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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen detaillierten Workflow für die Generierung und ex-Vivo Charakterisierung von onkolytische Viren für den Ausdruck von Immunmodulatoren, Masern-Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers als Beispiel verwenden. Anwendung und Anpassung an andere Vektor-Plattformen und transgene beschleunigt die Entwicklung von neuartigen Immunovirotherapeutics für klinische Übersetzung.

Zusammenfassung

Erfolgreich den Krebs-Immuntherapie hat das Potenzial, langfristige Tumorkontrolle zu erreichen. Trotz der jüngsten klinischen Erfolge bleibt ein dringender Bedarf an sicheren und wirksamen Therapien auf individuellen Tumor immun Profile zugeschnitten. Onkolytische Viren ermöglichen die Induktion von Anti-Tumor-Immunantwort sowie Tumor beschränkt Genexpression. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung und Ex Vivo-Analyse der immunmodulatorische onkolytische Vektoren. Fokussierung auf Masern-Impfstoff Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers als Beispiel, kann die allgemeine Methodik zu anderen Virus-Arten und transgene angepasst werden. Die dargestellte Workflow umfasst Design, Klonen, Rettung und Verbreitung von rekombinanten Viren. Assays zur Replikation Kinetik und lytische Aktivität des Vektors sowie Funktionalität des isolierten Immunmodulator ex Vivo Analyse enthalten sind, und erleichtert so die Generation der neuen Agenten für die weitere Entwicklung in präklinischen Modellen und letztlich klinische Übersetzung.

Einleitung

Onkolytische Viren (OVs) entstehen als Anti-Krebs-Therapeutika, die speziell in replizieren und Tumorzellen zu töten, wobei gesundes Gewebe intakt bleibt. Es ist mittlerweile gemeinsamen Verständnis, dass onkolytische Virotherapie (OVT), in den meisten Fällen, verlässt sich nicht allein auf komplette Tumor-lyse durch effiziente Replikation und die Verbreitung des Virus, aber erfordert zusätzlichen Wirkmechanismen Behandlungserfolg, einschließlich vaskuläre und Stromazellen targeting und allem Immunstimulation1,2,3,4. Während viele OV Frühstudium unveränderte Viren verwendet, hat aktueller Forschung profitiert eine verbesserte biologische Verständnis, Virus Biobanken, die potenziell Roman OVs und die Möglichkeiten der Gentechnik um erweiterte OV schaffen enthalten Plattformen5,6,7.

Angesichts der jüngsten Erfolge der Immuntherapie, sind immunmodulatorische transgene von besonderem Interesse bezüglich der Gentechnik OVs. Gezielte Ausdruck solcher gen-Produkte von OV-infizierte Tumorzellen reduziert die Toxizität im Vergleich zu systemischen Verabreichung. Targeting wird mithilfe von Viren mit inhärenten Oncoselectivity oder durch Ändern der viralen Tropismus8erreicht. Lokalen Immunmodulation verbessert die facettenreichen anti-Tumor-Mechanismen der OVT. Darüber hinaus ist diese Strategie maßgeblich daran beteiligt das Zusammenspiel zwischen Viren, Tumorzellen und dem Immunsystem des Wirts zu verhören. Dieses Protokoll sieht zu diesem Zweck einen anwendbar und einstellbaren Workflow zu gestalten, Klonen, zu retten, zu propagieren und validieren onkolytische Paramyxovirus (speziell Masernvirus) Vektoren Codierung solche transgene.

Modulation der Immunantwort kann durch eine Vielzahl von Transgen-Produkten, die auf verschiedenen Stufen der Krebs-Immunität Zyklus9, einschließlich der Verbesserung der Tumor Antigen Anerkennung [z. B. Tumor-assoziierten Antigenen (TAAs) oder Induktoren der erreicht werden großen Histocompatibility complex (MHC) Klasse I Moleküle] über Unterstützung von dendritischen Zellen Reifung für effizienten Antigenpräsentation (Zytokine); Rekrutierung und Aktivierung gewünschte Immunzellen wie zytotoxische und T-Helfer-Zellen [Chemokine, bispezifische T Zelle Engagers (HdOs)]; Ausrichtung auf unterdrückerische Zellen wie regulatorische T-Zellen, myeloische abgeleitet Suppressor-Zellen und Tumor-assoziierten Makrophagen Krebs-assoziierten Fibroblasten (Antikörper, BTEs, Zytokine); und Vermeidung von Effektor Zellen Hemmung und Erschöpfung (Checkpoint-Hemmer). So gibt es eine Fülle von biologischen Arbeitsstoffen. Bewertung von solchen Virus-codierte Immunmodulatoren zur therapeutischen Wirksamkeit und mögliche Synergien sowie Verständnis der jeweiligen Mechanismen ist notwendig, Verbesserung der Krebstherapie.

Negativen Sinne einzelsträngigen RNA-Viren der Familie Paramyxoviridae zeichnen sich durch mehrere Merkmale förderlich für ihre Verwendung als onkolytische Vektoren. Dazu gehören ein natürliches Oncotropism, große genomische Kapazität für transgene (mehr als 5 kb)10,11, effiziente Verbreitung einschließlich Syncytia Bildung und hohe Immunogenität12. Daher OV-Plattformen basierend auf Hundestaupe Virus13, Mumps-Virus14, Newcastle Disease Virus15, Sendai-Virus16,17, simian Virus 518und Modellorganismus Paramyxovirus19 entstanden sind. Vor allem live abgeschwächten Masern-Virus-Impfstoff, die Stämme (MV) in präklinischen und klinischen Entwicklung20,21vorangekommen sind. Diese Virusstämme wurden jahrzehntelang für Routineimpfungen mit einen ausgezeichneten Sicherheit Aufzeichnung22verwendet. Darüber hinaus gibt es kein Risiko für insertional Mutagenese durch die streng cytosolischen Replikation von Paramyxoviruses. Ein vielseitiges reverse Genetik-System basierend auf Anti-genomische cDNA ermöglicht eine Einfügung von transgenen in zusätzliche Transkriptionseinheiten (ATUs) ist verfügbar11,23,24. MV-Vektoren Codierung Natrium-Iodid-Symporter (MV-NIS) für Bildgebung und Strahlentherapie oder lösliche carcinoembryonales Antigen (MV-CEA) als ein Surrogat-Marker für virale Genexpression werden derzeit in klinischen Studien (NCT02962167, NCT02068794, geprüft NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 und NCT00408590). Sichere Verwaltung bestätigt wurde und der Anti-Tumor-Wirkung wurden Fälle in früheren Studien25,26,27,28,29, 30 (rezensiert von Msaouel et al.31), ebnet den Weg für zusätzliche onkolytische Masern-Viren, die entwickelt wurden und preclinically getestet. MV Codierung immunmodulatorische, die Moleküle gezielt verschiedene Schritte des Krebs-Immunität Zyklus gezeigt worden, um Tumorwachstum verzögern und/oder verlängert Überleben bei Mäusen, mit Nachweis für immun-vermittelte Wirksamkeit und schützende immun Langzeitgedächtnis im Phänomen Maus-Modellen. Vektor-codierte transgene gehören Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF)32,33, H. Pylori Neutrophilen-aktivierende Protein34, immun Checkpoint-Hemmer35 Interleukin-12 (IL-12)36, TAAs37und BTEs38, die ein Tumor Oberflächenantigen mit CD3 zu vernetzen und so induzieren anti-Tumor-Aktivität von polyklonalen T-Zellen, unabhängig von der T-Zell-Rezeptor Spezifität und Co-Stimulation ( ( Abbildung 1). Die vielversprechende präklinische Ergebnisse für diese Konstrukte weitere translational Anstrengungen bedarf.

