Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode der Verwendung von Polyethyleneimine (PEI)-superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln für transfecting Makrophagen mit SiRNA beschichtet. Diese Nanopartikel können effizient SiRNA zu Makrophagen in Vitro und in Vivo und Stille Ziel Genexpression liefern.

Zusammenfassung

Wegen ihre entscheidende Rolle bei der Regulation der Immunantwort Makrophagen kontinuierlich Gegenstand intensiver Forschung und stellen eine vielversprechende therapeutische Ziel bei vielen Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen, Arteriosklerose und Krebs. RNAi vermittelte Gen-silencing ist ein wertvoller Ansatz, Sonde und Makrophagen Funktion zu manipulieren; jedoch die Transfektion von Makrophagen mit SiRNA wird oft als technisch anspruchsvoll, und zur Zeit gibt es einige Methoden, die die SiRNA-Übertragung auf Makrophagen gewidmet. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit Polyethyleneimine beschichteten superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (PEI-Mondfotos) als Vehikel für die gezielte Bereitstellung von SiRNA zu Makrophagen. PEI-Mondfotos sind in der Lage, verbindliche und vollständig kondensiert SiRNA erreicht die Fe: SiRNA-Gewichts-Verhältnis 4 und vor. In-vitro-, diese Nanopartikel können effizient SiRNA liefern, in primären Makrophagen sowie in die Makrophagen-wie RAW 264,7 Zell-Linie, ohne kompromittierende Zellviabilität an die optimale Dosis für Transfection und, letztlich, sie induzieren SiRNA-vermittelten Ziel Gen-silencing. Neben für in-vitro- SiRNA Transfection verwendet, sind PEI-Mondfotos auch ein viel versprechendes Instrument für die Bereitstellung von SiRNA zu Makrophagen in Vivo. Angesichts seiner kombinierten Funktionen der magnetische Eigenschaft und Gen-silencing Fähigkeit dürften systemisch verabreichten PEI-SPION/SiRNA-Partikel nicht nur zu modulieren, Makrophagen-Funktion, sondern auch aktivieren Makrophagen abgebildet und nachverfolgt werden. PEI-Mondfotos repräsentieren im Wesentlichen eine einfache, sichere und wirksame nonviral Plattform für SiRNA Lieferung an Makrophagen in Vitro und in Vivo.

Einleitung

Makrophagen sind eine Art von angeborenen immunen Zellen verteilt in allen Körpergeweben, wenn auch in unterschiedlichen Mengen. Durch die Herstellung einer Vielzahl von Zytokinen und anderer Vermittler, spielen sie wichtige Rollen in der Wirt Verteidigung gegen eindringende mikrobielle Krankheitserreger, in Reparatur von Gewebe nach Verletzungen und bei der Aufrechterhaltung der Homöostase-Gewebe¹. Aufgrund ihrer Bedeutung waren Makrophagen kontinuierlich Gegenstand intensiver Forschung. Jedoch trotz der Prävalenz in der Genregulation und Funktionsstudien, SiRNA-vermittelten Gen-silencing ist weniger wahrscheinlich, da in Makrophagen erfolgreich diese Zellen – insbesondere primäre Makrophagen – sind oft schwer zu transfizieren. Dies kann eine relativ hohe Toxizität im Zusammenhang mit etabliertesten Transfektion Ansätze, in denen die Zellmembran chemisch ist (z. B.mit Polymeren und Lipide) zugeschrieben werden oder körperlich (z.B.durch Elektroporation und gen Kanonen) gestört, um SiRNA-Moleküle die Membran, dadurch drastisch Makrophagen Lebensfähigkeit^2,3überqueren zu lassen. Darüber hinaus sind Makrophagen spezielle Fresszellen, die reich an abbauende Enzyme. Diese Enzyme können die Integrität von SiRNA, die Stummschaltung Effizienz zu schwächen, auch wenn in der Zelle^3,4Gen-spezifischen SiRNA geliefert wurde beschädigt. Daher muss eine wirksame Makrophagen ausgerichtete SiRNA Delivery-System zum Schutz der Integrität und Stabilität von SiRNA während Lieferung⁴.

