Erstellung von Kolon Anastomose bei Mäusen

Zusammenfassung

Anastomosen Leck oder Aufschlüsselung nach der Operation ist eine der Hauptursachen der postoperativen Morbidität und Mortalität. Unsere Praxis für die Erstellung eines Kolon Anastomose ist eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Untersuchung der heilenden Mechanismen der Anastomosen.

Zusammenfassung

Intestinale Anastomosen werden häufig in Wahl- und emergent Operationen durchgeführt. Trotzdem, Anastomosen Lecks sind eine sehr gefürchtete Komplikationen des Kolon Operationen und können in bis zu 26 % der chirurgischen Anastomosen mit Sterblichkeit wird bis zu 39 % für Patienten mit solch ein Leck auftreten. Derzeit bleibt eine geringe Menge von Daten, die Detaillierung der zellulären Mechanismen der Anastomosen Heilung. Entwicklung von Präventionsstrategien und Behandlungsmethoden für Anastomosen Leck könnte stark potenzierte werden, durch ein besseres Verständnis der entsprechenden Anastomosen Heilung.

Ein Mausmodell ist ideal, da frühere Studien gezeigt haben, dass die murine Anastomose klinisch ähnlich dem menschlichen Fall im Vergleich zu anderen Tiermodellen. Wir bieten ein leicht reproduzierbar Mausmodell des Kolon Anastomose bei Mäusen, die zur weiteren Veranschaulichung der Anastomosen Heilung ermöglichen.

Einleitung

Eine sehr gefürchtete Komplikation der chirurgischen Anastomose des Darmes ist Anastomosen Panne oder Leck. Anastomosen-Leck, das Auslaufen von Intraluminal Inhalt in die Bauchhöhle verursacht, ist lebensgefährlich und kann schnell zu intra-abdominalen Sepsis führen; Schock-Preise schwanken zwischen 0,3 % und 5,5 % nach Dünndarm Anastomosen und steigen um 0,5 % bis 26 % für Kolon Anastomosen^1,2. Sterblichkeit nach Leckagen können so hoch wie 39 % durch das rasche Auftreten von Sepsis und schnelle Progression zu Tode nach intraabdominellen Kontamination³sein. Präventive Strategien und Behandlungsmethoden basieren derzeit auf Pathophysiologie, die nicht vollständig verstanden wird.

Derzeit ist Anastomosen Heilung oft die breiter studierte kutanen Wundheilung, verglichen mit denen erweist sich ein relativ armes Faksimile. Heilung geschieht in einer Reihe von überlappenden Phasen, beginnend mit der anfängliche Verzögerung-Phase. Bei 0-4 Tage nach Erstellung der die intestinale Anastomose ist die Lag-Phase durch eine akute entzündliche Reaktion definiert, die die Wunde der Zelltrümmer löscht. Als nächstes in ca. 3-4 Tagen verkörpert handelt Verbreitung und Produktion von Kollagen die Fibrophasia Phase. Schließlich, nach dem 10. Tag, längere Kollagen remodeling der Reifungsphase nennt. Es ist wichtig zu beachten, dass Anastomosen Stärke relativ gering ist und von der extrinsischen Unterstützung von chirurgisch platzierte Heftklammern hängt oder Naht bis Kollagen hinterlegten⁴ist. Verständnis der Rolle und Timing jede Schicht der Darmwand spielt in Anastomosen Wundheilung und die Beteiligung an entzündlichen vermittelte Zelltypen wie Makrophagen sowie erhellendes Surrogat-Marker, Anastomosen Fehlervorhersage oder Erfolg könnte erheblich verringern Sie Morbidität, Mortalität und Gesundheitsausgaben nach Dickdarm-Operationen-⁵.