Talimogene Laherparepvec (T-VEC), eine Art ich Codierung GM-CSF, Herpes-Simplex-Virus ist die einzige onkolytische therapeutische genehmigt durch die United States Food und Drug Administration (FDA) und European Medicines Agency (EMA). Die Phase-III-Studie führt zu Genehmigungen Ende 2015 hat nicht nur Wirksamkeit auf dem Gelände des Intra-Tumor Injektion, aber auch Abscopal Effekte (z.B. Remissionen nicht injiziert Läsionen) in fortgeschrittenem Melanom39gezeigt. T-VEC getreten da zusätzliche Prüfungen für die Anwendung in anderen Tumorentitäten (z.B., nicht-Melanom-Hautkrebs, NCT03458117, Bauchspeicheldrüsenkrebs, NCT03086642) sowie eine Bewertung der Kombinationstherapien, vor allem mit immun-checkpoint Inhibitoren (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 und Ribas et al.40).

Dies zeigt nicht nur das Potential der onkolytische Immuntherapie, sondern auch die weiteren Forschungsbedarf, hervorragende Kombinationen von OVT und Immunmodulation zu identifizieren. Rationales Design von zusätzlichen Vektoren und ihre Entwicklung zur präklinischen Prüfung ist der Schlüssel zu diesem Unternehmen. Dies wird auch Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen voraus und hat Auswirkungen auf die Entwicklung hin zu stärker personalisierten Krebstherapie. Zu diesem Zweck präsentiert dieser Publikation die Methodik für die Modifikation und Entwicklung von Paramyxoviruses für gezielte Krebsimmuntherapie und genauer gesagt, der onkolytische Masern-Viren Codierung T-Zell-Gewinnung Antikörper (Abbildung 2).

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Protokoll

Hinweis: [O], [P] und [M] Unterabschnitte für anzugeben: OVs im Allgemeinen, (die meisten) Paramyxoviruses oder MV nur, beziehungsweise. [B] zeigt Abschnitte speziell für BTE transgene.

1 Klonen von transgenen Immunmodulator Codierung in Masern-Virus-Vektoren

  1. [O] Design einfügen Sequenz.
    1. [O] entscheiden Sie sich für ein Immunmodulator Interesse basierend auf Literaturrecherchen oder explorative Daten wie genetische Bildschirme41 und ableiten die relevanten cDNA-Sequenz aus entsprechenden Datenbanken wie GenBank, die europäischen Nukleotid-Archiv oder die internationalen Immungenetik-Informationssystem (IMGT).
    2. [O] zusätzliche Elemente hinzufügen der Transgen-Sequenz (Abbildung 3). Eine vorhergehende Kozak-Sequenz und artspezifische Codon Optimierung können Ausdruck verbessern. Signalsequenzen sind erforderlich für Sekretion. Enthalten Sie Sequenzen, die Codierung N - und/oder C-terminale Protein-Tags für Erkennung und Reinigung42. Gehören Sie Restriktionsschnittstellen zum Einfügen in den Vektor.
      Hinweis: [M] zusätzliche Transkriptionseinheiten (ATUs) beherbergen MV Polymerase gen beginnen und Signale sind für Transgene Ausdruck von rekombinanten MV Genome notwendig. Geeignete Anti-genomische DNA-Vektoren, CMV Promotoren und enthaltenden ATUs mit einzigartigen Restriktionsschnittstellen für die Einführung von positiven Sinne transgenen an definierten Positionen gesteuert haben bisher11entwickelt. [P] angemessene Positionierung des Transgens ist entscheidend, da es virale Replikation und Transgene Ausdruck durch den Ausdruck Verlauf typisch für Paramyxoviruses43betrifft. Einführung in ein ATU in der Nähe der 3'-Ende des Anti-Genoms (dh., in die Führungsposition oder flussabwärts des Gens P ) führt in der Regel hohe Transgene Ausdruck auf Kosten reduzierter Virusreplikation. Erhöhte Replikation und unteren Ebenen des Transgens Ausdrucks können erwartet werden, bei Verwendung der ATU stromabwärts des Gens H . Verpackung des Genoms von mehreren Paramyxoviruses, einschließlich der Masern-Virus, erfordert jede Nukleokapsid Protein44Bindung von sechs Nukleotide. Zum Einfügen von transgenen in solchen Viren sicherzustellen Sie, dass die Anzahl der Nukleotide des kompletten Genoms durch sechs teilbar sein wird. Dies wird auch als "Herrschaft der sechs"45,46bezeichnet. Gegebenenfalls enthalten Sie zusätzliche Nukleotide im Einsatz (der Kozak Sequenz vor- oder nachgelagerten Stop-Codons) ohne Rahmen Verschiebungen oder vorzeitige Stopp-Codon. [M] vermeiden Sie bestimmte Sequenzen in das Transgen, die sind ähnlich wie MV gen Start (AGGRNCMARGW) und stoppen (RTTAWANAAAA) Signale und RNA-Sequenzen (AAAAAGGG) bearbeiten. Solchen Konsensus-Sequenzen wurden veröffentlicht (siehe z. B. Parks Et Al.47).
    3. [O] kaufen Oligonukleotid der gewünschten Sequenz oder montieren von verfügbaren Sequenzen mit standard molekularen Klonen48.
      Hinweis: [O] für PCR-Amplifikation des Transgens entwerfen Sie eine forward Primer einschließlich der vorgelagerten Einschränkung-Website und den ersten 15-20 Nukleotiden des Einsatzes und eine rückwärts-Primer einschließlich des letztes 15-20 Nukleotiden des Einsatzes durch die nachgeschaltete Beschränkung gefolgt Website.
  2. [O] Klon einfügen in DNA Kodierung der viralen (Anti-) Genom.
    1. [O] Klonen des Einsatzes in DNA-Vektoren oder DNA Anti-Genome von RNA-Viren durch standard molekularen Klonen Techniken48 (d. h., enzymatischen Restriktion gefolgt von DNA-Ligatur).
      1. [O] zu verhindern, dass Re Unterbindung des Vektors mit nicht-kompatiblen Restriktionsschnittstellen oder durch de-Phosphorylierung vor der Ligatur.
      2. [O] die Ligatur Produkt durch Agarose-Gelelektrophorese und anschließende Gel Reinigung mit handelsüblichen Kits zu isolieren. Im Allgemeinen wird eine optimale Ligatur Effizienz bei einem 3:1 molare Verhältnis von einfügen, um Vektor-erreicht.
    2. [O] Transformation der Ligatur Produkt in zuständigen Bakterien für effiziente Rückgewinnung von großer Plasmide geeignet (d. h., durchführen Hitzeschock von E. Coli49) und identifizieren bakterieller Klone beherbergen die richtige DNA von Colony PCR50 .
    3. [O] Isolat verstärkt DNA aus einem einzigen bakterielle Klon mit im Handel erhältlichen DNA-Vorbereitung-Kits. Genomische Integrität von Kontrolle Digest mit geeigneten Restriktionsenzymen zu bestätigen (z.B., HindIII für MV Genome [M]). Richtig einsetzen und die Integrität des Transgens durch Sequenzierung zu bestätigen.
      Hinweis: [M] für transgene eingefügt in die MV- H- ATU, Sanger durchführen Sequenzierung mit die folgenden Primer: H-9018 [forward Primer, bindet an MV Genom Position 9018 in H open reading Frame (ORF)]: 5' GTGTGCTTGCGGACTCAGAATC 3'; L-9249 + (reverse Primer, bindet an MV Genom Position 9249 im ORF L ): 5' CAGATAGCGAGTCCATAACGG 3'.