Es wird immer offensichtlicher, dass dysfunktionale Makrophagen in der Initiierung und Progression von bestimmten gemeinsamen klinischen Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen, Arteriosklerose und Krebs verwickelt sind. Aus diesem Grund Modulation Makrophagen-Funktion mit, zum Beispiel, SiRNA hat als eine attraktive Methode für die Behandlung dieser Erkrankungen^5,6,7aufgetaucht. Obwohl große Fortschritte erzielt wurden, ist eine große Herausforderung SiRNA basierenden Behandlungsstrategie der Arme Zelle Besonderheit der systemisch verabreichten SiRNA und die unzureichende SiRNA-Aufnahme durch Makrophagen, die somit zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. Im Vergleich mit kostenlosen Nukleinsäure-Therapeutika, die in der Regel fehlt optimale Zelle Selektivität und führen oft zu Nebenwirkungen, Medikament beladenen Nanopartikeln (NPs), aufgrund ihrer spontanen Neigung gefangen vom retikuloendothelialen System Ziel, für passive targeting zu Makrophagen in Vivo, zulassend verbesserten therapeutischen Wirksamkeit mit minimalen Nebenwirkungen⁸projektierbar. Aktuelle NPs erforscht für die Lieferung von RNA-Molekülen gehören anorganische darin, verschiedene Liposomen und Polymere-⁹. Unter anderem zeigt Polyethyleneimine (PEI), eine Art von kationischen polymeren in der Lage zu binden und kondensierenden Nukleinsäuren in stabilisierter NPs, die höchsten RNA liefert Kapazität^9,10. PEI schützt Nukleinsäuren vor enzymatischen und nonenzymatic Abbau, vermittelt ihre Übertragung über die Zellmembran und fördert ihre intrazellulären Freigabe. Obwohl zunächst als ein DNA-Lieferung-Reagenz eingeführt, zeigte sich PEI anschließend zu einer attraktiven Plattform für in Vivo SiRNA Delivery, entweder lokal oder systemisch^9,10.

Superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (Mondfotos) zeigten viel versprechend in der Biomedizin, aufgrund ihrer magnetischen Eigenschaften, Biokompatibilität, vergleichbarer Größe auf biologisch wichtige Objekte, hohe Oberfläche-Bereich-zu-Volumen-Verhältnis und leicht anpassbar Oberfläche für Bioagent Anlage¹¹. Zum Beispiel haben wegen ihres potenziellen Nutzens als Kontrastmittel und schnelle Aufnahme durch Makrophagen Mondfotos als klinische Lieblingswerkzeug Bild Gewebe Makrophagen¹²entstanden. Während Mondfotos als Nukleinsäure-Lieferung Fahrzeuge^11,13,14,15, nach unserer Kenntnis auch ausgiebig studiert haben enthält die Literatur einige Berichte von Mondfotos als Träger für Makrophagen-gezielte SiRNA Lieferung. Gen-Lieferung von Mondfotos ist ihre Oberfläche in der Regel mit einer Schicht von hydrophilen kationischen polymeren beschichtet auf dem negativ geladenen Nukleinsäuren elektrostatisch angezogen und angebunden werden können. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Synthese von Mondfotos, dessen Oberfläche mit niedrigem Molekulargewicht (10 kDa), verzweigte PEI (PEI-Mondfotos) geändert wird. Diese magnetische Nanoplatforms werden dann eingesetzt, um kondensieren SiRNA, bilden PEI-SPION/SiRNA-komplexe, die SiRNA-Transport in die Zelle zu ermöglichen. Wir Grund, dass spontane Phagozytose von Mondfotos durch Zellen des retikuloendothelialen System¹⁶, gepaart mit der starken Fähigkeit der Bindung und kondensierenden Nukleinsäuren von PEI, rendert PEI-Mondfotos geeignet für den effizienten Transport von SiRNA in Makrophagen. Die hier vorgestellten Daten unterstützen die Machbarkeit des PEI-SPION/SiRNA-mediated Gene silencing in Makrophagen in Kultur als auch in Vivo.

