) verwendet wird, um das Rohr zu halten während die Inkubation stattfindet. Die Pipettenspitze kann verwendet werden, zu durchstechen, Schaum oder einige andere solide Plattform aus der Reaktionskammer aus, hängen kann eine sichere Umgebung zu schaffen. Küchenpapier unter das Rohr mit HF und folgen Sie angemessene Verfahren im Falle einer Ölpest.
  4. Entfernen Sie die Kapillare aus der Tube und waschen Sie das äußere mit entionisiertem Wasser, alle restlichen HF zu entfernen.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der äußere Durchmesser der Kapillare in den schmalsten Teil des verbrannten jetzt kleiner als 100 µm ist, wie es sein sollte.
  5. Schneiden Sie den geätzten Teil der Kapillare in der Mitte der schmalste Teil mit einem anhaftenden Stein, um eine Trennung Kapillare mit weniger als 100 µm im o.d an einem Ende zu produzieren. Schneiden Sie das nicht geätzt Ende der Kapillare zu einem 1-m-Trennung Kapillare.
    Hinweis: Entsorgen Sie HF nach dem institutionell vorgegebenen Protokoll.

3. Vorbereitung der Proben

  1. Vorbereitung einer standard Protein-Mischung
    1. Bereiten Sie eine standard Proteinmischung mit Cytochrom c (Cyto.c, 12 kDa, 0,1 mg/mL), Lysozym (14,3 kDa, 0,1 mg/mL), β-Casein (24 kDa, 0,4 mg/mL), Myoglobin (16,9 kDa, 0,1 mg/mL), Kohlensäure Anhydrase (CA, 29 kDa, 0,5 mg/mL) und Rinderserumalbumin (BSA, 66.5 kDa 1,0 mg/mL) im LC-MS Grad Wasser als eine Stammlösung.
      Hinweis: Vorratslösung kann regelmÄÑig und bei-80 ° C für den Einsatz gelagert werden.
    2. Verdünnen Sie die Stammlösung um einen Faktor von 10 mit einer 50 mM-Ammonium Bicarbonat-Lösung (pH 8,0) im LC-MS Grade Wasser für CZE-MS-Analyse.
      Hinweis: Filter die Ammonium Bicarbonat-Lösung vor Gebrauch mit einem Membranfilter (z.B. 0,2 µm aus Cellulosenitrat Membran und 50 mm Durchmesser).
  2. Vorbereitung einer E. Coli -Probe
    1. Kultur E. Coli (k-12 MG1655) Zellen in LB-Medium bei 37 ° C unter Schütteln bei 225 u/min, bis die OD600 Wert 0,7 nähert. Sammeln Sie E. Coli Zellen durchZentrifugation (3.283 X g, 10 min) zu, und waschen Sie sie mehrmals mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), das Medium zu entfernen.
    2. Unterbrechen Sie die E. Coli -Zellen in den Lyse-Puffer mit 8 M Harnstoff, Protease-Inhibitoren und 100 mM Ammonium Bicarbonat (pH 8,0) und ultrasonicate für 15 min mit ein Ultraschall Zelle Disruptor mit einem Cup-Horn für vollständige Zelle Lyse auf Eis.
      1. Die Einschaltdauer (%) auf 50 gesetzt und stellen Sie den Output-Regler auf 7 für den Ultraschall Zelle Disruptor.
    3. Zentrifugieren des Überstands der lysate bei 18.000 X g für 10 min. sammeln und entsorgen das Pellet. Verwenden Sie eine kleine aliquoten des Überstands für Protein-Konzentrationsmessung mit Bicinchoninic Säure (BCA) Assay.
      Hinweis: Die lysate muss mindestens um den Faktor drei bis die Harnstoff-Konzentration geringer als 3 M zu reduzieren, um kompatibel mit dem BCA-Assay werden verdünnt werden. Die BCA-Test erfolgt anhand des Herstellers Verfahren.
    4. Mix 1 mg von E. Coli Proteinen mit kaltem Aceton mit einem Volumenverhältnis von 1:4 und halten Sie die Mischung bei-20 ° C über Nacht die Proteine ausgefällt.
      Hinweis: Führen Sie alle Experimente mit Aceton in einer chemischen Kapuze.
    5. Spin-down ausgefällten Proteine (12.000 X g, 5 min) und den Überstand zu entfernen. Waschen Sie die Pellets mit kaltem Aceton wieder (gleiche Volumen wie früher) und spin-down wieder.