(2) Rettung rekombinante Masern-Virus-Partikel, die Codierung Immunmodulatoren

  1. [O] generieren Sie rekombinanten Virus-Partikel aus (Anti-) genomische DNA über Transfektion von Virus Produzent Zellen nach dem Standardprotokoll für die jeweiligen Virus. Richtlinien Sie für das Arbeiten unter sterilen Bedingungen. Führen Sie Zellkultur unter Hauben, insbesondere alle Schritte mit Virus in biologische Sicherheitswerkbänke der Klasse II.
    1. [M] für die Rettung von Masern-Viren aus cDNA23,24, Platte MV Produzent (African Green Monkey Niere stammenden Vero) Zellen gleichmäßig auf eine 6-Well-Platte 24 h vor Transfektion. Samen 2 x 105 Zellen in 2 mL Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) pro Bohrloch 65 – 75 % Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion zu erreichen.
      Hinweis: [P] reduzieren Sie Zellzahlen, wenn die Zellen vor virusbedingte Syncytia Bildung überwuchern.
    2. [P] Transfect Zellen mit DNA Kodierung Plasmide virale Anti-Genom, erforderliche Helfer und, falls gewünscht, ein Plasmid Codierung einen fluoreszierenden Reporter Transfektion Effizienz bewerten.
      1. [M] Mix 5 µg der rekombinanten DNA Kodierung das Masern-Virus Anti-Genom, 500 ng von Säugetieren Ausdruck Plasmide Codierung Masernvirus N und L Proteine und 100 ng der Plasmide P Protein und einem fluoreszierenden Reporter in einem Gesamtvolumen von 200 µL DMEM-Codierung.
      2. 18.6 µL liposomalen Transfection Reagens hinzufügen, sofort durch Streichen der Röhre mischen und 25 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
      3. [P] ersetzen Sie das Medium mit 1,8 mL DMEM, 2 % FBS, 50 µg/mL Kanamycin (oder andere Antibiotika um Kontaminationen zu vermeiden) pro Well, dann geben Sie die Transfektion Mischung tropfenweise in die und schwenken Sie vorsichtig. Inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2. Ersetzen Sie Medium mit 2 mL frische DMEM, 2 % FBS und 50 µg/mL Kanamycin am nächsten Tag; Wiederholen Sie diesen Vorgang, wenn Medium sauer wird.
        Vorsicht: [O] wie Virus aus Transfektion durch die folgenden Schritte möglicherweise behandeln Sie Zellen und Materialien vorschriftsmäßig Biosafety. (Potentiell) infektiöser Abfälle ordnungsgemäß entsorgen.
  2. [P] sammeln und Viruspartikel zu propagieren.
    1. [P] beobachten Sie Zellen täglich durch Mikroskopie für Reporter-gen Ausdruck und Syncytia Bildung (Abbildung 4). Virus zu ernten, wenn große Syncytia, bestehend aus 20 oder mehr Zellen sichtbar sind, oder wenn Zellen zu dicht werden (dh., wenn sie anfangen zu wachsen in mehreren Schichten, in der Regel nach 7 – 9 Tagen).
      Hinweis: [P] Wenn keine Syncytia für einen gegebenen Vektor-Konstrukt beobachtet werden, bedeutet dies nicht notwendigerweise, dass die Rettung gescheitert ist. Überweisen Sie ansteckende Virus möglicherweise trotzdem in der Probe vorhanden, frische Produzent Zellen zur Passagierung.
    2. [P] Samen ca. 1,5 x 106 Produzent Zellen in 12 mL DMEM mit 10 % FBS, auf 10 cm 24 Stunden vor der erwarteten Ernte oder 2,5 x 106 Zellen pro Gerichte Platte 4 – 6 h vor Passagierung Virus, 65-75 % Konfluenz zum Zeitpunkt der Virus Inoculat zu erreichen Ion.
    3. [P] um Virus nachkommen zu sammeln, sorgfältig kratzen Sie anhaftende Produzent Zellen von der Platte mit einem Schaber Zelle und übertragen Sie den Überstand mit Zellen in einem Zentrifugenröhrchen zu. Entfernen Sie die Zelle Ablagerungen durch Zentrifugation für 5 min bei 2.500 X g und 4 ° C.
      Hinweis: Geschabte Zellen können direkt ohne Zentrifugation Virus Übertrag auf Kosten der suboptimale Kulturbedingungen und potenzielle Mikroskopie Artefakte zu maximieren übertragen werden.
      Vorsicht: [O] vermeiden Sie Medien zu verschütten, wenn Zellen zu kratzen. Minimieren Sie Aerosolbildung.
    4. [P] bereiten Sie Inokulum durch Mischen des zellfreie Überstands aus Schritt 2.2.3 mit serumfreien Medium zu einem Endvolumen von 4 mL. Ersetzen Sie das Medium auf Produzent Zellen durch das Inokulum und inkubieren Sie Zellen für mindestens 2 h bei 37 ° C und 5 % CO2. Fügen Sie 6 mL DMEM mit 10 % FBS und inkubieren Sie Zellen über Nacht vor dem Wechsel des Mediums zu 12 mL frische DMEM mit 10 % FBS.
    5. [P] zu beobachten, die Zellen mindestens zweimal täglich und Ernte-Virus vor Syncytia platzen (d. h., als Membran Störung sichtbar wird). Um den ersten Durchgang des Virus zu ernten, Überstand von der Platte zu entfernen, fügen Sie 600 µL serumfreien Medium kratzen Zellen mit einer Zelle Lifter und übertragen auf ein sauberes Röhrchen.