Das Mausmodell in früheren Studien nachweislich in imitiert menschliche Anastomose⁶nützlich. Zwar gibt es beliebte, erprobte und gut untersuchte Beispiele für die Darmspülung Anastomosen Mausmodell, insbesondere die Methode von Komen Et Al. beschrieben ⁷, begünstigen diese Modelle Ileocecal oder aufsteigender Colocolonic Anastomosen Techniken⁸. Frühere Studien an menschlichen Patienten haben Leckageraten signifikanten Unterschied zwischen Ileocecal, Colocolonic und kolorektalen Anastomosen, die Notwendigkeit für weitere experimentelle Modelle zu unterschiedlichen anatomische Standorten gezeigt. Zusätzliche, im Volksmund verwendete Methoden richten sich an die Entwicklung eines Modells, das absichtlich eine Anastomosen Leck schafft, anstatt zu erhellen die zellulären Mechanismen, die für normale Anastomosen Wundheilung⁹erforderlich. Ratte-Modelle wurden in der Vergangenheit versucht aber haben Preise von Anastomosen Dehiszenz und/oder Anzeichen von Undichtigkeit (z. B. Abszessbildung) deutlich niedriger als Menschen und Mäusen^6,7. Darüber hinaus gibt es mehr gentechnisch veränderte experimentelle Linien in Mäusen als Ratten. Dies macht die Rattenmodell weniger nützlich für ein Anastomosen-Modell. Darüber hinaus hatten die Schweine und Hunde Modelle weniger klinische Untersuchung als Mausmodell^6,7.

Wir schlagen ein technisch einfach, sicher und schnell und reproduzierbares Verfahren für die Erstellung von Kolon Anastomosen in einem Mausmodell, die weitere Untersuchung der underreported Mechanismus der Anastomosen Wunde heilende^{10 erleichtern sollte} .

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Protokoll

Das folgende Protokoll wurde von der University of Oklahoma Health Sciences Center institutionelle Tierpflege und verwenden Committee (IACUC) zugelassen und erfüllt alle institutionellen ethischen Richtlinien bezüglich der Verwendung von Versuchstieren. Darüber hinaus wurden alle Experimente institutionelle, bundesstaatlichen und staatlichen Vorschriften über experimentelle Forschung an Tieren durchgeführt.

Hinweis: Für dieses Protokoll verwendet wir weibliche und männliche Congenic in gezüchtet C57BL6/J Mäusen im Alter von 12 bis 72 Wochen. Alle Mäuse, die für dieses Verfahren verwendet wurden bei uns ohne Sperrschicht für mindestens eine Woche vor der Operation zur Anpassung an die lokalen Biom gehalten. Tiere füttern zu Betriebszeiten durften und wir weder mündliche mechanische Darm Vorbereitung noch rektale Spülung vor Eingriff.

