Einzellige RNA Sequenzierung von Eindringmittel beschrifteten Maus Neuronen mit Handsortierung und doppelte In Vitro Transkription mit absoluten zählt Sequenzierung (DIVA-Seq)

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das manuelle Sortieren Verfahren, um einzelne Eindringmittel beschrifteten Neuronen, gefolgt von in-vitro- Transkription-basierte mRNA Verstärkung für die hoch-Tiefe einzellige RNA Sequenzierung zu isolieren.

Zusammenfassung

Einzelne Zelle RNA Sequenzierung (RNA-Seq) ist jetzt ein weit implementierten Werkzeug für die Untersuchung der Genexpression. Handelsübliche einzellige RNA-Sequenzierung Plattformen verarbeiten alle Eingabezellen wahllos. Manchmal wird Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) stromaufwärts verwendet, um einen speziell gekennzeichneten Bevölkerung von Interesse zu isolieren. Eine Einschränkung des FACS ist die Notwendigkeit für eine hohe Anzahl von Eingabezellen mit deutlich beschrifteten Brüche, unpraktisch zum sammeln und Profilerstellung seltene oder spärlich beschrifteten Neuron Populationen aus dem Gehirn der Maus. Hier beschreiben wir eine Methode für manuell sammeln spärlich Eindringmittel mit der Bezeichnung einzelner Neuronen aus frisch Maus Hirngewebe dissoziiert. Dieser Prozess ermöglicht es für die Erfassung mit der Bezeichnung der einzelnen Neuronen mit hoher Reinheit und anschließende Integration mit einer in-vitro- Transkription-basierte Verstärkung Protokoll, die endogene Transkript Verhältnisse bewahrt. Wir beschreiben eine doppelte lineare Verstärkung-Methode, die einzigartige Molekül Bezeichner (UMIs) verwendet, um einzelne mRNA zählt zu generieren. Zwei Runden der Verstärkung ergibt ein hohes Maß an gen-Erkennung pro Einzelzelle.

Einleitung

Einzelne Zelle RNA Sequenzierung (RNA-Seq) verwandelte transkriptomischen Studien. Während große einzellige RNAseq ausgeführt werden kann, mit einer Vielzahl von Techniken, wie Tropfen^1,2, Mikrofluidik³, Nanogrids⁴und Mikrovertiefungen⁵, können nicht die meisten Methoden definierte Zelltypen sortieren. genetisch codierte Fluorophore ausdrücken. Um eine wählen Sie die Zellenbevölkerung zu isolieren, wird Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) häufig verwendet, um markierte Zellen in eine einzelne Zelle Modus zu sortieren. Allerdings FACS hat einige Einschränkungen und erfordert sorgfältige Verarbeitung Beispielschritte. Erstens eine große Anzahl von Eingabezellen sind in der Regel benötigt (oft mehrere Millionen Zellen pro mL), mit einem signifikanten Anteil (> 15 – 20 %) mit der beschrifteten Bevölkerung. Zweitens können Zelle Vorbereitungen erfordern mehrfache Umläufe der Dichte Gradienten Zentrifugation Schritte zum Entfernen von Gliazellen Bruchteil, Schmutz und Zelle-Klumpen, die sonst die Düse oder Flow Zelle verstopfen könnte. Drittens: FACS beschäftigt in der Regel färben und Entfärben Schritte für die lebenden/Toten Färbung (z. B. 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Propidium Jodid (PI) und Cytotracker Farbstoffe), die zusätzliche Zeit in Anspruch nehmen. Viertens: als Faustregel für Zweifarben-Sortierung (z. B. DAPI und grün/rot fluoreszierenden Proteins (GFP/RFP)), in der Regel zwei Proben und ein Steuerelement benötigt werden, erfordern eine unbeschriftete Probe neben die gewünschte Maus Belastung verarbeitet werden. Fünftens ist Filterung oft mehrmals vor und während der Probe zu sortieren, um proaktiv verhindert verstopfte Querprofillinien in ein FACS-Maschine durchgeführt. Sechstens muss Zeit zugeteilt werden, in am häufigsten verwendeten FACS-Setups zu initialisieren und stabilisieren den Fluidstrom und Tröpfchen Kalibrierung durchführen. Siebte, Kontrolle, die Proben in der Regel in der Reihenfolge vor der eigentlichen Probenentnahme Entschädigung Matrizen, Wams Ablehnung einzurichten laufen, Tore, etc. Benutzer entweder führen Sie die Schritte 6 bis 7 sich vorzeitig oder erfordern die Hilfe eines Technikers parallel. Zu guter Letzt Post-FACS, oft gibt es Maßnahmen, um sicherzustellen, dass nur einzelne beschriftet Zellen sind in jede Vertiefung; zum Beispiel durch Überprüfung Proben in einem High-Content-Screening-Setup wie eine schnelle Platte-Imager.

Um die oben beschriebenen Schritte zu umgehen und erleichtern eine relativ schnelle, gezielte Sequenzierung von eine kleine Population von einzelnen Eindringmittel beschrifteten Neuronen, beschreiben wir eine manuelle Sortieren gefolgt von zwei Runden von einem hochsensiblen in-vitro- Verfahren Verstärkung-Protokoll, genannt double in-vitro-Transkription mit absoluten zählt Sequenzierung (DIVA-Seq). Die RNA-Verstärkung und cDNA-Bibliothek-Generation sind von Eberwine Et al. ⁶ und Hashimshony Et al. ⁷, mit bestimmten Modifikationen entsprechend Maus Interneuronen, die kleinere zelluläre Volumen haben; Darüber hinaus haben wir auch gefunden, dass es ebenso nützlich für exzitatorischen pyramidale Neuronen.

Protokoll

Alle Verfahren, die unter anderem tierische Themen wurden von IACUC am Cold Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8) genehmigt.