Protokoll

Alle Methoden, die mit lebenden Tieren, im Einklang mit dem Tier durchgeführt wurden kümmern und Richtlinien der Southeast University, China.

1. Vorbereitung des PEI-Mondfotos

1. Vorbereitung der Ölsäure geändert Mondfotos
   1. Lösen sich FeCl₃•6H₂O und FeSO₄•7H₂O in Wasser unter dem Schutz der N₂.
      1. Hinzufügen von FeCl₃•6H₂O 28 g und 20 g FeSO₄•7H₂O in 80 mL entionisiertem Wasser in ein Becherglas. Führen Sie N₂ in das Wasser durch eine Glas-Leitung ein und rühren Sie, bis die feste Materie aufgelöst hat.
      2. Erhitzen Sie das Reaktionsgemisch auf 72 ° C mit einer mitreißenden Rate von 800 u/min, gefolgt von Zugabe von 40 mL Ammoniakwasser (28 %). 5 min köcheln.
   2. Hinzugeben Sie 9 mL Ölsäure tropfenweise in die oben genannten Lösung und rühren Sie es bei 72 ° C für 3 h.
   3. Kühlen Sie die resultierende Lösung auf Raumtemperatur (RT). Die Lösung über magnetische Trennung herbeiführen.
   4. Waschen Sie den Niederschlag mit Mondfotos 3 X mit absoluten Spiritus und dann den Niederschlag in 100 mL N-Hexan zu zerstreuen.
2. Vorbereitung der Dimercaptosuccinic Säure-modifizierte Mondfotos
   1. Hinzufügen von 800 mg von Ölsäure (OA)-geändert Mondfotos zerstreut in 200 mL N-Hexan und 400 mg Dimercaptosuccinic Säure (DMSA) in 200 mL Aceton, dispergiert in einem drei-Hals-Kolben in einem Wasserbad bei 60 ° C.
      Hinweis: Zur Bestimmung der Konzentration von OA-modifizierte SPION aus dem vorherigen Schritt erhalten, nehmen Sie ein kleines Volumen (z.B. 1 mL) der SPION Dispersion, verdampfen Sie das N-Hexan und wiegen Sie das resultierende Pulver.
   2. Fügen Sie 200 µL Triethylamin tropfenweise in die oben genannten Lösung mit Rühren bei 1.000 u/min und zurückfließt.
   3. Erhalten Sie nach 5 h rühren und zurückfließt einen schwarzen Niederschlag durch magnetische Trennung.
   4. Die hydrophilen Mondfotos in entionisiertem Wasser homogen durch den pH-Wert der Lösung mit Tetramethylammonium Hydroxid zu zerstreuen.
3. Vorbereitung der PEI-Mondfotos
   1. DMSA-modifizierte SPION kolloidalen Lösung tropfenweise hinzufügen, in PEI-Lösung (10 kDa) in einen 500-mL drei Hals Kolben unter mechanischen Rühren bei 1.000 u/min für 2 h (W_Fe: W_PEI = 1:3).
      Hinweis: Die Ladung und Größe des PEI-Mondfotos variieren je nach Verhältnis von W_Fe W_PEI. Der W-_Fe: W_PEI -Verhältnis von 1:3 kann ein guter Ausgangspunkt zur Synthese von PEI-Mondfotos für SiRNA Delivery geeignet sein.
   2. Fügen Sie die resultierende Lösung in eine Ultrafiltration Rohr mit einem Molekulargewicht Cutoff von 100 kDa und einen Inhalt von 15 mL; dann, Zentrifuge bei 5.400 x g für 10 min bis die restliche Lösung 1 mL ist. Die Lösung für das Volumen 15 mL wieder machen und wiederholen den obigen Vorgang 10 deionisiertes Wasser hinzufügen X, um das Endprodukt zu erhalten. Dann filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-μm-Filter und speichern Sie das Endprodukt bei 4 ° C.
   3. Bestimmen Sie die Fe-Konzentration von PEI-Mondfotos durch die kolorimetrischen Verfahren unter Verwendung Phenanthroline¹⁷. PEI-Mondfotos mit entionisiertem sterilem Wasser zu einer Konzentration von 1 mg Fe/mL verdünnen und bei 4 ° c lagern
   4. Verdünnen Sie 10 μL der PEI-SPION-Lösung (1 mg Fe/mL), 1 mL mit entionisiertem Wasser; Anschließend testen Sie die hydrodynamischen Größe und Zetapotenzial durch ein dynamischen Lichtstreuung Gerät.
      Hinweis: Bereiten Sie PEI-Mondfotos im Bereich von etwa 30-50 nm. In diesem Größenbereich scheint die Wirkung der NP Größe auf SiRNA Bindung und zelluläre Aufnahme nicht erheblich sein. PEI-Mondfotos mit einer durchschnittlichen Zeta-Potential über + 37 mV in der Dosisbereich zur Transfektion toxisch sein kann, und ein Zytotoxizität-Assay durchgeführt werden, um Sicherheit zu gewährleisten. Die Oberflächenladung und hydrodynamischen Größe der Nanopartikel können durch Anpassen der PEI-Inhalte innerhalb eines gewünschten Bereichs gesteuert werden.