    6. Den Überstand zu entfernen und das Pellet in der chemischen Haube für ein paar Minuten trocknen lassen.
      Hinweis: Übertrocknen Sie nicht Protein Pellet.
    7. Auflösen der ausgefällten E. Coli Proteine (1 mg) in 200 µL von 8 M Harnstoff in 100 mM Ammonium Bicarbonat (pH 8,0).
    8. Denaturieren, reduzieren und Alkylat der Probenmaterials.
      1. Inkubation der Probe bei 37 ° C für 30 min, die Proteine denaturieren.
      2. Durch Zugabe von 2 µL 1 M DVB-t-Lösung (in 100 mM Ammonium Bicarbonat) in der Probe und die Probe bei 37 ° C für 30 min Inkubation mit Dithiothreitol (DTT) reduzieren.
      3. Alkylat Proteine mit Iodoacetamide (IAA) durch Zugabe von 6 µL 1 M-IAA-Lösung (in 100 mM Ammonium Bicarbonat) auf die Probe und die Probe für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
      4. Die überschüssige IAA mit DVB-t durch Zugabe von 2 µL 1 M DVB-t-Lösung zu stillen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Ansäuern der Probe mit Ameisensäure (FA) zu einem FA-Endkonzentration von 1 % (V/V).
        Hinweis: Reduktion und Alkylierung erfolgt um die Entfaltung der Proteine für nachgeschaltete Fragmentierung zu unterstützen. Diese Schritte werden die Informationen von Disulfid Anleihen verlieren. Wenn das Ziel die Disulfid-Bindungen der Proteine zu studieren, vermeiden Sie diese Schritte. Denken Sie daran, alle konzentriertere Säurelösungen in einem chemischen Haube zu behandeln.
    9. Entsalzen Sie die Probe mit einem C4-Trap-Säule (z.B.4 mm i.d., 10 mm in der Länge, vollgepackt mit 3 µm Partikel mit 300-Å Poren) mit einer HPLC-Anlage. Verwenden Sie einen UV-Detektor bei einer Wellenlänge von 254 nm für die Erkennung.
      1. Legen Sie der Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase auf 1 mL/min aktivieren die Spalte durch spülen es mit 80 % (V/V) Acetonitril (ACN), 0,1 % FA für 10 min in Wasser und equilibrate durch spülen es mit 2 % (V/V) ACN, 0,1 % FA in Wasser 10 min. lang.
      2. Laden Sie 500 µg Proteine auf die Säule und Entsalzen durch Spülen sie mit 2 % (V/V) ACN, 0,1 % FA im Wasser für 10 min bei 1 mL/min Durchfluss.
      3. Mit 80 % (V/V) ACN, 0,1 % Proteine eluieren FA im Wasser für 3 min bei 1 mL/min Durchfluss. Das Eluat zu sammeln und mit einem Vakuum Konzentrator lyophilize.
        Hinweis: Die C4-Trap-Säule lässt sich große Mengen an Proteinen aber nicht niedrig Mikrogramm von Proteinen durch mögliche Probenverlust entsalzen. Erwägen Sie für begrenzte Protein Materialien Pipettenspitzen mit C4 Medien für Protein Entsalzung. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Proteine Wäschestücke, wenn die Probe lyophilizing.
    10. Lösen Sie die 500 µg von Proteinen (vorausgesetzt kein Probenverlust während der Probenvorbereitung auf) in 250 µL 50 mM Ammonium Bicarbonat (pH 8,0) für CZE-MS Experimente.

4. Aufbau des CZE-MS/MS-System und Analyse der Proben

  1. Aufbau der CZE-Systems
    1. Bereiten Sie ein BGE mit 5 % oder 10 % (V/V) Essigsäure (pH ~2.4 oder ~ 2.2) in LC-MS Grad Wasser. Ein BGE-Fläschchen, die mit der Pufferwanne CZE Autosampler entspricht ~1.5 mL der BGE umgesetzt.
      Hinweis: Stellen Sie frische BGE jede Woche und Änderung der BGE-Lösung in der Durchstechflasche täglich um jegliche Kontamination zu vermeiden.
    2. Eine Insert-Rohr eine Beispiellösung (5-200 µL) hinzu und habe das Insert Rohr in einer Probe Fläschchen Thatmatches mit Probenteller der CZE Autosampler.