1. manuelle Sortierung der Gewebekulturen beschrifteten Maus Neuronen

1. Ziehen Sie Glas Mikrokapillaren (siehe Tabelle der Materialien), 10 – 15 µm Ausfahrt Durchmesser mit Hilfe einer Kapillare Abzieher mit den folgenden Einstellungen: Hitze: 508, ziehen: leer, Vel: leer, Zeit: leer.
2. Ein 0,2 µm Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Spritze Membranfilter und ein zwei-Wege-Schlauch-Ventil mit geeigneten Schlauch Verbinder zuordnen Sie 120-150 cm flexiblen Silikonschlauch (~0.8 mm Innendurchmesser).
3. Bereiten Sie 500 mL gekühlt (4 ° C) künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS, Tabelle 1), und mit Sauerstoff durch sprudelnden 5 % Kohlendioxid ausgewogen Sauerstoff durch eine Airstone für 15 Minuten oder bis die Lösung vollständig löscht.
4. Bereiten Sie 100 mL ACFS mit einem Cocktail aus Aktivität Blocker in einem 150 mL Becherglas (Tabelle 1).
5. Bereiten Sie 100 mL ACFS mit 1 mg/mL Streptococcus Bruchteil IV Protease in einem 150 mL Becherglas (Tabelle 1).
6. 100 mL ACFS mit fetalen bovine Serum (FBS) 1 % ige Lösung in einem 150 mL Becherglas vorbereiten und mit 5 % Kohlendioxid ausgeglichen durch eine Airstone Sauerstoff Sauerstoff.
7. Das Gehirn von einer euthanasierten Maus durch den Schädel mit einer kleinen Schere öffnen und extrahieren die frische Gehirn mit feinen Pinzette ohne Beschädigung der Rinde zu sezieren.
   Hinweis: Mäuse von jeder Sorte, Alter und Geschlecht verwendet werden wie gewünscht. Nicht das Gehirn einfrieren oder manuelle Sortierung an Mäusen injiziert mit Viren oder anderen gefährlichen/Krankheitserregern.
8. Halten Sie das Gehirn in gekühlten und sauerstoffreiches ACFS, verlassen ein Airstone befestigt um 5 % Kohlendioxid Bilanz Sauerstoff während der gesamten Dauer der der Schnitt.
9. Positionieren Sie das Gehirn auf dem Vibratome Futter und schneiden Sie koronale oder sagittale Abschnitte bei 300 µm Dicke. Sammeln Sie so viele Abschnitte wie erforderlich, um ein Minimum von ca. 10 – 50 Zellen bis zu mehreren hundert Zellen bezeichnet. Legen Sie die Scheiben auf einem Baumwolle vermaschten Scheibe Halter, in ein Becherglas platziert, so dass sie in sauerstoffreichem ACFS gebadet werden.
10. Verschieben Sie frische Scheiben in ein Becherglas mit ACFS mit Aktivität Blocker und Block für 15-20 min bei Raumtemperatur. Halten Sie sprudelnden Sauerstoff mit Airstone.
11. Verschieben Sie die Scheiben in einen Becher mit ACFS die Protease-Lösung für leichte Verdauung bei Raumtemperatur durchführen: 20 – 30 min. für P4-14 Tiere oder bis zu 45 – 60 min für P28-56 Tiere. Halten Sie sprudelnden Sauerstoff.
12. Waschen Sie ACFS mit Protease indem Sie Scheiben zurück auf die Becher mit ACFS mit Aktivität Blocker Lösung für 5 – 10 min bei Raumtemperatur. Halten Sie sprudelnden Sauerstoff.
13. Verschieben Sie einzelne Abschnitte in einer 100 mm Petrischale mit ACFS mit 1 % FBS bei Raumtemperatur. Unter einem fluoreszierenden Dissektion Bereich, Microdissect Bereichen und Schichten von Interesse, die ein Minimum von 10 – 50 Zellen (bis zu ein paar hundert). Führen Sie die Microdissection mit einer feinen Pinzette oder durch Anhängen von 22 – 28 G Injektionsnadeln auf hölzernen Halter (Spieße).
14. Mit einer Pasteurpipette, bewegen sich die Microdissected-Stücke zu einem 2 mL Microfuge Schlauch mit ~0.8 mL von 1 % FBS in ACFS Lösung.
15. Genannte sezierte Gewebe in das Microfuge Rohr bei Raumtemperatur. Machen Sie drei langstielige Pasteur Pipetten mit abnehmendem Durchmesser Ausgang durch Walzen sie über einer offenen Flamme. Führen Sie ~ 10 Schläge mit jeder Pipette, beginnend mit den größten und endend mit der kleinsten.
16. Die dissoziierten Zellen in eine 100 mm Petrischale mit Sauerstoff angereichertes ACFS zu verzichten (Petrischale dünn beschichtet werden können, mit 5 mm 1 % Agar oder klare Silikonmasse am 01:10-Verhältnis, wenn gewünscht). Bei Zimmertemperatur aufbewahren.
17. Warten Sie ca. 5-7 min für die Zellen allmählich absetzen, dann das GFP/RFP-Signal unter dem Mikroskop Dissektion zu beobachten.
    Hinweis: Einzelne Zellen, Schmutz und kleine Klümpchen im Hellfeld (BF) sichtbar werden.
18. Wählen Sie 10 – 15 GFP/RFP Zellen gleichzeitig mit einer Kapillare Pipette (aus Schritt 1.1) an flexiblen Silikonschlauch befestigt (0,4-0,8 mm Innendurchmesser) und die Zellen in eine 100 mm Petrischale mit frischem Sauerstoff angereichertes ACFS zu verzichten.
19. Durch die Blockade zum Jahresende das Schlauch-Ventil mit der Zunge positionieren die Kapillare in der Nähe der Zelle von Interesse. Erfassen Sie Zellen mittels Kapillarwirkung auf Linderung des Blocks zu und sperren Sie schnell wieder, um überschüssige Flüssigkeit daran zu hindern, die Pipette. Die Zellen auf einem 100 mm Petrischale mit frischem Sauerstoff angereichertes ACFS sanft bläst, während Sie beobachten die Kapillaren Tipp unter Fluoreszenz Optik des Mikroskops Dissektion zu verzichten. Ziel, sammeln Sie ~ 100 – 150 Zellen insgesamt.
20. Wiederholen Sie Schritt 1.19 ein-oder zweimal mehr (abhängig von Schutt) und Transfer insgesamt ca. 50 – 75 Zellen zu einer neuen 100 mm Petrischale, dafür sorgen, dass Verunreinigungen wie Schmutz minimal im Hellfeld differential Interferenz Kontrast (DIC) Optik sind.
21. Zu guter Letzt mit einer frischen Microcapillary Pipette jedesmal, wählen Sie eine einzelne Zelle in nicht mehr als 0,5 µL Volumen und vertreiben Sie es in ein einzelnes 0,2 mL Microfuge Rohr (oder einen Streifen von acht 0,2 mL Microfuge Röhren) mit 1 µL Probenpuffer Sammlung mit Primer N10B1-N10B96 (Tabelle 2). Brechen Sie die Pipettenspitze in der Microfuge Röhre um sicherzustellen, dass die Zelle in der Sammlung-Puffer bleibt. Die Pipetten zu verwerfen.
22. Einfrieren der Zellen durch Trockeneis Rohre aufsetzen und speichert sie langfristig in einem-80 ° C Gefrierschrank bis sie bereit sind für RNA Amplifikation verarbeitet werden.