(1) Erstellung von Anastomosen

1. Autoklaven der chirurgischen Instrumente, warme salzhaltige Spüllösung und gründlich reinigen alle operativen Oberflächen mit 70 % Ethanol.
2. Um die Narkose zu induzieren, platzieren Sie den Mauszeiger in eine Induktion-Box, die mit einem Verdampfer verbunden ist. Liefern Sie 2-3 % Isofluran bei 1-2 L/min bis Mäuse sediert werden.
3. Legen Sie das Tier auf eine Erwärmung Gerät, z. B. ein Heizkissen, um Unterkühlung zu verhindern.
4. Subkutan injizieren ein Zeit-Dosis von 0,1 mg/kg Buprenorphin (3 µg für eine 30 g-Maus) für postoperative Analgesie und eine einmalige Dosis von 10 mg/kg von Enrofloxacin für präoperative Antibiotika-Prophylaxe.
   Hinweis: Obwohl Prä- und postoperativen Antibiotika nicht für diesen Vorgang erforderlich sind, institutionellen Richtlinien und das Tier kümmern und Ausschuss an unserem Institut empfohlen, ihre Verwendung in unserer Einrichtung zu verwenden.
5. Legen Sie die Narkose Rumpfspitze rund um die Maus Schnauze. Während der Operation sorgfältig überwachen Sie die Atemfrequenz des Tieres und passen Sie die Narkose Durchflussmenge nach Bedarf an. Pflegen Sie eine Atemfrequenz bei 30-40 Atemzüge pro Minute.
6. Verwenden Sie einen Haarschneider, gefolgt von einer Enthaarungscreme Agent, um die Haare von der gesamten Hautoberfläche des Bauches zu entfernen. Entfernen Sie gründlich den Enthaarungsmittel Agent mit Gaze benetzt mit Wasser oder 70 % Ethanol. Trocknen Sie das Tier.
7. Vor der Vorbereitung der Bauch, mit Klebeband die Maus Gliedmaßen, Heizkissen oder operative Oberfläche am Ende jedes Beines zu verhindern, dass die Maus verschieben während der Operation. Desinfizieren Sie den Bauch mit Chlorhexidin. Umfassen Sie den gesamten rasierten Bereich sowie die Haare an den Rändern von den rasierten Bereich. Legen Sie ein steriles Tuch über die Maus (Abbildung 1A).
   1. Geschnitten Sie vor drapieren ein kleines ovalen oder rechteckiges Fenster drapieren, die vorbereitet Bauch verfügbar zu machen.
      Hinweis: Sollte das Fenster aussetzen der gesamten Unterleib der Maus aber decken die Gliedmaßen, Tail, Kopf und Thorax. Wir schneiden eine 4 x 3 cm² Fenster für unseren Betrieb (Abbildung 1 b).
   2. Machen Sie einen kleinen Schlitz entlang der Mittellinie drapieren, von der Unterkante in Richtung eiförmig oder rechteckige Fenster, Zugriff auf das Rektum während des Verfahrens (Abbildung 1).
8. Machen Sie einen Hautschnitt. Starten Sie entlang der Mittellinie des Unterleibs und einzuschneiden Sie Haut mit einer Schere senkrecht zu den Xiphoid. Einzuschneiden Sie nur die Haut und zu vermeiden Sie, schneiden die Muskulatur der Bauchwand (Abbildung 2A).
9. Fassen Sie die Mittellinie der Bauchdecke mit der Zange und heben Sie vom Abdominal-Inhalt. Kümmert sich nicht zu verletzen Sie intraabdominellen Strukturen, einzuschneiden Sie die Länge der Mittellinie Bauch-Faszie vertikal mit einer scharfen Schere. Verlängern Sie die Länge der Hautinzision (Abb. 2 b).
10. Wenn der Darm ausgesetzt sind, suchen Sie den Blinddarm und Dünndarm und drehen Sie die linksseitige Eingeweide medial um die absteigend und Sigma Doppelpunkt verfügbar zu machen. Beschichten der stumpfen Prüfspitze mit Schmier-Gelee und sorgfältig voraus die Sonde in den Enddarm zur Unterstützung bei der Identifizierung des absteigenden/sigmoid Colon (Abbildung 3).
    Hinweis: Im Gegensatz zum Menschen, der Maus Blinddarm in der Regel im linken oberen Quadranten des Bauches findet. Achten Sie darauf, nicht mit der Sonde in diesem Schritt die Darmwand perforieren. Wenn Darmwand perforiert ist, das Verfahren abbrechen und die Maus einschläfern.
    1. Zu vermeiden, greifen der Blinddarm mit gezahnten oder scharfen Zange. Stattdessen verwenden Sie atraumatische Pinzetten, Baumwoll-Spitzen Applikator oder sanfte Finger Manipulation, Eingeweide zu drehen.
    2. Nutzung erwärmt sterile Kochsalzlösung um sicherzustellen, dass die freiliegende Darm während des Verfahrens feucht gehalten wird.
    3. Der Doppelpunkt wird auf der linken Seite der Mittellinie sein und an der Retroperitoneum über das Mesenterium. Entziehen Sie nach der Identifizierung die stumpfe Sonde teilweise um Colotomy zu erleichtern.
11. Führen Sie quer Colotomy des Dickdarms Sigma.
    1. Fassen Sie sanft Sigma Dickdarm überlegen den Becken-Einlass mit atraumatische Pinzetten (Abb. 4A).