    3. Laden Sie das Beispiel, das BGE und die Trennung Kapillare in CZE Autosampler.
      Hinweis: Die Sprache, die in diesem Protokoll verwendeten am genauesten reflektiert die Verwendung einer bestimmten Autosampler (siehe Tabelle der Materialien), aber die Grundsätze können auch auf andere Probengeber.
      1. Wählen Sie in der Handsteuerung Seite des CZE Autosampler Sample laden . Laden Sie das BGE-Fläschchen in den Puffer-Tablett mit den Autosampler, in Anbetracht seiner Haltung in der Pufferwanne. Laden Sie das Probenfläschchen in der Probenteller Autosampler, in Anbetracht seiner Haltung in der Probenführungsrinne.
        Hinweis: Das Gerät kann bei manueller Steuerung betrieben werden, durch Klick auf das Bild des Instruments für Device Monitor auf das Hauptinstrument-Seite und wählen Sie dann manuell unter Direkter Kontrolle.
      2. Laden Sie die Trennung Kapillare in den CZE Autosampler, mit dem nicht geätzt Ende der Kapillare. Stellen Sie den Autosampler auf die Ausrichtung mit manueller Steuerung. Fädeln Sie das nicht geätzt Ende der Kapillare in ein Loch, das zu halten, die Trennung Kapillare bis es physisch eingefädelt werden kann nicht weiter verwendet wird.
        Hinweis: In diesem Fall das Ende der Kapillare ist fast auf gleicher Höhe wie das Ende der Elektrode, und mindestens 50 µL der Probe ist in das Probenfläschchen erforderlich, um sicherzustellen, dass am Ende der Kapillare beim Einspritzen in die Probe eingetaucht ist. Wenn die Probenmenge ist niedrig (d.h. 5 µL), die Höhe der Injektion Ende der Kapillare muss angepasst werden, wie in Schritt 4.1.3.2.1 beschrieben.
        1. Einstellen Sie die Höhe der Injektion Ende der Kapillare, wenn das Probenvolumen von 50 µL (d.h. 5 µL) unterschreitet. Schalten Sie den Autosampler in den Standby-Modus mit manueller Steuerung. Geben Sie die Probenposition im System und bewegen Sie die Kapillare zu, zum Beispiel. Schieben Sie die Kapillare weiter hinunter zu erreichen am Ende der Probenfläschchen Injektion.
          Hinweis: In diesem Fall kann die Probeninjektion mit einer Stichprobe von nur 5 µL in der Durchstechflasche durchgeführt werden.
      3. Weiterhin verwenden die manuelle Steuerung, spülen Sie die Kapillare mit dem BGE für 20 min, mit einem Druck von 20 Psi.
  2. Aufbau der CZE-MS-Schnittstelle
    1. Ziehen Sie eine Borosilikatglas Kapillare (1 mm o.d, 0,75 mm i.d., 10 cm lang) in zwei Elektrospray-Strahler mit einer Öffnung von 20-40 µm in o.d
      Hinweis: Halten Sie die Länge der Elektrospray-Emitter als 4-5 cm und schneiden Sie es mit einem anhaftenden Stein bei Bedarf. Alle Glas entsorgen Abfall in einem Sharps Container. Die Einstellungen um 20 - 40 µm Tipps sind wie folgt. Die Hitze, 498, der Zug bis 5, die Geschwindigkeit auf 10, die Verzögerung auf 150 und der Druck auf 200 einstellen Überprüfen Sie die Größe der Strahler mit einem Mikroskop vor Gebrauch. Passen Sie die Parameter etwas, falls erforderlich.
    2. Berg ein gewerblichen Elektro-kinetisch gepumpten Scheide-Fluss an der Vorderseite des Massenspektrometers Benutzeroberfläche (siehe Tabelle der Materialien). Füllen Sie die Scheide Puffer Tank mit einem Puffer mit 10 % (V/V) Methanol und 0,2 % (V/V) FA in LC-MS Grade Wasser.
    3. Spülen Sie das T in die Schnittstelle mit der Scheide Puffer über Druck manuell mit einer Spritze. Fädeln Sie das 1-mm-o.d Ende der Emitter Elektrospray durch eine Hülse Schlauch und schließen Sie den Emitter mit einem Anschluss der Tüber eine passende. Einfach T manuell nochmals nachspülen Sie mit einer Spritze den Emitter mit der Scheide Puffer zu füllen.