2. erste Runde RNA Amplifikation

Hinweis: Die folgende Prozedur ist für einzelne Streifen von acht 0,2 mL Microfuge Röhren. Skalieren Sie die Reaktionen nach Bedarf.

1. Den erste Strang der cDNA zu synthetisieren (erste Runde).
   1. Hitze-Streifen aus Schritt 1.22 bei 70 ° c für 5 min, gefolgt von 4 ° c für 5 min; zweimal wiederholen.
   2. Montieren Sie auf Eis Reverse Transkriptase (RT) master Mix/erste-Strang Synthese master-Mix mit den folgenden Zutaten (siehe Tabelle der Materialien): 10 x erste-Strang Puffer (2 µL), dNTP-Mix (4 µL), RNase-Inhibitor (1 µL) und Enzym (1 µL).
   3. Kurz Zentrifugieren des Streifens auf einer Tischplatte Zentrifuge, alles am Ende zu sammeln. Halten Sie auf dem Eis.
   4. Die oben genannten Röhren 1 µL RT-master-Mix/erste-Strang-Synthese-master-Mix hinzufügen (Gesamtvolumen von 1 µL Probenpuffer aus Zellentnahme + 1 µL RT = 2 µL/Rohr). Mischen Sie gut durch pipettieren. Kurz drehen Sie, um den gesamten Inhalt an der Unterseite sammeln und halten es auf Eis.
   5. Inkubieren Sie die oben genannten Rohr/s bei 42 ° C für 2 h im Ofen Luft. Setzen Sie die Rohre auf Eis sofort zu kündigen, die Reaktion und zum zweiten Strang Synthese Schritt gehen.
2. Den zweite Strang der cDNA zu synthetisieren (erste Runde).
   1. Machen zweiten Strang master-Mix (80 µL) auf Eis in der folgenden Reihenfolge in einer 1,5 mL Tube: Nuklease-freies Wasser (63 µL), 10 x zweiten Strang-Puffer (10 µL), dNTP-Mix (4 µL), DNA-Polymerase (2 µL) und RNaseH (1 µL). Mischen Sie die Zutaten gut durch aufschütteln und dann Spin, sammeln sich am Boden und halten auf dem Eis.
   2. Start der Thermocycler Vorkühlen der Einheit, bereit sein, 2.2.3 Schritt starten Sie das folgende Programm ausführen (Deckel Hitze = off; 16 ° C für 2 h, 4 ° C halten), und pause bei 16 ° C.
   3. Fügen Sie eine 80 µL/Streifen (oder 10 µL/Schlauch) der zweite Strang-master-Mix für jedes Rohr über den Strip und halten Sie auf dem Eis. Übertragen Sie den Streifen auf den Thermocycler und initiierten über 16 ° C-Schritt fortsetzen. Inkubieren Sie den Streifen für 2 h bei 16 ° c
   4. Legen Sie nach dem zweiten Strang Synthese Schritt die Rohre auf Eis, um die nächste cDNA Reinigungsschritt überzugehen.
3. Doppelte gestrandete cDNA zu reinigen (erste Runde).
   Hinweis: Alle Centrifugations sind bei ~ 8.000 x g bei Raumtemperatur durchgeführt. Nie mehr als 16.000 x g zur Vermeidung von Schäden an der Filterpatrone.
   1. Beginnen Sie 100 µL der Nuklease-freies Wasser auf 50 – 55 ° C für die spätere Verwendung in einem trockenen Heizblock Heizung. Überschreiten Sie niemals 58 ° C um partiellen Denaturierung der cDNA zu verhindern.
   2. Ein 1,5 mL-Tube 250 µL cDNA Bindung Puffer hinzufügen. Überprüfen Sie, ob die Ausscheidungen im Puffer, dann wärmen der Pufferlösung auf 37 ° C für 10 min Ausscheidungen wieder aufzulösen.
   3. Übertragen Sie cDNAs aus einem einzigen 8-Röhre Streifen auf der cDNA Bindung Puffer. Kombinieren Sie die Zellen in diesem Schritt für weitere nachgelagerte Prozesse (8 Zellen in 1 Rohr). Mischung gründlich durch Pipettieren 2-3mal und flicking 3-4 Mal. Drehen Sie, um den Inhalt auf dem Boden erheben.
   4. Setzen der cDNA-Filterpatrone waschen Röhren (von einer in-vitro- Transkription (IVT) Kit) fest. Fügen Sie die obige Mischung in die Mitte des Filters. Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g ~ 1 min oder bis es durch den Filter ist. Verwerfen Sie der durchströmten und ersetzen Sie das Waschen-Rohr.
   5. Die Spalte 500 µL Waschpuffer aus dem IVT-Kit hinzufügen.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Ethanol der Waschpuffer zuvor hinzugefügt wurde.
   6. Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g ~ 1 min oder bis es durch den Filter ist. Entsorgen Sie durchströmten und Zentrifuge wieder bei 8.000 x g für ~ 1 min bis die Patrone leer.
   7. Die cDNA-Filter auf eine cDNA Elution Schlauch (1,5 mL Nuklease-free Tube) übertragen. Gelten Sie 8.5 µL vorgewärmten Nuklease-freies Wasser in die Mitte des Filters. 2 min warten und 8.000 x g für ~1.5 min zentrifugieren.
   8. Eluieren wieder mit 8,5 µL vorgewärmten Nuklease-freies Wasser und fahren Sie sofort mit der ersten Runde IVT.
      Hinweis: Double-Stranded cDNA-Wiederherstellungs-Volumes werden ~ 16 µL.
4. Durchführen eine in-vitro- Transkription (IVT) Reaktion verstärkt RNA (aRNA) Herstellung von cDNA (erste Runde).
   1. Legen Sie die Hybridisierung Luft Ofen auf 37 ° C.
   2. Bereiten Sie den master-Mix für IVT auf Eis in der folgenden Reihenfolge: 16 µL der eluierten doppelsträngige cDNA aus Schritt 2.3.8 hinzufügen 4 µL T7 ATP-Lösung (75 mM); 4 µL T7 CTP Lösung (75 mM); 4 µL T7 GTP-Lösung (75 mM); 4 µL T7 UTP Lösung (75 mM); 4 µL T7 10 X Reaktion Puffer; und 4 µL T7-Enzym-Mix. Gut mischen, spin, und halten Sie auf dem Eis.
   3. Jedes Rohr mit 16 µL cDNA fügen Sie 24 µL der IVT-master-Mix hinzu. Mischen Sie den Inhalt durch pipettieren, sanft und gründlich. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C für 14 h.
      Hinweis: Inkubation für < 12 h wirkt sich stark auf Ertrag.
   4. Fügen Sie nicht Diethyl-Pyrocarbonate (nicht-DEPC) 60 µL RNase-freies Wasser erhöhen Sie die Lautstärke auf 100 µL und beenden die IVT-Reaktion behandelt.
5. Reinigen Sie die aRNA.
   Hinweis: Alle Centrifugations sind bei ~ 8.000 x g bei Raumtemperatur durchgeführt. Nie mehr als 16.000 x g zur Vermeidung von Schäden an der Filterpatrone.
   1. Heizung ~ 200 µL Nuklease-freies Wasser auf 50 – 55 ° C für die spätere Verwendung in einem trockenen Heizblock oder PCR-Maschine zu starten. Überschreiten Sie niemals 58 ° C um partiellen Denaturierung von aRNA zu verhindern.
   2. Übertragen Sie aRNA auf einem 1,5 mL Nuklease-freie Rohr. Jede Probe aRNA 350 µL aRNA Bindung Puffer hinzufügen. Fügen Sie 250 µL Ethanol 100 % jedes Rohr zu mischen, indem Sie 3-Mal vom Pipettieren (Do nicht Wirbel zu mischen und zu drehen).
   3. Die Mischung sofort zum Übertragen der RNA-Reinigung-Spalte, indem es sanft zu der Mitte der Filterpatrone Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g ~ 1 min oder bis die Mischung völlig den Filter durchlaufen hat. Verwerfen Sie der durchströmten und Wiederverwenden Sie der Abfallsammlung tube
      Hinweis: RNA startet nach der Zugabe von Ethanol Ausfällen.
   4. Jeder Filterpatrone 650 µL Waschpuffer hinzufügen. Zentrifuge für ~ 1 min bei 8.000 x g oder bis der gesamte Puffer übergeben. Verwerfen Sie der durchströmten und drehen Sie die Filter für eine zusätzliche ~ 1 min, Spuren des Puffers waschen zu entfernen.
   5. Übertragen Sie den Filter auf eine frische aRNA Sammelrohr. Der Mitte des Filters 100 µL vorgewärmten (50-55 ° C) Nuklease-freies Wasser hinzufügen. 2 min warten, dann Zentrifugieren für ~1.5 min bei 8.000 x g oder bis es in das Sammelröhrchen bestanden hat.

