Ein Sphäroid Tötung Assay von Auto-T-Zellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll dient zur Immuntherapie umgeleiteten T-Zellen (Auto T-Zelle) Zytotoxizität gegen 3D strukturierte Krebszellen (Sphäroide) in Echtzeit zu bewerten.

Zusammenfassung

Immuntherapie hat ein wachsendes Interesse an den Kampf gegen den Krebs sonst unbehandelbaren entwickelt. Unter allen immuntherapeutischen Methoden umgeleitet chimeric Antigen-Rezeptor (Auto) T-Zellen die spektakulärsten Ergebnisse, insbesondere mit pädiatrischen B-akute lymphoblastische Leukämie (B-ALL). Klassische Validierungsmethoden Auto T-Zellen verlassen sich auf die Verwendung von Spezifität und Funktionalität Assays der Auto-T-Zellen gegen die Ziel-Zellen in Suspension und Xenograft-Modelle. Leider, in-vitro-Beobachtungen sind oft Ergebnisse in Vivo entkoppelt und einiges an Aufwand und Tiere könnte erspart werden, indem man einen weiteren Schritt: die Verwendung von 3D Culture. Die Produktion der Sphäroide aus potenziellen Zielzellen, die 3D-Struktur der Tumorzellen zu imitieren, wenn sie in das Tiermodell aufgeprägt sind stellt eine ideale Alternative dar. Hier berichten wir über eine erschwingliche, zuverlässige und einfache Methode, um Sphäroide aus einem ausgestrahlt kolorektalen Zelllinie als ein Validierungstool für Adoptiv-Therapie (hier am Beispiel CD19 Auto T-Zellen) produzieren. Diese Methode ist gekoppelt mit eine erweiterte live-imaging-System, das Sphäroid Wachstum verfolgen kann, Effektor Zellen Zytotoxizität und Tumor Zellapoptose.

Einleitung

Adoptiveltern Zelltransfer (ACT) repräsentiert die nächste Generation-Krebs-Behandlung. Es stützt sich auf die Injektion von Effektorzellen (T - und NK-Zellen) in einem Patienten. Diese Zellen können genetisch mit einem Rezeptor geändert werden, die zu ihrem Ziel, den Tumor zu führen und zu zerstören. Vor kurzem wurde dieser Ansatz gezeigt, möglich sein, wenn ein gegen den B-Zell-Marker CD19 Chimeric Antigen Rezeptor (Auto) in die Patienten T-Zellen zu töten, seine/ihre Krebs-¹eingeführt wurde. Bei Auto, welches eine künstliche Rezeptor, das Design besteht aus spezifischen Antikörperfragmente der Antigen-bindende Domäne auf eine Entität benannten einzelne Kette Variable Fragment (ScFv), reduziert auf die T-Zelle Signalisierung Domänen verknüpft. Zwar gibt es mehrere Entwürfe, die am häufigsten verwendeten Versionen bezeichnet als zweite Generation Auto-Designs, der CD3z für die TCR Signalisierung und einer co-stimulatory Domäne bestehen (CD28, 4-1BB, OX40, etc..) ^{1 , 2}. Feld Immuntherapie geleitet die meisten ihre Aufmerksamkeit auf diese neue Form des Gesetzes, wenn CD19 CAR-T-Zellen wirksam zahlreiche Patienten mit B-Zell-Tumoren^{3,4 behandelt}. Nach diesem Erfolg versuchten Forscher ähnliche Entwürfe zu nutzen, indem Sie auf andere Epitope bei soliden Tumoren mit begrenztem Erfolg. Der Mangel an spezifischen Tumorantigenen und den härteren Tumor Mikroumgebungen gerendert CAR T Zellen leider weniger effektiv gegen solide Tumore⁵.