2. Vorbereitung und Agarose-Gelelektrophorese PEI-SPION/SiRNA NPS

1. Verdünnen Sie SiRNA mit RNase-freies Wasser um eine Endkonzentration von 20 μM (0,26 µg/μl) zu erzielen.
2. Bereiten Sie fünf RNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen beschriftet, 0, 1, 2, 4 und 8. Die Etiketten sind verschiedene Fe: SiRNA-Gewichts-Verhältnis. Pipettieren 3 μL der SiRNA-Lösung für alle Rohre (~0.8 μg SiRNA/Röhre).
3. Fügen Sie 0, 0,8, 1,6 mm, 3,2 und 6.4 μg Fe in Form von PEI-Mondfotos beschriftet 0, 1, 2, 4 und 8, bzw. Rohre hinzu. Halten Sie die Gesamtstichprobe jede Röhre weniger als 20 μL. Mischen Sie, indem Sie sanft auf und ab pipettieren.
4. Inkubieren Sie die Mischungen bei RT für 30 min, PEI-SPION/SiRNA Komplexbildung zu ermöglichen. Während dieser Zeit machen Sie eine 3 % Agarose mit hohem Reinheitsgrad Agarose-gel.
   Hinweis: Zusätzliche PEI-SPION/SiRNA-komplexe mit anderen Fe: SiRNA-Verhältnisse (z.B.5 oder 6) können vorbereitet und getestet werden.
5. 1 μl 6 x DNA Loading Puffer je 5 μl Probe hinzufügen und vorsichtig mischen. Laden Sie alle Proben und Elektrophorese mit 5 V/cm ausgeführt, bis die Bromophenol Blue bis zu zwei Drittel der Länge des Gels migriert. Färben Sie das Gel mit Interkalation Bromid (EB) für 15-20 min.
   Hinweis: Frisch zubereitete Elektrophorese Puffer und EB-Lösung sollte verwendet werden.
6. SiRNA Bands unter einem UV-imaging-System zu visualisieren. Überprüfen Sie die Fe: SiRNA-Verhältnisse an die SiRNA Formen komplexe mit PEI-Mondfotos und infolgedessen die Bands kostenlos SiRNA vertreten sind, verzögert oder nicht nachweisbar.