3. zweite Runde Verstärkung

1. Die erste Strang cDNA zu synthetisieren (zweite Runde).
   1. Transfer aRNA aus Schritt 2.5.5 zu einem 200 µL Microfuge Schlauch und Vakuum konzentrieren sich die 100 µL elutant zu 10 µL. verwenden keine Hitze, laufen die Vakuum-Konzentrator für 65 min. vergleichen mit 10 µL Wasser in einem 200 µL Rohr, das reduzierte Volumen zu schätzen.
   2. Heizen Sie die Hybridisierung Luft Ofen auf 42 ° C vor.
   3. ARNA, Wirbel kurz, 2 µL random Hexamer Zündkapseln aus dem IVT-Kit hinzu und drehen Sie, um den Inhalt zu erfassen.
   4. Inkubieren Sie das Microfuge Rohr bei 70 ° C für 10 min in einem Thermocycler, dann legen Sie sie auf Eis.
   5. Bereiten Sie die folgenden RT-master-Mix: 2 µL 10 x ersten Strang Synthese Puffer, 4 µL dNTP-Mix, 1 µL RNase-Inhibitor und 1 µL ArrayScript Enzym. Mischung gut in einem 200 µL Microfuge Rohr durch sanft aufschütteln, dann drehen, um den Inhalt zu sammeln und auf Eis.
   6. Fügen Sie 8 µL RT-Master mix (erste Strang) zu jeder Microfuge Schlauch. Legen Sie die Rohre in einem 42 ° C Luft Inkubator für 2 h.
   7. Die obige Reaktion 1 µL RNaseH hinzufügen. Mischung gut durch Pipettieren 2-3mal und flicking 3-4 Mal, und Spin, den Inhalt zu sammeln. Inkubation bei 37 ° C für 30 min auf einer PCR-Maschine. Gehen Sie nach der Inkubation sofort zum zweiten Strang Synthese Schritt.
2. Den zweite Strang der cDNA zu synthetisieren (zweite Runde).
   1. Fügen Sie 3 µL T7-RA5 Grundierung (bei 25 ng/µL arbeiten Verdünnung, Tabelle 2) und 2 µL RNase-freies Wasser, jede DNA-Probe. Mischen Sie gut und drehen Sie, um den Inhalt zu erfassen.
   2. Bei 70 ° C für 10 min in einem Thermocycler inkubieren. Legen Sie die Reaktion auf Eis.
   3. Vorbereiten den RT-Master-mix (zweiten Strang) auf Eis: 58 µL Nuklease-freies Wasser, 10 µL 10 x zweiten Strang Puffer, 4 µL dNTP-Mix und 2 µL DNA-Polymerase. Mischen Sie gut durch aufschütteln und Spin, den Inhalt zu sammeln. Halten Sie auf dem Eis.
   4. Jedes Rohr 74 µL des oben genannten Mix aus Schritt 3.2.2 hinzufügen. Mischung von 2 – 3 Mal pipettieren und schnippen 3-4 Mal, dann drehen, um den Inhalt zu erfassen. Halten Sie auf dem Eis und halten.
   5. Kühlen Sie durch das Ausschalten der Deckel Hitze es Thermocycler bis 16 ° C vor. Legen Sie die Rohre in den Thermocycler für 2 h bei 16 ° C.
   6. Legen Sie nach dem zweiten Strang Synthese Schritt die Rohre auf Eis fahren mit der cDNA Reinigungsstufe oder Einfrieren bei-20 ° C.
      Hinweis: cDNA Reinigung empfiehlt sich vor dem Einfrieren.
3. CDNA Reinigung durchführen (zweite Runde).
   Hinweis: Alle Centrifugations sind bei ~ 8.000 x g bei Raumtemperatur durchgeführt. Nie mehr als 16.000 x g zur Vermeidung von Schäden an der Filterpatrone.
   1. Heizungswasser Nuklease-frei auf 50 – 55 ° C für die spätere Verwendung in einem trockenen Heizblock zu starten. Überschreiten Sie niemals 58 ° C um partiellen Denaturierung der cDNA zu verhindern.
   2. Übertragen Sie die cDNA auf einem 1,5 mL Nuklease-freie Rohr. Jedes Rohr 250 µL cDNA Bindung Puffer hinzufügen. Ausscheidungen im Puffer suchen Sie und wärmen Sie die Pufferlösung auf 37 ° C für 10 min wieder aufzulösen. Mischung gründlich von 2 – 3 Mal pipettieren und flicking 3-4 Mal. Spin, den Inhalt zu sammeln.
   3. Setzen Sie fest die cDNA-Filterpatrone in den Rohren zu waschen. Fügen Sie die obige Mischung in die Mitte des Filters. Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g ~ 1 min oder bis es durch den Filter ist. Verwerfen Sie der durchströmten und ersetzen Sie das Waschen-Rohr.