    2. Mit scharfen Mikro-Schere, machen Sie einen Schnitt in der Sigma-Doppelpunkt senkrecht zur Richtung des Dickdarms und erstreckt sich über 80-90 % der Breite des Dickdarms. Damit verhindert Retraktion von einem Ende des Dickdarms aus dem Operationsfeld und Reparatur (Abbildung 4 b) zu erleichtern.
    3. Wenn ein mesenterialen Blutgefäß im Laufe des viszeralen Drehung oder Colotomy verletzt ist, halten Sie sanft Druck für bis zu 2 min mit Gaze oder einem Applikator Baumwolle gekippt. Wenn Blutungen nach dieser Zeit fortbesteht, legen Sie eine acht 8-0 Monofile Faden um den Punkt von Blutungen.
       Hinweis: Wenn der Darm Anzeichen von Nekrose oder Verletzungen nach diesem zeigt, das Verfahren abbrechen und einschläfern der Maus eine humane Methode von Ihrem institutionellen Tiernutzung Ausschuss genehmigt.
12. Die sigmoid Colotomy zu reparieren.
    1. Mit einer Castroviejo Nadelhalters, legen Sie 5-6 einfache unterbrochenen 8-0 nonabsorbable Polypropylen Stiche um die Kolostomie zu reparieren. Platzieren Sie Nähte 1 mm voneinander entfernt mit 0,5 mm Stiche.
       1. Achten Sie, dass die Kanten des Darms in die Reparatur zu Rollen, indem man etwas mehr Darmhaut als Schleimhaut mit jedem Stich. Lassen Sie die Schwänzen 5 mm lang. Kümmern Sie sich nicht um versehentlich Fang umgebenden Darm in die Naht (Abbildung 4).
          Hinweis: Es ist hilfreich zu beginnen, Nähen in der nahe der mesenterialen Grenze des Colotomy, der anti-mesenteric-die meisten als Bestandteil der Colotomy für die letzte Rettung.
       2. Verlauf der Reparatur voraus Trans anal stumpfe Spitze Dissektion Sonde um die Reparatur zu überspannen, bevor die endgültige Nähte gesetzt werden. Dies hilft zu verhindern, dass eine Reparatur zu schmale und Raten von Anastomosen Striktur zu verringern.
13. Mit einer 10 mL Spritze mit angewärmte Kochsalzlösung gefüllt, den Bauch mehrmals zu bewässern. Wenn die Oberfläche unter der Maus getränkt wird, trocknen Sie die Maus oder bewegen Sie die Maus auf eine trockene Oberfläche, um Unterkühlung zu vermeiden.
    1. Verwenden Sie einen sterilen Gaze über den Schnitt gelegt, um überschüssige Bewässerung aufzusaugen.
    2. Füllen Sie bei der endgültigen Bewässerung den Bauch mit sterilen Kochsalzlösung. Sorgfältig voraus eine geschmierte 18 G Angiocatheter in den Enddarm und aufblasen mit 0,5-1 cm³ Luft. Dies wird irgendwelche Löcher in die Anastomose zeigen, als mit einem anderen unterbrochenen Polypropylen Naht mit der sterilen Sonde die Anastomose Span repariert werden können.
    3. Entleeren Sie den Darm mit der Angiocatheter vor der Entnahme.
14. Stellen Sie sicher, dass gibt es keine aktiven Blutungen. Wenn es ist, üben Sie sanften Druck direkt auf den Punkt der Blutung für 1-2 min. Ort blutstillende Naht, wie oben beschrieben, wenn die Blutung anhält.
15. Sanft die medialisierte Eingeweide zurück in seine normale anatomische Position (Abb. 5A).
16. Schließen Sie den Bauchschnitt (Abb. 5 b).
    1. Mit 4: 0 resorbierbaren geflochtene Fäden, legen Sie eine laufende Naht entlang der Muskelschicht der Bauchwand an der Spitze des Schnittes beginnend und endend an der minderwertigen Aspekt des Schnittes. Installieren Sie eine Krawatte und schneiden Sie die Naht verlassen 5 mm Endstücke.
       Hinweis: Nicht integrieren Sie versehentlich Darm in die Bauchdecke Schließung.
    2. Wiederholen Sie mit 4: 0 Monofile Naht an der Haut (Abbildung 5) zu schließen.
17. Stellen Sie sicher, dass das ganze Tier warm und trocken, um postoperative Unterkühlung zu verhindern.
18. Das Tier sorgfältig zu überwachen, wie es aus der Narkose erholt. Verwalten Sie Buprenorphin 0,1 mg/kg alle 72 h für ca. 2-3 Tage nach dem Eingriff zur Schmerzkontrolle.  Während der Erholungsphase sollten Mäuse täglich sorgfältig auf Anzeichen von Abszess oder peritonealen Sepsis untersucht werden.  Postoperative Beobachtung für Schmerzen und Qualen sollte enthalten: Einschränkung der Bewegungsfreiheit, einschließlich der Art der Haltung, Mangel an Essen oder trinken, nicht richtige Pflege, übermäßige Entzündung um Wunde, Mangel an normalen Heilung am Ort der Inzision, gebeugt oder nicht normal Verschachtelung.  Alle Tiere zeigen alle diese Verhaltensweisen sollten sofort durch CO₂ ersticken für ein Minimum von 10 min, gefolgt von bilateralen Thorakotomie eingeschläfert werden.
19. Mischen Sie 0,1 mg/mL Enrofloxacin für 7 Tage nach der Operation zur Vermeidung intraabdominalen Infektionen oder Sepsis durch fäkale Verunreinigungen, die mit dem Betrieb verbunden mit der Maus Trinkwasser.