      Hinweis: [M] je nach Virus-Stamm51,52 und das Fortschreiten der Infektion übertragen Sie Platten mit infizierten Zellen auf 32 ° C, virale Replikation und Verbreitung zu erleichtern. In der Regel propagieren MV Schwarz Stämme gut bei 37 ° C, während der Übertragung von Zellen mit Edmonston B Belastung Viren auf 32 ° C führt zu langsameren Syncytia Bildung aber höhere Titer infiziert.
      Hinweis: [P] lassen Sie Zellschicht während der Ernte, trocknen nicht, da dies zu geringeren Infektiosität der Viruspartikel führt. Obwohl einige Virus verloren geht, wenn den Überstand der infizierten Zellen zu verwerfen, können höhere Titer der Zellschicht entnommen werden.
    6. [P] sofort frieren Sie die Virus-Aussetzung in flüssigem Stickstoff ein. Shop bei-80 ° C für mindestens 24 h darauf gründlich einfrieren. Erstrecken Sie sich auf mehrere Tage, um die Prozedur zu unterbrechen Wenn nötig.
    7. Lösen Sie Viruspartikel durch Auftauen bei 37 ° C. Homogenisieren von aufschütteln und Zentrifuge für 5 min bei 2.500 X g und 4 ° C. Übertragen Sie die Überstände beschrifteten Cryoröhrchen und Store bei-80 ° C.
      Hinweis: [O] bewahren Sie Viren in aliquoten Größen ausreichend für spätere Experimente, auf, da sie bevorzugt nur einmal aufgetaut und sofort verwendet werden. [P] Frost-Tau-Zyklen oder Lagerung bei 4 ° C über mehrere Tage führen deutliche Reduzierung der viralen Titer.
    8. [P] einen Tag vor der weiter zur Erreichung erforderlichen Menge und Titer, Passagierung Samen 4 x 106 Produzent Zellen in 12 mL DMEM mit 10 % FBS 15 cm Gerichte. Mit einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 0,03-Virus immun. In 8 mL serumfreien Medium pro Platte zu infizieren und ändern Sie Medium in DMEM mit 10 % FBS nach Inkubation Zellen für mindestens 2 h Skala mit mehreren Platten.
    9. Ernte wie unter Schritt 2.2.5, wenn Syncytia über die ganze Zelle Schicht ausgebreitet haben. Bündeln Sie die erhaltenen Suspensionen in 50 mL-Tuben und Prozess beschriebenen Schritte 2.2.6–2.2.7.
      Hinweis: [O] Es ist wichtig, alle Platten optisch auf bakterielle und Pilzinfektionen Kontamination vor der Ernte zu überprüfen. Überprüfen Sie in der Regel alle Zelllinien regelmäßig auf Kontaminationen mit Mykoplasmen oder zufällige Viren mittels Multiplex-PCR.
  3. [P] Evaluate virale Titer. Titer von Virus-Bestände in Octuplicates pro aliquoten mit 96-Well Platten zu bestimmen. Durchführen Sie Titration von drei einzelnen Aliquote pro Virus Rettung und verwenden Sie den Durchschnittswert, um die Berechnung des Virus Aussetzung in Experimenten verwendet werden.
    1. [P] Pool Hersteller Zellen, Graf, und passen Sie auf 1,5 x 105 Zellen pro mL in DMEM mit 10 % FBS.
    2. [P] Pipettieren 90 µL DMEM mit 10 % FBS in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
    3. [P] 10 µL aus ein Aliquot der Virus bestand in allen 8 Vertiefungen in der ersten Spalte der Platte und gründlich mischen durch Pipettieren mindestens 10 Mal rauf und runter.
    4. [P] führen Sie 10-divisibel Verdünnungsreihen des Virus. Übertragen von 10 µL jedes gut aus der ersten in die zweite Spalte mit einem Mehrkanal-pipettieren. Von oben und unten Pipettieren mischen Sie gründlich und verwenden Sie frische Pipettieren Tipps für jedem Verdünnungsschritt. 10 µL aus jedem Brunnen der letzten Spalte zu verwerfen.
      Hinweis: Jede 96-Well-Platte ermöglicht 12 serielle Verdünnung Schritte. [M] für MV-Vektoren 8 Stufen des 10-divisibel Verdünnungen sind in der Regel ausreichend, als Titer über 1 x 109 Zelle infektiöse Einheiten (Ciu) /mL selten erhält man, indem die Methode der Fortpflanzung im Schritt 2.2 beschrieben. [P] Kontroll-Vertiefungen ohne Virus können zum Vergleich und zur Überwachung von Kontamination verwendet werden.
    5. [P] fügen Sie 100 µL Zellsuspension in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 48 h stellen Sie sicher das Fehlen der Zelle Klumpen in der Suspension, homogene Verteilung der Zellen zu erreichen.
    6. [P] Check für Syncytia mit einem Lichtmikroskop. Zählen Sie Syncytia in jede Vertiefung der Spalte mit der höchsten Verdünnungsfaktor mit sichtbaren Syncytia.
    7. [P] berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Syncytia pro Bohrloch in dieser Spalte durch die Gesamtzahl der Syncytia durch acht geteilt. Multiplizieren Sie diesen Durchschnitt mit der Verdünnungsfaktor der jeweiligen Spalte, beginnend bei 102 Ciu pro mL für die erste Spalte53 (siehe Abbildung 5 als Beispiel).