   4. Fügen Sie 500 µL Waschpuffer. Stellen Sie sicher, dass Ethanol der Waschpuffer zuvor hinzugefügt wurde. Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g ~ 1 min oder bis es durch den Filter ist.
   5. Verwerfen der durchströmten und Zentrifugieren wieder bei 8.000 x g für ~ 1 min bis die Patrone leer. Übertragen Sie die cDNA-Filter auf eine cDNA Elution Rohr.
   6. Gelten Sie 8.5 µL vorgewärmten Nuklease-freies Wasser in die Mitte des Filters. 2 min warten und Zentrifugieren bei 8.000 x g für ~1.5 min. Elute wieder mit zusätzlichen 8,5 µL vorgewärmten Nuklease-freies Wasser.
      Hinweis: Double-Stranded cDNA-Wiederherstellungs-Volumes werden ~ 16 µL.
   7. Gehen Sie sofort zur zweiten Runde IVT oder die cDNA bei-20 ° C über Nacht einfrieren.
4. Führen Sie eine zweite Runde von aRNA Produktion von IVT.
   1. Hybridisierung Luft Ofen auf 37 ° C (36 ° C Sollwert) festgelegt.
   2. Bereiten Sie den master-Mix für IVT auf Eis in der folgenden Reihenfolge: 16 µL der eluierten doppelsträngige cDNA aus Schritt 3.3.7 hinzufügen 4 µL T7 ATP-Lösung (75 mM); 4 µL T7 CTP Lösung (75 mM); 4 µL T7 GTP-Lösung (75 mM); 4 µL T7 UTP Lösung (75 mM); 4 µL T7 10 X Reaktion Puffer; und 4 µL T7-Enzym-Mix. Mischen Sie gut, kurz drehen Sie, um den Inhalt zu erfassen, und halten Sie auf dem Eis.
   3. Jedes Rohr mit 16 µL cDNA fügen Sie 24 µL der IVT-master-Mix hinzu. Mischen Sie den Inhalt durch pipettieren, sanft und gründlich. Inkubieren Sie Rohr bei 37 ° C für 14 h.
      Hinweis: Inkubation für < 12 h betrifft stark Ausbeute.
   4. Fügen Sie 60 µL nicht DEPC behandeltem RNase-freies Wasser erhöhen Sie die Lautstärke auf 100 µL und beenden die IVT-Reaktion.
5. ARNA Reinigung durchführen (zweite Runde).
   Hinweis: Alle Centrifugations sind bei ~ 8.000 x g bei Raumtemperatur durchgeführt. Nie mehr als 16.000 x g zur Vermeidung von Schäden an der Filterpatrone.
   1. Heizung ~ 200 µL Nuklease-freies Wasser auf 50 – 55 ° C für die spätere Verwendung in einem trockenen Heizblock oder PCR-Maschine zu starten. Überschreiten Sie niemals 58 ° C um partiellen Denaturierung von aRNA zu verhindern.
   2. Übertragen Sie aRNA auf einem 1,5 mL Nuklease-freie Rohr. Jede Probe aRNA 350 µL aRNA Bindung Puffer hinzufügen. Fügen Sie 250 µL ACS Klasse 100 % Ethanol zu jedem Rohr und 3 Mal mischen, indem Pipettieren (Do nicht Wirbel zu mischen und spin).
      Hinweis: RNA startet nach der Zugabe von Ethanol Ausfällen.
   3. Die Mischung sofort zum Übertragen der RNA-Reinigung-Spalte, indem es sanft zu der Mitte der Filterpatrone Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g ~ 1 min oder bis die Mischung völlig den Filter durchlaufen hat. Verwerfen der durchströmten und Wiederverwenden der Müllabfuhr-Röhre.
   4. Jeder Filterpatrone 650 µL Waschpuffer hinzufügen. Zentrifuge für ~ 1 min bei 8.000 x g oder bis der gesamte Puffer übergeben. Verwerfen Sie der durchströmten und drehen Sie die Filter für eine zusätzliche ~ 1 min, Spuren des Puffers waschen zu entfernen.
   5. Übertragen Sie die Filter auf eine frische aRNA Sammelröhrchen. Der Mitte des Filters 100 µL vorgewärmten Nuklease-freies Wasser hinzufügen. 2 min warten, dann Zentrifugieren für ~1.5 min bei 8.000 x g oder bis es vorbei ist.
   6. Aliquoten 2 µL in einem Rohr für Spektralphotometer (bei 260 nm Wellenlänge) und Bioanalyzer verbreiten Analysen für aRNA Ertrag und Qualität zu überprüfen.
      Hinweis: Konzentration muß mindestens 5 ng/µL; andernfalls lehnen Sie die Probe. Die Probe kann für ~ 1 Jahr bei-80 ° c gelagert werden Freeze-Auftauen der Proben zu vermeiden.
   7. Überprüfen Sie die Proben mit einem Bioanalyzer um zu visualisieren, ordnungsgemäße Ausbringung von aRNA-Produkten nach den Hersteller-Protokolls (Abbildung 2).