    4. Stellen Sie den Abstand zwischen der Öffnung des Senders und dem Eingang des Massenspektrometers ~ 2 mm mit Hilfe der Kamera, die mit der Schnittstelle kam. Gelten Sie eine 2 - 2.2 kV Spannung an der Scheide Puffer Durchstechflasche für Elektrospray. Passen Sie die Spray-Spannung um eine stabile Elektrospray zu erreichen.
      Hinweis: Wenn keine Elektrospray oder eine instabile Elektrospray beobachtet wird, prüfen Sie die Schnittstelle, um sicherzustellen, gibt es keine großen Luftblasen in den Emitter, in Tund in den Schlauch, der zur Verbindung der Scheide Puffer Durchstechflasche und T. Der Abstand zwischen der Öffnung des Senders und die Massen-Spektrometer-Eingang kann grob abgeschätzt werden, durch den Vergleich mit 1 mm o.d des Emitters. Die Spray-Spannung hängt von der Größe des Emitters. Für 20 - 40 µm-Strahler ist 2-2.2 kV gut genug. Denken Sie daran, immer vorsichtig sein bei der Verwendung von hoher Spannungen.
    5. Schalten Sie die Spray-Spannung und sanft thread geätzte Ende der Kapillare durch T Trennung in den Emitter, bis es weiter geschoben werden kann nicht. Gelten Sie Niederdruck (d.h. 5 Psi) am Ende der Kapillare Injektion während dieses Vorgangs, um sicherzustellen, gibt es keine Luftblasen in der Kapillare.
      Hinweis: Die Kapillare ist mit verbunden der T über eine Hülse Schläuche und ein Formstück. Passen Sie die Position der geätzten Ende der Kapillare in den Emitter mit Hilfe der Kamera, um innerhalb von 500 µm. Der Abstand kann grob abgeschätzt werden, durch den Vergleich mit 1 mm o.d des Emitters.
    6. Den niedrigen Druck Injektion Ende der Kapillare zu stoppen. Spülen Sie den Emitter ein wenig mit der Scheide Puffer. Auch hier gelten Sie 2-2.2 kV Spray Spannung um das Spray zu testen.
  3. Aufbau einer CZE-Methode zur Probeninjektion, Trennung, Kapillare Spülung und Auslösung von Massenspektrometer für die Datenerfassung
    1. Wählen Sie neue Methode unter Datei -Drop-Down-Menü auf dem Bildschirm Hauptinstrument, eine neue Methode zu initiieren.
    2. Wählen Sie Einlass als SV/EV, Tablett als Probe, Druck als 5 Psi, KV als 0 und Dauer als 95 s für eine Probeninjektion.
      Hinweis: Die Probe wird in der Kapillare über Druck injiziert. Das Probenvolumen Injektion kann basierend auf den Druck und Injektion Zeit mit Poiseuille Gesetz berechnet. Zum Beispiel 5 Psi für eine 95-s Probeninjektion entspricht etwa 500 nL Probe-Ladevolumen für eine 1 m lange Trennung Kapillare (i.d. 50 µm).
    3. Wählen Sie Parameter für die CZE-Trennung und Parameter für die Auslösung der Datenerfassung einrichten.
      1. Legen Einlass als Tablett als Puffer, InV, KV , Druck als 0 Psi als 30 und Dauer als 4.200 s für die Trennung der standard Protein Mischung Probe. Legen Einlass als Tablett als Puffer, InV, KV , Druck als 0 Psi als 20 und Dauer als 6.600 s für die Trennung des E. Coli Proteome Samples.
        Hinweis: Die Spannung für die Trennung anhand der Probe Komplexität einstellbar. Für einfache Proteinproben, 30 kV aufgebracht werden, um die Analyse zu beschleunigen. Für komplexe Proben, 20 kV wird angewendet, um die Trennung zu verlangsamen und erwerben mehr MS/MS Spektren für Proteoform IDs.
      2. Richten Sie die Parameter für die Datenerfassung unter Timed Eventsauslösen. Zeit (s) als 0,0 und Typ als Relais 1 für Activate in Schritt 1 festgelegt; Stellen Sie Zeit (s) als 1.0 und Typ als Relais 1 für Deactivate in Schritt 2.