Setzen derzeit, die am häufigsten verwendeten in Vitro Validierungsstrategien auf zweidimensionale (2D) Systeme, die nur ein Fragment der bereits genannten soliden Tumoren Herausforderungen anzugehen. Klassisch, beinhalten 2D in-vitro- Systeme eine Mischung aus Auto-T-Zellen und Ziel Krebszelllinien als Monolagen zur Beurteilung der Funktionalität und Spezifität dieser Effektor-Zellen. Obwohl diese Strategien wichtige und entscheidende Teile des Studiums sind, sie nicht die komplexe Morphologie und dreidimensionale (3D) Struktur der Krebs Zellen⁶berücksichtigen. Krebszellen in 3D Systeme, genannt Sphäroide, kultiviert erwerben neue phänotypische Merkmale durch Veränderungen im gen Ausdruck Profil⁷, in dem die Anerkennung durch die umgeleiteten Effektorzellen beeinflussen könnten. Birgersdotter und Kollegen gezeigt, dass eine Hodgkin Lymphom (HL) Zell-Linie, wenn nur in einem 3D Culture Modell gewachsen ein Genexpressionsprofil erwirbt, die primären Tumor Proben⁸ähnlich ist. Daher culture Sphäroide oder ähnliche 3D Methoden Angebot relevanter in Vitro Modellen im Gegensatz zu standard-2D-Systeme. Solche Systeme sind auch ähnlich wie in vivo-Studien, die als der letzte Schritt im Prozess Validierung eines bestimmten Autos gesehen werden. Wenn man bedenkt, dass 2D Systeme versagen, die Morphologie des Krebs-Cluster zu imitieren, Sphäroide bieten ähnliche Formationen zur Beurteilung der Funktionalität des CAR-T-Zellen vor dem in-vivo-Modelle. In einer Studie, Pickl Et Al. festgestellt, dass ein Sphäroid Modell des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (HER2) Krebszellen überexprimiert ähnliche Signalisierung Profile zur in-vivo Modelle⁹demonstriert. Dies unterstützt weiter die Sphäroide relevant und Nähe zu in Vivo Beurteilung der Auto-T-Zellen bieten. Darüber hinaus Auto T-Zell-Validierung gegen Sphäroide könnte helfen, ihre Wirksamkeit mehr kritisch zu beurteilen und verhindern, dass einige der Designs bewegt, in vivo Studien vorzeitig¹⁰; so, zur ethisch betreffenden Forschung durch weniger Tiere zu opfern. Darüber hinaus sind Protokolle mit Sphäroide nicht teurer als klassische 2D Systeme und viel schneller im Vergleich zu klassischen in Vivo Studien. Zusammen genommen, kann man voraussagen, dass die Einbeziehung der Sphäroid Studien gängige Praxis bald, in vitro und in vivo Studien zu verknüpfen.

Hier präsentieren wir Ihnen die Vorbereitung der Sphäroide aus der Dickdarm-Krebs-Zell-Linie HCT-116. Diese Zelllinie wurde geändert, um das menschliche CD19-Molekül empfindlich gegen CD19 Auto T-Zellen zu rendern und eine klare Einschätzung der Tötung mit einer klinisch validierte Auto-Konstrukt zum Ausdruck bringen.

Protokoll

1. Generation der Sphäroide von Colorectal Krebs-Zell-Linie

1. Waschen HCT-116 (stabil auszudrücken, Differenzierung-19-Cluster (CD19) und grüne Fluoreszenz Protein (GFP) ausgestrahlt) Zelle Monolagen mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 5 mL für ein 25 cm² oder 10 mL für ein 75 cm² Fläschchen). Hinzufügen von Trypsin (0,5 mL für ein 25 cm² oder 1 mL für ein 75 cm² Fläschchen) und Zellen bei 37 ° C für 5 min inkubieren.
2. Überprüfen Sie Ablösung der Zelle unter dem Mikroskop und Zelle Dissoziation Enzym mit kompletten Roswell Park Memorial Institute 160 Medium (RPMI 1640) zu neutralisieren (RPMI 1640 + 10 % FCS + Gentamycin; 10 mL für ein 25 cm² oder 20 mL für ein 75 cm² Fläschchen).
3. Zentrifuge Zellsuspension bei 500 X g für 5 min. überstand mit einer Pipette entfernen und erneut von oben und unten mehrmals mit 5 mL des kompletten DZ1 1640 Medium pipettieren.
4. Anzahl Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung auf einem kompatiblen Handy-Zähler.
5. Zentrifuge Zellsuspension bei 500 X g für 5 min. überstand mit einer Pipette entfernen und erneut in RPMI Medium, 5 x 10³ Zellen/mL zu erhalten.
6. Die Zellsuspension auf einem sterilen Behälter übertragen und 200 µL/Well in eine 96-Well Runde Bodenplatten mit einer Mehrkanal-Pipette zu verzichten.
7. Übertragen Sie die Platte auf das automatisierte bildgebenden Gerät in einen Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO₂).
8. Melden Sie sich bei der Software zur Datenerfassung, wählen Sie Zeitplan zu erwerben | Start hinzufügen Schiff | Scannen nach Zeitplan | Schiff zu schaffen: neue.
9. Wählen Sie Scan-Typ: Sphäroid. Wählen Sie die Kanäle von Interesse: Phase + Hellfeld (, Sphäroide Wachstum zu folgen), grün (Tumor Signal folgen, Erwerb Zeit 300 ms) und rot (Apoptose zu folgen, Erwerb Zeit 400 ms).
   1. Wählen Sie die gewünschte Vergrößerung: 10 X.
   2. Wählen Sie Das Schalenmodell und seine Position in der Schublade. Wählen Sie die Position der Brunnen zum Bild. Geben Sie die Beschreibung des Experiments: Name, Art der Zellen, Anzahl der Zellen.
10. Wählen Sie für die Analyse-Setup Verschieben Analyse bis später. Rechtsklick auf die Zeitleiste und Option Festlegen ausgewählt Scan-Intervall und setzen Scans hinzufügen jedes bis 4 h und für eine Gesamtmenge von 24 h. Legen Sie die gewünschte Startzeit (mindestens 1 h nach der Inkubation in der automatisierten bildgebende Apparatur).
11. Überprüfen Sie alle 2 Tage für das Wachstum der Sphäroide, indem Sie sich in der imaging-Software.
    1. Wählen Sie die Option Ansicht den letzten scannt , und doppelklicken Sie auf das gewünschte Experiment. Wählen Sie Hellfeld im Kanälebedienfeld Bild aus und verwenden Sie dann das Tool messen Bild Funktionen zur Messung des Durchmessers der Sphäroide. Es dauert 6 Tage für ein Sphäroid, die gewünschte Größe zu erreichen: 0,5 mm Durchmesser. Fügen Sie 50 µL kompletten RPMI Medium pro Bohrloch am Tag 4, mittlere Verdunstung Effekt zu begrenzen.