(4) verstärkt RNA Fragmentierung und Bereinigung

1. Mischen Sie Folgendes auf dem Eis (Gesamtvolumen 40 µL, kombinieren 2 Röhren von aRNA überschneidungsfreien Probe-Barcodes): 36 µL aRNA (200 ng gesamt) und 4 µL RNA Fragmentierung Puffer. Inkubieren Sie die Mischung bei 94 ° C für 90 s.
2. Bewegen Sie sofort die Mischung zu Eis und fügen Sie 4 µL RNA Fragmentierung Stop Puffer. Stellen Sie die Lautstärke auf 100 µL durch Zugabe von 56 µL Nuklease-freies Wasser.
3. Fügen Sie 350 µL RLT-Puffer von der RNA-Reinigung kit (siehe Tabelle der Materialien) und mischen Sie gut durch pipettieren. Fügen Sie 250 µL EtOH hinzu, mischen Sie gut durch pipettieren und übertragen Sie die Probe auf die RNA Reinigung Spin Spalte. Spinnen für 15 s bei 8.000 x g.
4. Übertragen Sie die Spalte auf neue Sammelröhrchen und fügen Sie 500 µL RPE Puffer hinzu. Spinnen für 15 s bei 8.000 x g. verwerfen der durchströmten. Fügen Sie 500 µL aus 80 % EtOH und Spin für 2 min bei 8.000 x g.
5. Übertragen Sie die Spalte auf eine neue Sammelröhrchen geöffnetem Deckel der Spalte und Spin für 5 min auf Hochtouren.
6. Die Spalte an eine neue Sammelröhrchen übertragen und eluieren mit 16 µL Nuklease-freies Wasser, Spinnen auf Hochtouren für 1 min.

5. Bibliothek Vorbereitung

Hinweis: IVTs können an dieser Stelle zusammengefasst werden, wenn es keine Überschneidungen in Barcodes verwendet gibt. Die Phosphatase Behandlungszeit ist 40 min. Poly-Nukleotid-Kinase Behandlungszeit beträgt 1 h.