3. die Transfektion von RAW264.7 Makrophagen In-vitro-

1. Kultur Mauszellen Makrophagen-wie RAW264.7-ein 10-cm-Schüssel mit DMEM komplette mittlere mit 10 % fötalen Rinderserum (FBS) pro 100 U/mL Penicillin pro 100 μg/mL Streptomycin bei 37 ° C in einem 5 % CO₂ Inkubator.
2. Aspirieren Sie einen Tag vor der Transfektion Medium aus den Zellen und spülen Sie sie mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4). Die 10-cm-Schüssel 1 mL von 0,25 % Trypsin hinzufügen. Trypsinize RAW264.7 Zellen für ca. 5-10 min bei 37 ° C in einem 5 % CO₂ Inkubator.
3. Wenn die Mehrheit der Zellen (nach ca. 5-10 min) getrennt haben, fügen Sie 5 mL DMEM komplette Medium in die Schale, die Trypsin zu inaktivieren. Pipettieren rauf und runter, Zellcluster in Einzelzellen zu zerstreuen.
4. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine sterile 15 mL konische Rohr. Zentrifugieren sie 300 X g für 3 min bei RT. Entfernen Sie überstand.
5. Aufschwemmen der Zellen mit 5 mL frischem DMEM komplette Medium und die Zellen zu zählen.
6. Platte 9 x 10⁴ Zellen pro auch in einem 6-Well-Platte mit 2 mL des kompletten DMEM Medium und Inkubation bei 37 ° C in einem 5 % CO₂ Inkubator für ca. 24 h.
   Hinweis: Wenn Sie einen Teller mit einer anderen Größe zu verwenden, einstellen Sie die vergoldeten Zelldichte im Verhältnis zu der relativen Fläche so, dass die Zellen 80 % Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion erreichen.
7. Wenn Zelle Konfluenz 80 % ist, entfernen Sie das Medium aus den Zellen zu und ersetzen Sie es mit 1 mL DMEM komplette Medium pro Bohrloch. Rückkehr der Plattenrandes in den Inkubator bis PEI-SPION/SiRNA-komplexe vorbereitet worden und sind bereit für den Einsatz (ca. 30 min).
8. Bereiten Sie PEI-SPION/SiRNA-komplexe: berechnen Sie die Menge der PEI-SPION/SiRNA-komplexe für eine Transfektion Experiment benötigt. Mischen Sie in einem 1,5 mL RNase-freie Microcentrifuge Schlauch einen angemessenen Betrag von PEI-Mondfotos mit SiRNA bei einem bestimmten Fe: SiRNA-Verhältnis. Zum Beispiel um PEI-SPION/SiRNA NPs enthält 100 µg Fe bei einem Fe: SiRNA-Verhältnis von 4 vorzubereiten, addieren Sie 100 µL (1 mg Fe/mL) PEI-Mondfotos, 96 μL von SiRNA (0,26 µg/μl), gefolgt von sanft mit einer Mikropipette mischen. 30 min bei RT inkubieren
   Hinweis: Bereiten Sie ein Volumen von PEI-SPION/SiRNA-Komplex, 10 % mehr als die abschließende Gesamtmasse entfallen jegliche anfallende Verluste ist. Stellen Sie PEI-SPION/SiRNA-komplexe bei niedrigen Fe: SiRNA Verhältnisse, unter denen SiRNA-Moleküle werden auf PEI-Mondfotos vollständig geladen und somit können kleine Mengen von PEI-Mondfotos verwendet werden, um potenzielle Zytotoxizität zu minimieren. Pilotprojekte (Gel Retardierung Assay) für die Optimierung des Fe: SiRNA sind notwendig.
9. Nehmen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator (Schritt 3,7). Fügen Sie eine gewünschte Lautstärke des PEI-SPION/SiRNA komplexes tropfenweise in jede Vertiefung und wirbeln Sie die Platte vorsichtig um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Die Platte in den Inkubator erst die Bewertung der zellulären Aufnahme oder gen Knockdown Effizienz (1-3 d) zurück.
   Hinweis: Transfecting Makrophagen mit PEI-SPION/SiRNA in einer Konzentration von ~ 15 μg Fe/mL können Transfection Leistungsfähigkeit maximieren bei gleichzeitiger Minimierung der möglichen Zytotoxizität.