2. Generation von CD19 Auto T-Zellen

1. Ausbau des CD19 Auto T-Zellen
   Hinweis: Stabile Expression von CD19 Auto T-Zellen wurde von Schüttgut retrovirale Transduktion des gesunden Spenders PBMCs als zuvor beschriebenen¹⁶übernommen. Für CD19 Auto kodierenden retroviralen Konstrukt ist ein der zweiten Generation Auto und besteht aus fmc63-ScFv-Kette, CD8 Scharnier und transmembrane Domäne, eine 4-1BB co-stimulatory Domain und schließlich ein CD3ζ-Domäne.
   1. Um zu erweitern, Zellen Kultur transduced T in Anwesenheit von Anti-CD3/28 magnetische Beads mit einer Zelle Wulst-Verhältnis von 1:1 für 10 – 11 Tage. Während der Expansion Zellen sind im kompletten Medium (X-VIVO 15, 5 % Serum Ersatz, und 100 U/mL rekombinanten menschlichen Il-2).
      Hinweis: Die optimale Dichte für einen effizienten Ausbau ist 1 bis 2 x 10⁶ Zellen/mL. Abhängig von der ursprünglichen Anzahl können Zellen in Flaschen (25 cm² Fläschchen 20 ml, 75 cm² Flaschen bis 40 mL Gesamtvolumen) in eine Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO₂) erweitert werden.
   2. Als Negativkontrolle Gruppe für die folgenden Tests gehören nicht ausgestrahlt PBMCs (wird als Mock bezeichnet werden) zum Ausbau Protokoll parallel zur CD19 Auto T-Zellen.
   3. Am 3. Tag ab, fügen Sie frisches Medium jeden Tag und teilen Sie die Zellen in mehr Kulturflaschen, falls erforderlich.
   4. Am Tag 10 – 11, Zentrifuge Zellen bei 500 X g für 5 min. Überstands entfernen und kombinieren Sie alle Zellen in einem 50 mL-Tube und Aufschwemmen der Zellen in ~ 30 mL frische komplette Medien.
   5. Legen Sie die 50 mL-Tube mit der resuspendierte Zellen auf einem Magnetstativ, magnetische Beads aus dem Kulturmedium zu trennen.
   6. Warten Sie 2 – 3 min. für die Perlen auf der Seite der Röhre zu sammeln.
   7. Entfernen Sie das Kulturmedium mit einer Pipette und Übertragung auf einen neuen Schlauch ohne magnetische Bead Kollektion Zonen zu berühren.
   8. Wiederholen Sie die Schritte zur Perle Entfernung (2.1.5–2.1.7) einmal mehr um die Anzahl der Perlen in der endgültigen Kulturmedium.
   9. Aufschwemmen Sie und zählen Sie die Zellen, passen Sie die Dichte auf 1 bis 2 x 10⁶ Zellen/mL in kompletten Medium.
   10. Ruhen Sie die Zellen für mindestens 4 h bis über Nacht. Dann direkt frieren sie unten bei-80 ° C und übertragen Sie die Fläschchen mit einem flüssigen Stickstoff-Tank am folgenden Tag für die Langzeitlagerung. Alternativ kann man den Rest bis zu über Nacht für den sofortigen Einsatz verlängern.
2. CD19 Ausdruck Fahrzeugbeherrschung auf primäre T-Zellen
   1. Die Anzahl der erweiterten T-Zellen, wie die Zahlen nach Übernachtung Kultur oder mäßig nach Frost/Tau-Wechseln leicht variieren können.
   2. Übertragen Sie 5 x 10⁵ Zellen aus beiden CD19-Auto und Mock primäre T-Zellen, Flow Cytometry Rohre zu trennen.
   3. Waschen Sie die Zellen mit 200 μl Puffer fließen (2 % FBS mit PBS-Puffer) und Zentrifuge die Rohre bei 500 X g für 5 min. wiederholen Waschschritte get rid of verursacht durch das Kulturmedium Artefakte.
   4. Bereiten Sie den primären Antikörper (Biotin Goat Anti-Maus IgG, F(ab') ₂ Fragment spezifischen) mit Verdünnung 1: 200 in Puffer fließen.
   5. Zellen in 100 μl Antikörper-Mix pro Röhre Aufschwemmen und Inkubation auf Eis für 15 min. Wiederholen Sie die vorherigen Waschschritt zweimal, um überschüssige Antikörper zu entfernen.
   6. Bereiten Sie den sekundären Antikörper (Streptavidin-PE) als 1: 400 Verdünnung im Puffer fließen.
   7. Zellen in 100 μl Antikörper-Mix pro Röhre Aufschwemmen und Inkubation auf Eis für 15 min. Wiederholen Sie die vorherigen Waschschritt zweimal, um loszuwerden überschüssige Antikörper.
   8. Zellen in 200 μL der Flow Puffer pro Röhre Aufschwemmen und auf einem Durchflusszytometer analysiert.
   9. Verwendung Mock T-Zellen die negativen und positiven Tor einrichten und analysieren CD19 Auto ausgestrahlt T-Zellen entsprechend.