1. Hinzugefügt 16 µL fragmentierten aRNA in einem 0,7 mL PCR-Röhrchen, 4 µL des folgenden Mix: 2 µL 10 x Phosphatase Puffer, 1 µL der Antarctic Phosphatase und 1 µL des rekombinanten Ribonuklease-Hemmer (z.B.RNaseOUT). Brüten in einem Thermocycler mit das folgende Protokoll: 37 ° C für 30 min, 65 ° C für 5 min und Halt bei 4 ° C.
2. Hinzufügen der 0,7 mL PCR Tube aus Schritt 5.1, 30 µL des folgenden Mix: 17 µL Nuklease-freies Wasser, 5 µL 10 x Phosphatase Puffer, 5 µL des ATP (10 mM), 1 µL des rekombinanten Ribonuklease-Inhibitor und 2 µL PNK. In den Thermocycler bei 37 ° C für 60 min inkubieren Sie, dann halten Sie bei 4 ° C.
3. Führen Sie eine Spalte Bereinigung der Phosphatase und aRNA PNK behandelt.
   1. Stellen Sie die Lautstärke auf 100 µL durch Zugabe von 50 µL Nuklease-freies Wasser. 350 µL Puffer RLT hinzufügen und gut verrühren. Fügen Sie 250 µL EtOH hinzu, mischen Sie gut durch pipettieren und übertragen Sie die Probe auf die RNA Reinigung Spin Spalte.
   2. Spinnen für 15 s bei 8.000 x g. übertragen die Spalte an eine neue Kollektion-Röhre geben und 500 µL RPE-Puffer.
   3. Spinnen für 15 s bei 8.000 x g. verwerfen die Durchströmung und fügen 500 µL von 80 % EtOH.
   4. Spin für 2 min bei 8.000 x g. Übertragung der Spalte an eine neue Kollektion-Röhre, öffnen Sie den Deckel der Spalte und Spin für 5 min auf Hochtouren.
   5. Übertragen Sie die Spalte auf eine neue Kollektion-Röhre und eluieren mit 14 µL Nuklease-freies Wasser, Spinnen auf Hochtouren für 1 min ein ~ 10 µL Volumen des Materials zu erholen. Entsorgen Sie die Spalte. Reduzieren Sie die Lautstärke auf 5 µL mit einem Vakuum Konzentrator für ~ 10 min.
4. Verbinden einer 3' Adapter mit einem kommerziellen kit (siehe Tabelle der Materialien).
   1. Verdünnen Sie die 3'-Adapter (RA3) aus TrueSeq Kit 3 Falten mit Nuklease-freies Wasser zu und speichern Sie die Aliquote bei-20 ° C.
   2. 5 µL Phosphatase und PNK-behandelten RNA fügen Sie 1 µL verdünnter 3' Adapter hinzu. Bei 70 ° C für 2 min inkubieren Sie, und dann sofort das Rohr auf dem Eis, Sekundärstruktur Bildung zu verhindern.
   3. Fügen Sie den folgenden Mix 4 µL: 2 µL 5 x HM Ligatur Puffer (HML) 1 µL RNase-Inhibitor und 1 µL T4 RNA Ligase 2 (abgeschnitten). Inkubieren Sie das Rohr auf die vorgewärmten Thermocycler bei 28 ° C für 1 h (unbeheizte oder bei geöffnetem Deckel).
   4. Mit das Reaktionsgefäß, noch auf den Thermocycler, fügen Sie 1 µL Stopplösung (STP) und sanft pipette das gesamte Volumen nach oben und unten 6 – 8 Mal zu mischen. Weiterhin das Reaktionsgefäß auf den Thermocycler bei 28 ° C für 15 min inkubieren, dann legen Sie das Rohr auf dem Eis.
   5. Fügen Sie 3 µL Nuklease-freies Wasser zu einem Gesamtvolumen von 12 µL. Verwendung 6 µL erhalten und speichern die restlichen 6 µL bei-80 ° C.
5. Führen Sie eine reverse Transkription Reaktion.
   1. Kombinieren Sie die folgenden in einem PCR-Röhrchen: 6 µL RNA Adapter ligiert und 1 µL RNA RT Primer (RTP). Das Rohr bei 70 ° C für 2 min inkubieren, dann sofort das Rohr auf Eis legen.
   2. Fügen Sie 5,5 µL des folgenden Mix: 2 µL 5 x ersten Strang Puffer, 0,5 µL 12,5 mM dNTP-Mix, 100 mM DVB-t, 1 µL RNase-Inhibitor und 1 µL Reverse Transkriptase 1 µL. Inkubieren Sie das Rohr in die vorgewärmte Thermocycler bei 50 ° C für 1 h, dann legen Sie das Rohr auf dem Eis (Proben können bei-20 ° C aufbewahrt werden).
6. Führen Sie PCR-Amplifikation mit 11-15 Zyklen, 5', 3'-Primer aufgespaltenen Produkt zu bereichern.
   1. Jede Reaktion der reversen Transkription, 35,5 µL des folgenden Mix hinzufügen: 8,5 µL Reinstwasser, 25 µL des PCR-Mixes (PML) und 2 µL RNA PCR Primer (RP1). Jede Reaktion hinzufügen 2 µL eindeutig indizierte RNA PCR Primer (jeweils, X = 1 bis 24).
   2. Verstärken Sie das Rohr in den Thermocycler mit folgenden PCR Radfahren Bedingungen: 98 ° C für 30 s; 12-15 Zyklen von 98 ° C für 10 s; 60 ° C bei 30 s; 72 ° C für 30 s; 72 ° C für 10 min; halten Sie dann bei 4 ° C.