4. systemische Lieferung von SiRNA zu Makrophagen bei Ratten mit experimentellen Arthritis

1. Erhalten Sie spezifische Erreger-freie männliche Wistar-Ratten, die 7 Wochen alt sind. Gewöhnen Sie die Ratten für 7D vor Gebrauch und versorgen sie mit ausreichend Nahrung und Wasser. Adjuvanter Arthritis (AA) bei den Ratten als zuvor beschriebenen¹⁸zu induzieren.
2. Bereiten Sie PEI-SPION/SiRNA-komplexe wie in Schritt 3.8 beschrieben vor.
3. Die PEI-SPION/SiRNA NPs (0,3 mg von SiRNA/kg) in der AA Ratten über die Rute Vene injizieren. Bewerten der zelluläre Aufnahme über, zum Beispiel Durchflusszytometrie, Gewebe Bioverteilung über, zum Beispiel eine Echtzeit-Fluoreszenz imaging-System, oder therapeutische Wirkungen anhand z. B. klinische, histologische und radiologische Analysen zur gewünschten Zeit weist¹⁸.
   Hinweis: Für Mobilfunk und Gewebe Bioverteilung Studien, behandeln Sie die Ratten mit einer einzigen Injektion die gewünschte NPS; injizieren Sie für Therapiestudien die Ratten mit dem NPs geprüft 1 x pro Woche für drei aufeinander folgende Wochen sein.

Ergebnisse

Die Größe und Zeta Potential der PEI-Mondfotos vorbereitet mit diesem Protokoll wurden im Bereich von 29-48 nm (Polydispersität Index: 0,12 - 0,23) und 30-48 mV, beziehungsweise. Sie waren seit über 12 Monaten ohne offensichtliche Aggregation im Wasser bei 4 ° C stabil. Um ihre SiRNA verbindliche Fähigkeit zu bewerten, wurden PEI-Mondfotos mit SiRNA bei verschiedenen Fe: SiRNA-Gewichts-Verhältnis gemischt. Abbildung 1 zeigt, dass erreicht die Fe: SiRNA...

Diskussion

Makrophagen sind refraktär gegenüber von häufig verwendeten nonviral Ansätze wie Elektroporation, kationische Liposomen und Lipid Arten transfizieren. Hier haben wir eine zuverlässige und effiziente Methode, um Makrophagen mit SiRNA transfizieren. Mit Hilfe dieses Protokolls, werden über 90 % der Makrophagen-wie RAW 264,7 Zellen (Abb. 2 b) und Ratte peritonealen Makrophagen¹⁸ mit SiRNA ohne wesentliche Beeinträchtigung des die Zellviabilität transfiziert könn...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	C11995500BT	Warm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serum	Gibco	A31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml)	Gibco	15140122
Tetrazolium-based MTS assay kit	Promega	G3582	For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell line	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China	TCM13
Tissue culture plates (6-well)	Corning	3516
Tissue culture dishes (10 cm)	Corning	430167
RNase-free tubes (1.5 ml)	AXYGEN	MCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml)	Corning	430791
Trypsin	Gibco	25200-056
Wistar rats	Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder	National Institutes for Food and Drug Control, China		for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNA	GenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNA	RiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa)	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	E107079
Ammonia water	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	A112077
Oleic acid	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	O108484
Dimethylsulfoxide	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	D103272
FeSO4•7H2O	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10012118
FeCl3•6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10011918
Dimercaptosuccinic acid	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	D107254
ultrafiltration tube	Millipore	UFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solution	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	T100882
Particle size and zeta potential analyzer	Malvern, England	Nano ZS90