(2) Ernte Anastomosen Gewebe

1. Kurz vor besteuert Anastomosen Gewebe, einschläfern Sie die Maus über eine humane Methode der institutionellen Tiernutzung Ausschuss gebilligt.
   Hinweis: Basierend auf institutionelle Politik, einschläfern wir unsere Tiere, indem man sie in einer Kohlendioxid-Kammer mit 100 % CO2-Gas-Infusion bei 2 L/min für 5 min vor der Durchführung bilateraler Thorakotomie.
2. Sterilisieren Sie den Bauch mit Chlorhexidin gefolgt von 70 % Ethanol.
3. Neu einzuschneiden des ursprünglichen Mittellinie Schnittes mit einer scharfen Schere. Beginnen Sie am unteren Pol der vorherigen Schnitt und verlängern Sie diesen Schnitt souverän zum Xiphoid (Abb. 6A).
4. Mit Schere, Schnitt in die Muskelschicht und nach der Eingabe des peritonealen Raumes, den Schnitt an der Ober- und Unterseite des Schnittes zu verlängern. Achten Sie darauf, um den Darm zu verletzen, betritt den Bauch oder die Anastomose zu stören zu vermeiden, da es sein kann, dass Darm zum Einschnitt oder Anastomosen Standort eingehalten.
5. Führen Sie sorgfältig eine mediale viszeralen Linkslauf Freilegung der reparierten Sigma Doppelpunkt (Abb. 6 b). Es wird wahrscheinlich sein Darm zu Darm Verwachsungen rund um die Reparatur. Sanft und ohne Umschweife zu sezieren diese Verwachsungen entfernt von der Website der Reparatur. Sorgsam die Anastomose zu stören.
   1. Identifizieren Sie die Reparaturstelle durch Ortung die Schwänzen von Polypropylen Naht, die für die Reparatur verwendet. Mit einer Schere und ab 1 cm proximal zur Reparatur, Transekt quer durch den absteigenden Dickdarm. Wiederholen Sie diesen Schritt 1 cm distal auf Website der Anastomose.
6. Entfernen der sigmoidale Segments scharf Sezieren des Dickdarms aus der beigefügten Mesenterium an der hinteren Grenze des Dickdarms mit einer feinen Schere (Abbildung 7).
7. Identifizieren der mesenterialen Grenze der Doppelpunkt Probe und feinen Schere verwenden, um entlang der Länge der mesenterialen Grenze in einer longitudinal Mode geschnitten. Dies erstellt einen quadratischen oder rechteckigen Abschnitt des Dickdarms aus der zylindrischen Probe zuvor entfernt (Abbildung 8).
8. Verwenden Sie einen Markierstift, um den Anti-mesenterialen Grenzverlauf des Dickdarms vor dem Ausbau des Segments Doppelpunkt. Machen Sie nach der Entfernung einen längs-Schnitt entlang der Länge des Dickdarms gegenüber der Markierung. Beheben Sie, Betten Sie ein und schneiden Sie Probe Gewebe wie für Histologie und/oder Immunostaining erforderlich.