    4. Wählen Sie Einlass als Tablett als Puffer, InV, KV , Druck als 10 Psi als 30 und Dauer als 600 s für die Kapillare Spülung.
    5. Speichern Sie die Methode-Dateien für die CZE-MS und MS/MS Experimente.
  4. Aufbau des MS und MS/MS
    1. Richten Sie die MS und MS/MS Parameter für intakte Protein-Analyse mit einem Quadrupol-Ion Trap Massenspektrometer (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: Die positiven Ionen-Modus und höhere Energie Elektronenstruktur Dissoziation (HCD) für Fragmentierung sind beschäftigt.
      1. Passen Sie die Einstellungen für die Melodie: intakte Protein-Modus aktivieren und verwenden einen Trapping Druck von 0,2. Setzen Sie die Ionen-Übertragung Kapillare Temperatur bis 320 ° C und s-Objektiv HF-Pegel bis 55.
      2. Erstellen Sie die MS und MS/MS-Methode-Datei.
        1. Legen Sie für vollständige MS die Anzahl der Microscans 3, die Auflösung auf 240.000 (bei m/Z 200), die automatische Gain Control (AGC) Zielwert 1E6, die maximale Einspritzzeit bis 50 ms und den Scanbereich bis 600-2000 m/Z.
      3. Verwenden Sie für MS/MS datenabhängige Erwerb (DDA) für die acht am intensivsten Ionen in ein volles Spektrum von MS. Legen Sie das Isolierung Fenster 4 m/Z und die normalisierte Elektronenstruktur Energie (NCE) auf 20 %. Legen Sie die Anzahl der Microscans auf 1, die Auflösung auf 120.000 (bei m/Z 200), die AGC Zielwert 1E5 und die maximale Einspritzzeit bis 200 ms.
      4. Legen Sie die Intensität Schwelle zur Auslösung von Fragmentierung, 1E5 und die Ionen mit einem Ladezustand höher als 5 Fragmentierung isoliert werden. Einschalten der Isotope ausschließen und die dynamische Ausgrenzung bis 30 s.
        Hinweis: Die Anzahl der Microscans für MS/MS kann auf 3 erhöht werden. In diesem Fall kann eine Top3 DDA-Methode verwendet werden, um die Zykluszeit zu reduzieren.
    2. Richten Sie eine Kabelverbindung zwischen der CE-Autosampler und das Massenspektrometer für die automatische Auslösung der Datenerfassung. Schließen Sie ein Ende eines Drahtes, der Relaiskontakt 1 A und auf der Rückseite des CE-Autosampler Relais 1 Kontakt B . Schließen Sie das andere Ende des Drahtes zu Starten In - und starten In + auf der Seite mit dem Massenspektrometer.
  5. CZE-MS/MS-Experiment und Analyse der Proben
    1. Gelten 30 kV mit der CE-Handsteuerung Probe Injektion Ende und 2-2.2 kV an der Scheide Puffer Durchstechflasche über das externe Netzteil zum Testen der Trennung Kapillare und Elektrospray.
      Hinweis: Die aktuelle, Trennung ist in diesem Fall um ca. 8-9 µA wenn Essigsäure 5 % (V/V) als das BGE verwendet wird.
    2. Richten Sie eine Datensequenz Erwerb auf dem Massenspektrometer-Computer durch Auswählen einer neuen Sequenz.
      1. Wählen Sie unbekannte als Probe und geben Sie einen Dateinamen und Pfad. Geben Sie die MS-Methode für jede Probe laufen unter Instrument-Methodeverwendet werden.
        Hinweis: Da gibt es ein separater Computer zur Steuerung des CE-Autosamplers, die Probenposition muss nicht angegeben werden.
    3. Richten Sie eine CZE-Trennung-Sequenz auf dem CE-Computer, die Pufferposition, Probenort und CZE-Methode anzugeben. Um eine neue Sequenz zu starten, wählen Sie die Sequenz unter Analyse -Drop-Down-Menü auf der Seite Hauptinstrument.
    4. Zuerst der Erwerbsmethode Daten auf dem Massenspektrometer-Computer durch die Auswahl, Reihenfolge (oder Probelauf für Einzelfahrten gedacht). Starten Sie die CE-Sequenz auf dem CE-Autosampler-Computer.