3. Bestimmung der replikative und zytotoxische Kapazitäten von viralen Vektoren Codierung Immunmodulatoren

  1. [O] vergleichen Sie Replikation Kinetik des generierten rekombinanten Virus und die unveränderte Vektor mit einstufigen oder mehrstufigen Wachstumskurven (GCs). Für einstufige GCs sind virale Nachkommen beurteilt nach gleichzeitiger Infektion aller Zellen (theoretisch 100 % Infektion). Mehrstufige GCs beginnen bei einem geringen Prozentsatz der infizierten Zellen mehrere Folgen Runden der Virusreplikation.
    1. [M] für die Analyse der Masern-Virus-Replikation-Kinetik, seed 1 x 105 Vero-Zellen in 1 mL DMEM mit 10 % FBS pro Bohrloch auf 12-Well-Platten einen Tag vor der Infektion. Platte mit mindestens zwei Brunnen für jeden Timepoint von Interesse als technische repliziert.
    2. [O] infizieren die Zellen mit dem Virus bei niedrigen MOI für mehrstufige oder bei hohen MOI für einstufige GCs [M] (0,03 und 3 für die MV-Replikation auf Vero Zellen). Ersetzen Sie Medium mit 300 µL serumfreien Medium mit der entsprechenden Menge des Virus und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für mindestens 2 h entfernen Inokulum, fügen Sie 1 mL DMEM mit 10 % FBS, und weiter Inkubation.
    3. [P] an relevanten Zeitpunkten wie 12, 24, 36, 48, 72 und 96 h nach Infektion ernten Sie virale Nachkommen durch Schaben direkt Zellen in das Medium. Inhalt von jedem Bohrloch auf eine einzelne Röhre übertragen, Snap-Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Lagerung bei-80 ° C bis Titration.
      Hinweis: [P] replicate Proben können bei diesem Schritt zur Analyse der durchschnittlichen Titer gebündelt werden.
    4. [P] Sammle Proben von allen Zeitpunkten. Tauen Sie gleichzeitig bei 37 ° C zur Beurteilung der viralen nachkommen. Wirbel und Pellet Zellenrückstand durch Zentrifugation für 5 min bei 2.500 x g und 4 ° C.
    5. [P] berechnen Sie durchschnittliche Titer jedes Konstrukt und Timepoint wie oben beschrieben. Plot-Titer im Laufe der Zeit. Vergleichen Sie Wachstumskurven von Vektoren mit und ohne eingefügte transgene, mit verschiedenen transgene oder transgene an verschiedenen Positionen eingefügt (siehe Abbildung 6).
  2. [O] vergleichen Sie lytische Aktivitäten der Immunmodulator Codierung und unveränderten Viren.
    1. [O] wählen Sie von möglichen Methoden einschließlich Impedanz Messungen, Laktat-Dehydrogenase (LDH) release Assay oder Stoffwechsel-basierte farbmetrischen Zellviabilität assays [z. B., 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT ) und 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) assays].
      1. [M] zu analysieren, Zytotoxizität von Masern assay Virus Vektoren mit XTT, Saatgut-Vero-Zellen wie unter Punkt 3.1.1 beschrieben. Gehören Sie Wiederholungen eines nicht infizierten Steuerelements für jedes Timepoint.
        Hinweis: [O] XTT Assay an verschiedenen Zeitpunkten an derselben Probe durchführen kann technische Fehler beschränken, sondern mehrmaliges Waschen und Exposition gegenüber XTT Reagenz Anzahl der lebensfähigen Zellen beeinflusst. Impedanz bietet eine alternative Anzeige für Dauermessungen.
    2. [M] infizieren Sie Vero-Zellen bei einer MOI von 1 wie in Schritt 3.1.2 beschrieben.
      Hinweis: [M] für Infektion der weniger freizügig Zielzellen wie einige murinen Tumor-Zell-Linien kann ein höheres MOI von 3 oder 5 notwendig sein.
    3. [O] an Zeitpunkten von Interesse (z. B.., 12, 24, 36, 48, 72 und 96 h nach der Infektion) bereiten Sie die erforderliche Menge an XTT Reagenz (dh., 300 µL pro gut plus 10 % Überschuss). Vermeiden Sie Belichtung.
    4. [M] bei jedem Timepoint entfernen Sie Mittel aus den jeweiligen Brunnen. Ersetzen von 300 µL XTT Reagenz und Inkubation bei 37 ° C im Dunkeln. Überstände zu sammeln, wenn das Reagenz in der Kontroll-Vertiefungen tiefrot,, die in der Regel zwischen 15 Minuten und 2 Stunden dauert gedreht hat, und frieren bei-20 ° C.
      Hinweis: [O] Inkubationszeiten hängen Virus Konstrukt, Zelltyp, Dichte und zytopathischen Effekt.
    5. [O] nach sammeln Auftauen aller Proben gleichzeitig. 100 µL jeder Probe auf einer 96-Well-Platte übertragen und Messen optische Extinktion bei 450 nm, mit 630 nm als eine Referenzwellenlänge.
    6. [O] Grundstück Zeitpunkte (x-Achse) Vs. optische Absorption von Proben im Vergleich zu Kontrollen, metabolische Aktivität als Surrogat für die Zellviabilität (y-Achse) angibt. Virale Zytotoxizität bedeutet relative Absorption im Laufe der Zeit abnimmt (siehe Abbildung 6B).