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Ergebnisse

7 Tage nach der Operation sollten die Anastomose auch geheilt werden. Die Anastomose kann geerntet werden, zu Zeitpunkten vor und nach sieben Tagen besser die Stadien der Anastomosen Heilung veranschaulichen. In Abbildung 9zeigt die histologische Analyse eine fibrotische (Kollagen visualisiert durch trichrome Färbung) Antwort von glatten Muskelzellen Alpha-Actin positive Myofibroblasts vermittelt. Allerdings haben wir festgestellt, dass Ergebnisse aus histol...

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Diskussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte zu sichern den Erfolg und die Morbidität/Mortalität mit diesem Verfahren zu minimieren. Erstens gewährleisten Sie schonenden Umgang mit Darmgewebe und kümmern Sie uns um Traktion Verletzungen beim Drehen die Eingeweide um den Doppelpunkt zu setzen. Unnötige Spannung auf den Darm oder Mesenterium können Verletzungen der Darm- oder Gefäßsystem und Ursache Darm Nekrose von den Stätten des Anastomose. Darüber hinaus sollten scharfe Zange oder Pinzette mit Zähnen nicht verwendet we...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL6/J mice	Jackson Labs	#00664
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Polylined Sterile Field, 18" x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Cut a rectangular hole
Isothesia isoflurane	Henry Schein	50033
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair depilatory cream	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorphine  0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser Pharma Inc	NDC 12496-0757-5
1 cc insulin syringe, 27 G	Becton Dickinson	329412
Chloraprep Shampoo	Medline	APL82287
Webcol alcohol prep swabs	Covidien	6818
BioGel PI surgical gloves	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Forceps with teeth	Roboz	RS-5150
Fine scissors- sharp	Fine Science Tools	14060-09
Straight serrated forceps	Fine Science Tools	11050-10
Castro-Viejo needle driver	Fine Science Tools	12565-14
0.9% Sodium Chloride Irrigation	Baxter	BHL2F7121	Warm to 37 °C prior to use
10 ml syringe	Becton Dickinson	309604
4-0 Vicryl absorbable braided suture, 18", PS-2 needle	Henry Schein	6546037
Blue monofilament suture 24” BV-1 needle	Henry Schein	8305H	Usually comes double-armed. Cut the suture at the midway point to generate two usable sutures.
Cole-Parmer Microscissors, Standard Grade, Straight, 4".	Cole- Parmer	EW-10818-06
Medline Sterile lubricating jelly	Medline	MDS032273H