3. 3D Tumor Sphäroid Tötung Assay

1. Nach 6 Tagen oder einmal Sphäroide erreichen Sie die gewünschte Größe, entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator. Entfernen Sie mit einem Mehrkanal-Pipette, vorsichtig 100 µL/Well des kompletten RMPI 1640 Medium von den Sphäroid Platten.
   1. Für diesen Schritt Winkel die Spitzen nach innen Wand der 96-Brunnen Platte, Vermeidung von Kontakt mit dem Boden des Brunnens um Störungen der Sphäroide zu minimieren. Volumen der verbleibenden muss rund 100 µL betragen.
2. Bereiten Sie eine 1: 200-Lösung von Annexin V rot durch das Mischen von 50 µL Annexin V rot mit 9,95 mL komplette RPMI 1640 Medium.
3. 100 µL/Well 1: 200 Annexin V rot Lösung hinzufügen.
4. Die Platte auf ein Brutkasten für 15 min (37° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO₂) übertragen.
5. Ernten Sie die transduced Auto CD19 T-Zellen in einem 15 mL-Tube und Zentrifuge bei 500 X g für 5 min. entfernen den Überstand mit einer Pipette und Aufschwemmen von oben und unten mehrmals mit 2 mL des kompletten DZ1 1640 Medium pipettieren.
6. Anzahl Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung auf einem kompatiblen Handy-Zähler.
7. Zentrifuge Zellsuspension bei 500 X g für 5 min. überstand mit einer Pipette entfernen und erneut in RPMI Medium, 2 x 10⁵ Zellen/mL zu erhalten.
8. Die Zellsuspension auf einem sterilen Behälter übertragen und 100 µL/Well in eine 96-Well Runde Sphäroid Bodenplatte mit einer Mehrkanal-Pipette zu verzichten.
9. Übertragen Sie die Platte wieder auf das automatisierte bildgebenden Gerät in einen Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO₂).
10. Melden Sie sich bei der Software zur Datenerfassung, wählen Sie Zeitplan zu erwerben.
    1. In der Scan-Zeitleiste mit der rechten Maustaste und wählen Sie Bearbeiten Zeitleiste. Mit der rechten Maustaste auf die Scan-Gruppe, und löschen Sie ihn. Auf der Zeitleiste mit der rechten Maustaste und wählen Sie Set ausgewählt Scan-Intervall und fügen Sie Scans alle 1,5 h und für eine Gesamtmenge von 24 h.
    2. Legen Sie die gewünschte Startzeit (mindestens 1 h nach der Inkubation in der automatisierten bildgebende Apparatur). Wählen Sie Speichern Scans Zeitplan.