4. Analyse der Aktivität des Virus-codierte Immunmodulatoren abgesondert von infizierten Zellen

  1. [O] isolieren sekretierten Transgen Produkte durch Virus-infizierten Zielzellen ausgedrückt.
    1. [P] lassen Sie Virus-Hersteller wachsen Zellen zu 70 % Konfluenz in T175 Fläschchen.
    2. [P] entfernen Sie Medium aus Zellen und waschen Sie zweimal mit 12 mL PBS, Serum zu entfernen. Zellen mit Virus bei einer MOI von 0,03 in 12 mL serumfreien Medium zu impfen und Inkubation über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2 . Medium mit 12 mL frisches serumfreien Medium zu ersetzen.
      1. [M] für Edmonston B Viren übertragen Sie Zellen von 37 auf 32 ° C nach 40 h für ein weiteres 24 h Inkubation Infektion erleichtern und verhindern vorzeitige Platzen der Syncytia. Je nach Virusstamm können für eine optimale Proteinausbeute und Reinheit51,52 und Syncytia fortschreiten, Inkubation Temperaturen und Zeiten angepasst werden.
    3. [P] sammeln Sie sorgfältig Überstände ohne trennen Zellen vor Syncytia platzen. Optimal, haben Syncytia über die gesamte Zelle Schicht verteilt. Pool-Überstände in 50 mL-Tuben.
      Hinweis: [P] für effiziente Reinigung des Transgens Produkts vermeiden Sie platzen der Syncytia und minimieren Sie Zellenrückstand zu, wenn die Überstände der infizierten Zellen zu ernten.
    4. [P] entfernen Sie Zelle Verschmutzungen aus der Überstand durch Zentrifugation für 5 min bei 2.500 x g und 4 ° C und Weitergabe durch 0,22 µm-Filter. Je nach das Gesamtvolumen des Filtrats kann dies mit einer Spritze oder einer Vakuumpumpe durchgeführt werden.
    5. [O] Transgene Produkt mit einer geeigneten Reinigungsverfahren zu isolieren. Proteine mit einem Hexa-Histidin (His) durch den Austausch Affinitätschromatographie mit Ni-NTA Mini Spin Spalten38 , wie hier in Kürze beschrieben (Schritte 4.1.5.1–4.1.5.4) zu reinigen.
      Hinweis: [O] führen Sie alle Schritte, schnell und auf Eis. Pre-chill-Puffer und Pre-kühl Zentrifuge bis 4 ° C.
      1. [O] bereiten Sie 100 mL des Puffers mit PBS, 200 mM Natriumchlorid und Imidazol bei Endkonzentrationen von 10 mM (Waschen Puffer 1, WB1) vor, 20 mM (Waschpuffer 2, WB2) und 500 mM (Elution Buffer, EB). Stellen Sie pH WB1 und WB2 bis 8,0 und EB bis 7.0. Je nach dem Protein gereinigt werden müssen Imidazol-Konzentrationen angepasst werden.
      2. [O] equilibrate Spalten mit 600 µL WB1 und Zentrifuge bei 800 X g für 2 min mit einem geöffnetem Deckel.
      3. [O] Last 600 µL des gefilterten Überstände auf Spalten. Ermöglichen Sie Bindung des His-Tags Proteine in der Spalte Matrix durch Zentrifugation bei 200 X g 5 min mit geschlossenem Deckel. Be- und Bindung können bis zu einer Gesamtkapazität von 300 µg sein-tagged Protein pro Spalte wiederholt werden.
      4. [O] waschen Sie dreimal mit WB1 und einmal mit WB2, oder bis der durchströmten farblos ist. Fügen Sie 600 µL Puffer und Spin 800 X g für 2 min mit geöffnetem Deckel.
      5. [O] eluieren Sie Protein in ein frisches Gefäß von Schritten zwei Elution mit 300 µL EB und Zentrifugation für 2 min bei 800 X g.
      6. [O] entsalzen und Produkt mit zentrifugalen Filtern nach Produktgröße zu konzentrieren. Ein Volumen von 15 mL und Filter durch Zentrifugation für 10 min bei 4.000 X gPBS hinzufügen. Wiederholen Sie, bis die gewünschte Reinheit und Konzentration erreicht wird. Um die Proteinkonzentration erhöhen, reduzieren Sie das Endvolumen auf etwa 200 µL durch Zentrifugation für 40 min bei 4.000 X g.
  2. [O] bestätigen Sie Reinheit und Identität des Produkts.
    1. [O] die Höhe der Gesamt-Protein in die Isolate mit standard farbmetrischen Assays wie Bicinchoninic Säure (BCA) oder Bradford-Test54,55zu quantifizieren. [M] typische Werte reichen von 1 – 3 µg Transgen Produkt pro mL Überstand der infizierten Zellen.
    2. [O] für relative Quantifizierung von Protein Isolate über Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) zu trennen und Coomassie-Färbung56durchführen.
    3. [O] bestätigen Sie Identität der gereinigten Produkte durch Immunoblotting mit spezifischen Antikörpern, die Ausrichtung auf das Protein oder einer damit verbundenen Peptid Tag57.
    4. [O] Protein Bindung Besonderheit mit entsprechenden Techniken, die eventuell umfassen Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA), flow Cytometry analysieren (siehe Abbildung 7). Zelle Bindung kann mit einer kürzlich beschriebenen magnetischen Pulldown-Assay38bestätigt werden.
      Hinweis: [O] verwenden Sie entsprechende Steuerelemente. In Zelle verbindliche Tests sind Negativkontrollen mit Zellen, die nicht mit dem Ausdruck des gezielte Moleküls (wie in Abbildung 9) und nicht-targeting Protein Surrogate (Abbildung 8). Im Flow Cytometry Experimente sind positiv, negativ und Isotype Steuerelemente (Abbildung 7).
      1. [O] Co inkubieren das Ziel Zellen und Protein zu isolieren, um Bindung zu ermöglichen. [B] für die Analyse der BTEs an peripherem Blut binden inkubieren Mononukleäre Zellen (PBMCs) isoliert von Menschenblut58, 2,5 x 106 Zellen mit 200 ng BTE in 100 µL PBS mit 1 % FBS (Bindung Puffer, BB) für 1 h auf dem Eis.
      2. [B] waschen Zellen mit 1 mL BB, ungebundenen Protein zu entfernen. 300 X g für 5 min Zentrifugieren, überstand verwerfen und Pellet in 100 µL der BB aufzuwirbeln. Fügen Sie Biotinylierte Antikörper gezielt das Protein des Interesses oder einem damit verbundenen Peptid-Tag hinzu und inkubieren Sie für 30 min auf Eis. Für BTEs mit Grippe Hämagglutinin (HA) Tag, Einsatz 100 ng von Anti-HA-Biotin (Klon-3F10).
      3. [B] waschen Sie Zellen zweimal mit 1 mL BB und in 80 µL BB aufzuwirbeln. Fügen Sie 20 µL Streptavidin-gekoppelte magnetische Microbeads und 15 min bei 4 ° c inkubieren