(6) PCR Produkt Cleanup und Größenauswahl

1. Prewarm AmpureXP magnetische Beads bei Raumtemperatur. Wirbel die Perlen bis sie gut dispergierte, sind dann 50 µL hinzufügen 50 µL-PCR-Reaktion (PCR-Produkt: Perlen 1:1). Verwechseln Sie den Inhalt bis zehnmal gründlich mischen.
2. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 15 min. Platz auf einem Magnetstativ für mindestens 5 Minuten, bis die Flüssigkeit klar erscheint. Entfernen Sie und entsorgen Sie 95 µL des Überstands.
3. Fügen Sie 200 µL von frisch zubereiteten 80 % EtOH. Inkubieren Sie mindestens 30 s, dann entfernen und entsorgen der Überstand ohne zu stören die Perlen. Wiederholen Sie dies einmal mehr.
4. Trocknen Sie die Perlen für 15 min oder bis es komplett trocken an der Luft. Aufschwemmen Sie mit 32.5 µL Wiederfreisetzung Puffer. Pipette das gesamte Volumen nach oben und unten zehnmal gründlich mischen.
5. Inkubation bei Raumtemperatur für 2 min. Platz auf einem Magnetstativ für 5 min, bis die Flüssigkeit klar erscheint. Einen neuen Schlauch übermitteln Sie 30 µL des Überstands. Fügen Sie 20 µL Nuklease-freies Wasser, einem 50 µL Gesamtvolumen zu erhalten.
6. Durchführen Sie Größenauswahl an die PCR-Produkte mit festen Phase reversible Immobilisierung (SPRI) magnetische Beads.
   1. Das Rohr im Schritt 6.5 und Mischung gründlich vorbereitet durch Pipettieren fügen Sie 0,7 X Volumen (35 µL hinzu) SPRI Perlen. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   2. Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ und warten für 5 Minuten oder bis die Perlen getrennt. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne zu stören die Perlen.
   3. Fügen Sie 200 µL von frisch zubereiteten 85 % EtOH. Warten Sie 30 s, dann entfernen Sie die EtOH. Trocknen Sie die Perlen für 10 Minuten an der Luft.
7. Fügen Sie 20 µL Nuklease-freies Wasser. Legen Sie den Schlauch wieder auf den Magneten, 5 min warten und pipette aus den flüssigen Teil ohne zu stören oder die Perlen zu berühren. Speichern Sie die DNA bei-20 ° C.

7. Ermittlung der Bibliothek Menge und Qualität

1. Überprüfen Sie die Konzentration von DNA mit einem Spektrophotometer bei 260 nm Wellenlänge (Konzentration dürfte mindestens ca. 5 – 10 ng/µL).
2. Führen Sie 1 µL jeder Probe auf einem Bioanalyzer mit einem hochempfindlichen DNA-Chip, um Größenverteilung zu untersuchen (Peak bei 300 – 400 bp dürfte (siehe Abbildung 3)).

8. Muster Vorlage

1. Kombinieren Sie nicht überlappende Sequenzierung PCR Barcodes (Verhältnis 1:1). Zum Beispiel kombinieren PCR-Produkte von Proben mit RPI-1 und RPI-2, RPI-3 und RPI-4 zusammen in gleicher Nanogram Mengen, nach der RNA Sequenzierung Core Eingabe Gesamtstichprobe Menge Anforderung Empfehlungen.
2. Nach dem kombinieren, anpassen der Gesamtkonzentration 5 ng/µL und mindestens ein Volumen von 10 µL oder wie empfohlen durch Sequenzierung Anlage Kern.

Ergebnisse

Mit der oben beschriebenen Protokoll, GABAergen Neuronen manuell wurden sortiert (Abbildung 1) und RNA wurde verstärkt, dann in eine cDNA-Bibliothek (Abbildung 2) und bei großer Tiefe⁸sequenziert. Die verstärkte RNA (aRNA) Produkte lagen zwischen 200 – 4.000 bp in der Größe, mit einer Spitze Verteilung leicht über 500 bp (Abb. 3A). Die Perle-gereinigte cDNA-Bibliothek ...

Diskussion

Das manuelle Sortieren Protokoll eignet sich für eine betreute RNA Sequenzierung des Neurons Populationen, die entweder dünn mit der Bezeichnung im Gehirn von Mäusen oder repräsentieren eine seltene Zellpopulation, die sonst nicht möglich ist, mit aktuellen Hochdurchsatz-Zelle zu studieren Sortierung und Verstärkung Methoden. Zellen ausgesetzt FACS in der Regel durchlaufen Mantel und Probe Linie Drücke im Bereich von ~ 9 – 14 Psi, je nach Düsengröße und Ereignisraten gewünscht. Darüber hinaus können die Ze...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ERCC RNA Spike-In Control Mixes	Thermo Fisher	Cat# 4456740
SuperScript III	Thermo Fisher	Cat# 18080093
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Thermo Fisher	Cat# 10777019
RNA fragmentation buffer	New England Biolabs	Cat# E6105S
RNA MinElute kit	Qiagen	Cat# 74204
Antarctic phosphatase	New England Biolabs	Cat# M0289
Poly nucleotide kinase	New England Biolabs	Cat# M0201
T4 RNA ligase2, truncated	New England Biolabs	Cat# M0242
Ampure Xp magnetic  beads	Beckman Coulter	Cat# A63880
SPRIselect size selection magnetic beads	Thermo Fisher	Cat# B23317
DL-AP5	Tocris	Cat# 0105
CNQX	Tocris	Cat# 1045
TTX	Tocris	Cat# 1078
Protease from Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	Cat# P5147
Message Amp II kit	Thermo Fisher	Cat# AM1751
Carbogen	Airgas	Cat# UN3156
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	Cat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kit	Illumina	Cat# RS-200-0012
Bioanalyzer RNA Pico chip	Agilent	Cat# 5067-1513
Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip	Agilent	Cat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100	Agilent
Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.  (Leica model MZ-16F).	Leica	Model MZ-16F
Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.	Warner instruments	Model GC100-15, Order# 30-0017
Capillary pipette puller	Sutter Instruments Co	P-97
Vibratome	Thermo Microm	HM 650V
Vibratome tissue cooling unit	Thermo Microm	CU 65