      Hinweis: Wenn die Trennung Spannung nach der Probeninjektion aktiviert ist, wird ein Signal von der CE-Autosampler zum Massenspektrometer für die Auslösung der Datenerfassung gesendet. Die aktuellen Trennung verringert sich zu Jahresbeginn während der Trennung aufgrund der dynamischen pH Kreuzung Probe stapeln. Dann erholt sich der Strom nach und nach.

(5) Suche in der Datenbank der gesammelten Raw-Dateien mit der Software anregen

  1. Übertragen Sie die Ausgabe-Dateien, einschließlich der MS und MS/MS Daten vom Massenspektrometer Computer auf einem Computer Suche Datenbank gewidmet.
    Hinweis: Diese Ausgabe-Dateien können groß sein und einen leistungsfähigen Computer benötigen, um eine schnelle Datenbank-Suche zu erreichen.
  2. Download ProteoWizard und anregen-Suite auf dem Computer Suche Datenbank gewidmet.
    Hinweis: ProteoWizard und anregen Suite sind Open-Source-Software und können online eingesehen werden (ProteoWizard: Http://proteowizard.sourceforge.net; Anregen-Suite: Http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/). UniProt Datenbanken Datenbankrecherchen dienen und finden Sie auf der Website der UniProt.
  3. Konvertieren Sie die Ausgabe-Dateien auf .mzML Dateien mit Msconvert, ein MS-Datei-Format-Konvertierungs-Werkzeug in ProteoWizard28. Klicken Sie in der GUI des Msconvert (MSConvertGUI.exe) auf Durchsuchen und wählen Sie die Ausgabe-Datei konvertiert werden. Wählen Sie MzML als Ausgabeformat und halten Sie alle anderen Optionen auf ihre Standardwerte. Klicken Sie in der rechten unteren Ecke des GUI starten .
  4. .Msalign-Dateien mit dem TopFD-Werkzeug in anregen Suite29umwandeln Sie .mzML-Dateien.
    1. Klicken Sie in der GUI des TopFD (topfd_gui.exe) auf Datei und wählen Sie die .mzML-Datei, die im vorherigen Schritt erstellt. Behalten Sie die Standardwerte der Parameter, und klicken Sie den Button in der rechten unteren Ecke des GUI starten .
      Hinweis: TopFD wandelt Vorläufer und Fragment isotopischen Cluster Monoisotopic Massen und identifiziert mögliche Proteoform Features in MS1 Daten indem Vorläufer isotopischen Cluster mit ähnlichen Monoisotopic Masse und enge Zugzeiten. Drei Dateien werden von TopFD, einschließlich eine ms1.msalign-Datei, eine ms2.msalign-Datei und eine pro-Datei erzeugt werden. Die ms1.msalign und ms2.msalign Dateien enthalten deconvoluted Monoisotopic Massen von MS1 und MS/MS Spektren, beziehungsweise. Die Projektvorlage Datei enthält mögliche Proteoform Funktionen.
  5. Führen Sie eine Datenbanksuche mit anregen (Version 1.1.3) anregen Suite30.
    1. Klicken Sie in der anregen GUI (toppic_gui.exe) auf Datenbank-Datei und wählen Sie eine entsprechende Datenbank für die Suche.
    2. Klicken Sie auf Spektrumdatei und wählen Sie die ms2.msalign-Datei in Schritt 5.4.1 als Eingabe erzeugt. Wählen Sie die MS1-Feature-Datei und wählen Sie die pro-Datei in Schritt 5.4.1 generierten.
    3. Cystein Carbamidomethylation (C57) als feste Modifikation durch die IAA-Behandlung festgelegt.
      Hinweis: Eine Text-Datei kann auch mit verschiedenen festen Modifikationen von einem Text-Editor erstellt werden. Dann kann der Text-Datei ausgewählt werden, mithilfe der Datei -Schaltfläche neben festen Modifikationen in der GUI, anregen.
    4. Wählen Sie das Decoy Datenbank -Objekt, und wählen Sie unter cutoff Einstellungen FDR (false Discovery Rate) im Dropdown-Menü neben Spektrum Ebene. Legen Sie die FDR auf 0,01 auf der Spektrum-Ebene und 0,05 auf Proteoform Ebene.
      Hinweis: Anregen bietet mehrere Optionen zum Filtern der Ergebnisse: Spektrum-Ebene FDR, FDR Proteoform-Ebene, oder beides. Die FDR wird anhand der Ziel-Lockvogel Ansatz31.