      4. [B] einmal waschen, um entfernen überschüssige Perlen und Aufschwemmen Pellet in 500 µL BB mit 2 mM EDTA (Spalte Puffer, CB) ergänzt.
      5. [B] Zellen mit Säulen und ein Magnetstativ gemäß des Anbieters Handbuch zu isolieren.
        1. [B] equilibrate dadurch, dass 500 µL CB übergeben durch die Säule durch Schwerkraft.
          Hinweis: [B] die Spalte darf nie trocken laufen. Pipettieren sorgfältig und Entgasen der Puffer, um Luftblasen zu vermeiden.
        2. [B] legen Sie ein sauberes Röhrchen unter der Spalte und der Spalte zuweisen Sie die Zelle/Wulst-Suspension. Waschen Sie die Spalte dreimal mit 500 µL CB pro Waschgang. Durchströmten Proben der Suspension und zumindest die ersten Waschschritt im Rohr, dann speichern auf Eis.
        3. [B] eluieren Sie Wulst-gebundenen Zellen erhalten durch das magnetische Feld. Entfernen Sie zu diesem Zweck die Spalte aus der Magnetstativ, legen Sie es über ein sauberes Röhrchen, fügen Sie 1 mL CB und schieben Sie schnell den Puffer durch die Säule das Rohr mit einem Kolben. Halten Sie das Rohr auf dem Eis.
      6. [B] Zentrifuge Röhren mit Durchfluss und Elution Proben für 20 min bei 16.000 x g und 4 ° C, pellet-Zellen. Überstände zu verwerfen und lösen Sie Zellen in einem Tests Testpuffer (RIPA) (empfohlene: 75 µL). Durchführen Sie SDS-PAGE56.
      7. [B] durchführen Sie Immunoblotting mit einem geeigneten Primärantikörper. Antikörper können gezielt das Transgen-Produkt oder eine zelluläre Proteine (z.B.., β-Aktin, Abbildung 8) BTE-Zelle Bindung zu beurteilen.
  3. [O] immunologische Funktion von isolierten Immunmodulatoren zu beurteilen.
    1. [O] relevanten Tests nach den Merkmalen der codierten Immunmodulator zu identifizieren. Bezüglich der erwarteten immunmodulatorische Aktivität kann Methoden der Beurteilung Zellproliferation, Migration, Reifung, Aktivierung oder Zytotoxizität angewendet werden.
      Hinweis: [O] Zellproliferation kann durch CFSE-59 Kennzeichnung oder Ki67 Färbung60analysiert werden. Transwell oder Kratzer Experimente stehen Zelle Migration61zu analysieren. Reifung und Aktivierung von Zellen können mit geeigneten Färbung Protokolle für jeweiligen Marker bewertet werden. [B] verfügbare Techniken zu beurteilen, BTE-vermittelte zelluläre Zytotoxizität gehören Impedanz Messungen und Chrom-release-Assay. Wenn die Entscheidung für Chrom-Release-Assay, beobachten Sie angemessene Sicherheitsmaßnahmen beim Umgang mit radioaktiven Materials.
    2. [B] als Alternative nicht radioaktiv beschreibt im folgenden im Detail BTE-induzierte, zellvermittelte Zytotoxizität von LDH Release Assay (beschrieben in kurzen38) zu bewerten.
      1. [B] entscheiden über Bedingungen während des Experiments getestet werden (siehe Abbildung 9 als Beispiel). Zeitpunkte (Stunden bis Tage), Konzentrationen von Immunmodulator (Pg/mL bis µg/mL) und Effektor Ziel-Zelle (E:T)-Verhältnisse (zwischen 01:50 und 50: 1, zum Beispiel) variiert werden. Bereiten Sie immer Proben in Triplicates.
      2. [B] Proben ohne Eiweiß enthalten und ohne Effektorzellen, Steuerelemente für spontane LDH-release von der einzelnen Zelltypen (Tsp und Esp), eine Zelle maximale Lyse Zielsteuerelement (Tmax) mit Reinigungsmittel vor dem Auslesen, ein Medium hinzugefügt nur eine Kontrolle und einen Lautstärkeregler für Tmax.
        Hinweis: [B] erforderliche Anzahl von Zielzellen und Inkubationszeiten kann variieren. Führen Sie erste Testläufe ohne Effektorzellen und Immunmodulatoren, optimale Parameter zu identifizieren. Enthalten Sie Tsp und Tmax Muster und entsprechenden Kontrollen, verschiedene Zellzahlen und Zeitpunkte zu beurteilen.
      3. [B] immun Effektorzellen z. B. durch (Dichte Gradienten Zentrifugation von menschlichem Blut PBMCs58 zu erhalten) oder negative Auslese der murinen T-Zellen aus Maus Splenocyten62zu isolieren.
      4. [B] Samen gezielt Zellen gemäß Schritt 4.3.2 (z. B., 5 x 10³ pro Well) in ein U-Boden-96-Well-Platte.
      5. [B] die isolierte Protein am gewünschten Konzentrationen zu den jeweiligen Beispielen hinzufügen. Immun Effektorzellen im gewünschten Verhältnis hinzufügen. Einem Gesamtvolumen von 100 µL pro Bohrloch Medium hinzufügen.
      6. [B] Incubate für den Zeitrahmen bestimmt steigen 4.3.2, in der Regel zwischen 4 und 48 Stunden (24 h für unstimulierte PBMCs und 48 h für frisch isolierte murinen T-Zellen; prestimulated Immunzellen kürzere Inkubationszeiten beantragen können), bei 37 ° C und 5 % CO2.
      7. [B] 45 Minuten vor dem Sammeln der Proben hinzufügen 10 µL 10 X Lyse Lösung Brunnen, Tmax Muster und die entsprechenden mittleren Steuerelemente enthält. Weiter Inkubation.
      8. [B] spin-down Zellen bei 250 X g für 4 min. Transfer 50 µL jeder überstand zu einem flach-Boden-96-Well-Platte. Übertragen Sie Zellen, um Zelle gebundenes LDH zu vermeiden nicht.
      9. [B] Prepare Substratlösung nach Angaben des Herstellers. Jede Vertiefung 50 µL hinzu und im Dunkeln für 30 Minuten oder bis Tmax Muster tiefrot färben bei RT inkubieren.
      10. [B] jede Vertiefung 50 µL Stopplösung hinzufügen. Entfernen Sie Luftblasen durch Zentrifugation für 1 min bei 4.000 X g, und manuell mit einer hohlen Nadel. Messen optische Extinktion bei 490 nm.
      11. [B] berechnen Sie % spezifische Lyse Werte für jede Probe.
        1. [B] berechnen Sie Durchschnitte für Wiederholungen der mittlere Regler mit und ohne Lyse-Lösung. Subtrahieren Sie erhaltenen Werte von experimentellen Proben, Tmax und spontane Freisetzung Kontrollen bzw.. Verwenden Sie diese Hintergrund-korrigierte Werte für weitere Berechnungen.
        2. [B] berechnen Sie Durchschnitte für Hintergrund-korrigierte Tmax, Tspund E-sp -Steuerelemente. Mithilfe dieser durchschnittliche Werte ergibt die folgende Gleichung den Prozentsatz von bestimmten Lyse für jede Probe:

          figure-protocol-32729
        3. [B] des Grundstückes % spezifische Lyse Werte vs. Proteinkonzentration oder E:T Verhältnis und im Vergleich zu nicht-targeting Kontrollproben.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt den Wirkmechanismus von onkolytische Masern-Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers. Ein Flussdiagramm Darstellung des Workflows dieses Protokolls wird in Abbildung 2dargestellt. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel eines modifizierten onkolytische Masern-Virus Genoms. Dies bietet eine visuelle Darstellung der spezifischen Änderungen auf die Masern Virus Anti-Gen...

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Diskussion

Onkolytische Immuntherapie (dh., OVT in Kombination mit Immunmodulation) hält große Verheißung für die Krebsbehandlung, anspruchsvolle weitere Entwicklung und Optimierung von onkolytische Viren immunmodulatorische Proteine codieren. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zum generieren und validieren diese Vektoren für die spätere Prüfung in relevanten präklinischen Modellen und potenzielle zukünftige klinische Übersetzung in neuer Anti-Krebs-Therapeutika.

Zahlreiche verschied...

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Offenlegungen

C.e. Engeland wird als Miterfinder der ein patent über RNA-Viren für Krebs Immunovirotherapy im Besitz von Universität Heidelberg aufgeführt. J.P.W. Heidbuechel hat nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Methoden wurden in der Virotherapie Gruppe unter der Leitung von Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts im nationalen Zentrum für Tumorerkrankungen in Heidelberg gegründet. Wir sind verpflichtet, ihm und allen Mitgliedern des Labor-Teams, vor allem Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler und Jessica Albert. Diese Arbeit wurde von der Else Kröner-Fresenius-Stiftung unterstützt (Grant 2015_A78, C.E. Engeland) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, C.E. Engeland EN 1119/2-1 gewähren). J.P.W. Heidbuechel erhält ein Stipendium in Höhe von Helmholtz International Graduate School for Cancer Research.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Rapid DNA Dephos & Ligation KitRoche Life Science, Mannheim, Germany4898117001
CloneJET PCR Cloning KitThermo Fisher Scientific, St. Leon-RotK1231
AgaroseSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyA9539-500G
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN, Hilden, Germany28704
NEB 10-beta Competent E. coliNew England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, GermanyC3019I
LB medium after LennoxCarl Roth, Karlsruhe, GermanyX964.1
AmpicillinCarl Roth, Karlsruhe, GermanyHP62.1
QIAquick Miniprep KitQIAGEN, Hilden, Germany27104
Restriction enzyme HindIII-HFNew England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, GermanyR3104S
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Invitrogen, Darmstadt, Germany31966-021
Fetal bovine serum (FBS)Biosera, Boussens, FranceFB-1280/500
FugeneHDPromega, Mannheim, GermanyE2311may be replaced by transfection reagent of choice
KanamycinSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyK0129
Vero cellsATCC, Manassas, VA, USACCL81
B16-CD46/ B16-CD20-CD46J. Heidbuechel, DKFZ Heidelbergavailable upon request
Granta-519DSMZ, Braunschweig, GermanyACC 342
Opti-MEM (serum-free medium)Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany31985070
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)PromoKine, Heidelberg, GermanyPK-CA20-300-1000includes XTT reagent
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS)Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany14190-094
QIAquick Ni-NTA Spin ColumnsQIAGEN, Hilden, Germany31014
Sodium chlorideCarl Roth, Karlsruhe, Germany3957.3
ImidazoleCarl Roth, Karlsruhe, GermanyI5513-25G
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDaMerck, Darmstadt, GermanyUFC901024
BCA Protein Assay KitMerck Milipore71285-3
IgG from human serumSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyI4506
Anti-HA-PEMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-092-257RRID: AB_871939
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibodyBD Biosciences, Heidelberg, Germany555749RRID: AB_396091
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany12158167001RRID: AB_390915
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-090-485
MS ColumnsMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-042-201
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-042-303
RIPA bufferRockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USAMB-030-0050
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity AssayPromega, Mannheim, GermanyG1780includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution
Cell lifterCorning, Reynosa, Mexico3008
10 cm dishesCorning, Oneonta, NY, USA430167
15 cm dishesGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany639160
96-well plates, U-bottomTPP, Trasadingen, Switzerland92097
96-well plates, flat bottomNeolab, Heidelberg, Germany353072
6-well platesNeolab, Heidelberg, Germany353046
12-well platesNeolab, Heidelberg, Germany353043
50 mL tubesnerbe plus, Winsen/Luhe, Germany02-572-3001
T175 cell culture flasksThermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot159910
0.22 µm filtersMerck, Darmstadt, GermanySLGPM33RS

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