4. automatische Bildanalyse

1. Melden Sie sich bei Erwerb, wählen Sie die Option " Ansicht den letzten Scans " und wählen Sie Starten Analyseoption. Wählen Sie erstellen neue Analysedefinition | Berechnungsart: Sphäroid. Kreuzen Sie die Bild-Kanäle (Phase + Hellfeld, grün und rot) zu analysieren.
2. Wählen Sie mindestens 10 repräsentative Bilder: in der Regel 1 pro Zustand und mindestens 3 Zeitpunkten (Anfang, Mitte und Ende des Erwerbs).
3. Vorschau der Standardwert analysieren Verfahren auf dem ganzen Bildstapel.
4. Ändern Sie die Parameter für Hellfeld-Maske. Typische Kennwerte sind: Empfindlichkeit 10, Bohrung Füllung 1.000 µm², min. Bereich 1.000 µm². Vorschau auf das ganze Bildstapel und überprüfen Sie, ob die ausgewählten Parameter der Sphäroide genau zu erfassen.
5. Ändern Sie die Parameter für grüne Maske (GFP). Typische Kennwerte sind: Segmentierung der Zylinder mit Radius 200 µm und Schwelle 3 AVV, Rand abgespalten, Loch zu stopfen, 5.000 µm², Adjust-2 Pixel, Bereich min. 3.000 µm². Vorschau auf das ganze Bildstapel und überprüfen Sie, ob die ausgewählten Parameter der Sphäroide genau zu erfassen.
6. Ändern Sie die Parameter für die rote Maske (Annexin V). Typische Kennwerte sind: Segmentierung der Zylinder mit Radius 150 µm und Schwelle 2 AVV, Rand abgespalten, Loch zu stopfen, 5.000 µm², passen Sie Größe 0 Pixel, Bereich min. 1.000 µm². Vorschau auf das ganze Bildstapel und überprüfen Sie, ob die ausgewählten Parameter der Sphäroide genau zu erfassen.
7. Starten Sie den Analyzer.
   1. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, extrahieren Sie die Messung von Interesse. Wählen Sie die analysierten Datei und dann die Option Grafik Metriken . Wählen Sie die Metrik der Zinsen, der Scan und Brunnen. In der Regel rot und grün Gesamtintensität im Hellfeld Grenzen geben die genauesten Messungen durch die Beschränkung des Signals der Fluoreszenz der Sphäroide Grenzen bestimmt durch die Hellfeld-Maske (Abbildung 3). Ausgewählte Kennzahlen in mehreren Datei-Format durch Klicken auf "Daten exportieren" zu extrahieren.
8. Fahren Sie mit der Extraktion von Bildern und Filmen durch die Auswahl der analysierten Datei und wählen Sie dann die Option exportieren Sie Bilder und Filme . Zwei Optionen stehen zur Verfügung, entweder "als"abrufen Bilder und Filme als angezeigt auf der imaging-Software (in der Regel zusammengesetzte Bilder), entweder "gespeichert" zum Abrufen von raw-Daten für externe Analysen durch dritte Teil Software gesehen.

Ergebnisse

Wie in Abbildung 1ersichtlich ist, ist es durch Durchflusszytometrie Ausdruck von CD19 Auto auf T-Zellen (Abbildung 1A) und das Niveau der CD19 auf Tumorzelllinien HCT116 (Abbildung 1 b) zu überprüfen, das entscheidend. Abbildung 2 veranschaulicht das Ergebnis einer typischen Sphäroid-Experiments. Das automatisierte bildgebenden Gerät nimmt Bilder in vier verschieden...

Diskussion

Die Verwendung von Sphäroide als ein innovatives Tool, um zukünftige Krebsbehandlung zu überprüfen ist ein Feld des wachsenden Interesses in den letzten Jahren geworden. Sphäroide stellen eine Zwischenstufe zwischen klassischen 2D in-vitro-Analyse und in-vivo Bewertung dar. Die Methode weiter hält eine Menge Versprechen bezüglich ihrer Wirksamkeit in Bezug auf Tumor imitiert Mikro-Umgebung sowie Profilierung⁷gen. Das Protokoll in dieser Publikation vorgestellt wurde von Saheen Et A...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	-
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 mL tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	-
Incucyte S3	Essen Bioscience