    5. Generierung von Funktion deaktiviert und die Fehlertoleranz (ppm) auf 15 zu verlassen.
    6. Wählen Sie unter Erweiterte Parameter2 für die maximale Anzahl von massiven Verschiebungen in der Drop-Down-Menü. Legen Sie die maximale Masse verschieben (Da) , unbekannte Änderungen bis 500 Da. lassen Sie alle anderen Parameter auf ihre Standardwerte und klicken Sie auf die Schaltfläche unten rechts auf die GUI starten .
      Hinweis: Die anregen-Software erzeugt zwei resultierenden Textdateien. Die Datei mit der Endung. OUTPUT_TABLE enthält die Liste der identifizierten Proteoform-Spektrum Spiele (PrSMs), und das mit einem Suffix. FORM_OUTPUT_TABLE enthält die Liste der identifizierten Proteoforms. Für jede PrSM die Software bietet allgemeine Informationen über das Spiel, das beobachtete Zersplitterung Muster, aufeinander abgestimmten Fragment-Ionen, und erkannten Masse verschoben.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt ein Diagramm des dynamischen pH-Junction-basierte CZE-ESI-MS Systems in das Experiment verwendet. Ein langer Stecker der Probe in einem grundlegenden Puffer wird in einem LPA-beschichtete Trennung Kapillare gefüllt mit einer sauren BGE injiziert. Nach der Anwendung von hoher Spannungen werden I und II, die Analyten in der Probe Zone konzentriert über die dynamische pH-Kreuzung-Methode. Um die Ertragskraft der CZE-MS-System wird in...

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Diskussion

Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll um CZE-MS/MS für die hochauflösende Charakterisierung von Proteoforms in einfachen Proteinproben und der großen Identifikation von Proteoforms in komplexen Proteom Proben verwenden. Ein Diagramm der CZE-ESI-MS/MS-System ist in Abbildung 1dargestellt. Es gibt vier wichtige Schritte im Protokoll. Erstens ist die Erstellung von qualitativ hochwertigen LPA-Beschichtung auf der inneren Wand der Kapillare Trennung extrem wichtig. Eine Trennung L...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren danken für die freundliche Bereitstellung Escherichia coli Zellen für die Experimente Heedeok Hong Gruppe an der Michigan State University, Department of Chemistry. Die Autoren danken der Unterstützung aus dem National Institute of General Medical Sciences, der National Institute of Health (NIH) durch Grant R01GM118470 (zu X. Liu) und Grant R01GM125991 (L. Sonne und X. Liu).

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Fused silica capillaryPolymicro Technologies106815001750 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pelletsMacron Fine Chemicals7708-10Corrosive
LC-MS grade waterFisher ScientificW6-1
Hydrochloric acidFisher ScientificSA48-1Corrosive
MethanolFisher ScientificA456-4Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylateSigma-AldrichM6514Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acidAcros Organics423805000Highy toxic
AcrylamideAcros Organics164855000Toxic, health hazard
Ammonium persulfateSigma-AldrichA3678Health hazard, Oxidizer
lysozymeSigma-AldrichL6876
Cytochrome CSigma-AldrichC7752
MyoglobinSigma-AldrichM1882
ß-caseinSgma-AldrichC6905
Carbonic anhydraseSigma-AldrichC3934
Bovine serum albuminSigma-AldrichA2153
UreaAlfa Aesar36428-36
DL-DithiothreitolSigma-AldrichD0632Health Hazard
IodoacetamideFisher ScientificAC122270250Health Hazard
Formic AcidFisher ScientificA117-50Corrosive, Health Hazard
C4 trap columnSepax Technologies110043-4001C3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
AcetonitrileFisher ScientificA998SK-4Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich1066-33-7
Nalgene rapid-flow filtersThermo Scientific126-00200.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cellsK-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered salineSigma-AldrichD8537
BCA assayThermo Scientific23250
AcetoneFisher ScientificA11-1
HPLC system for protein desaltingAgilient1260 Infinity II
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
CE autosamplerCMP ScientificECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interfaceCMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette pullerSutter InstrumentsP-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysisBranson101063196Model S-250A
Vaccum concentratorThermo Fisher ScientificSPD131DDA-115

Referenzen

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