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Method Article
Dieses Protokoll dient zur Immuntherapie umgeleiteten T-Zellen (Auto T-Zelle) Zytotoxizität gegen 3D strukturierte Krebszellen (Sphäroide) in Echtzeit zu bewerten.
Immuntherapie hat ein wachsendes Interesse an den Kampf gegen den Krebs sonst unbehandelbaren entwickelt. Unter allen immuntherapeutischen Methoden umgeleitet chimeric Antigen-Rezeptor (Auto) T-Zellen die spektakulärsten Ergebnisse, insbesondere mit pädiatrischen B-akute lymphoblastische Leukämie (B-ALL). Klassische Validierungsmethoden Auto T-Zellen verlassen sich auf die Verwendung von Spezifität und Funktionalität Assays der Auto-T-Zellen gegen die Ziel-Zellen in Suspension und Xenograft-Modelle. Leider, in-vitro-Beobachtungen sind oft Ergebnisse in Vivo entkoppelt und einiges an Aufwand und Tiere könnte erspart werden, indem man einen weiteren Schritt: die Verwendung von 3D Culture. Die Produktion der Sphäroide aus potenziellen Zielzellen, die 3D-Struktur der Tumorzellen zu imitieren, wenn sie in das Tiermodell aufgeprägt sind stellt eine ideale Alternative dar. Hier berichten wir über eine erschwingliche, zuverlässige und einfache Methode, um Sphäroide aus einem ausgestrahlt kolorektalen Zelllinie als ein Validierungstool für Adoptiv-Therapie (hier am Beispiel CD19 Auto T-Zellen) produzieren. Diese Methode ist gekoppelt mit eine erweiterte live-imaging-System, das Sphäroid Wachstum verfolgen kann, Effektor Zellen Zytotoxizität und Tumor Zellapoptose.
Adoptiveltern Zelltransfer (ACT) repräsentiert die nächste Generation-Krebs-Behandlung. Es stützt sich auf die Injektion von Effektorzellen (T - und NK-Zellen) in einem Patienten. Diese Zellen können genetisch mit einem Rezeptor geändert werden, die zu ihrem Ziel, den Tumor zu führen und zu zerstören. Vor kurzem wurde dieser Ansatz gezeigt, möglich sein, wenn ein gegen den B-Zell-Marker CD19 Chimeric Antigen Rezeptor (Auto) in die Patienten T-Zellen zu töten, seine/ihre Krebs-1eingeführt wurde. Bei Auto, welches eine künstliche Rezeptor, das Design besteht aus spezifischen Antikörperfragmente der Antigen-bindende Domäne auf eine Entität benannten einzelne Kette Variable Fragment (ScFv), reduziert auf die T-Zelle Signalisierung Domänen verknüpft. Zwar gibt es mehrere Entwürfe, die am häufigsten verwendeten Versionen bezeichnet als zweite Generation Auto-Designs, der CD3z für die TCR Signalisierung und einer co-stimulatory Domäne bestehen (CD28, 4-1BB, OX40, etc..) 1 , 2. Feld Immuntherapie geleitet die meisten ihre Aufmerksamkeit auf diese neue Form des Gesetzes, wenn CD19 CAR-T-Zellen wirksam zahlreiche Patienten mit B-Zell-Tumoren3,4 behandelt. Nach diesem Erfolg versuchten Forscher ähnliche Entwürfe zu nutzen, indem Sie auf andere Epitope bei soliden Tumoren mit begrenztem Erfolg. Der Mangel an spezifischen Tumorantigenen und den härteren Tumor Mikroumgebungen gerendert CAR T Zellen leider weniger effektiv gegen solide Tumore5.
Setzen derzeit, die am häufigsten verwendeten in Vitro Validierungsstrategien auf zweidimensionale (2D) Systeme, die nur ein Fragment der bereits genannten soliden Tumoren Herausforderungen anzugehen. Klassisch, beinhalten 2D in-vitro- Systeme eine Mischung aus Auto-T-Zellen und Ziel Krebszelllinien als Monolagen zur Beurteilung der Funktionalität und Spezifität dieser Effektor-Zellen. Obwohl diese Strategien wichtige und entscheidende Teile des Studiums sind, sie nicht die komplexe Morphologie und dreidimensionale (3D) Struktur der Krebs Zellen6berücksichtigen. Krebszellen in 3D Systeme, genannt Sphäroide, kultiviert erwerben neue phänotypische Merkmale durch Veränderungen im gen Ausdruck Profil7, in dem die Anerkennung durch die umgeleiteten Effektorzellen beeinflussen könnten. Birgersdotter und Kollegen gezeigt, dass eine Hodgkin Lymphom (HL) Zell-Linie, wenn nur in einem 3D Culture Modell gewachsen ein Genexpressionsprofil erwirbt, die primären Tumor Proben8ähnlich ist. Daher culture Sphäroide oder ähnliche 3D Methoden Angebot relevanter in Vitro Modellen im Gegensatz zu standard-2D-Systeme. Solche Systeme sind auch ähnlich wie in vivo-Studien, die als der letzte Schritt im Prozess Validierung eines bestimmten Autos gesehen werden. Wenn man bedenkt, dass 2D Systeme versagen, die Morphologie des Krebs-Cluster zu imitieren, Sphäroide bieten ähnliche Formationen zur Beurteilung der Funktionalität des CAR-T-Zellen vor dem in-vivo-Modelle. In einer Studie, Pickl Et Al. festgestellt, dass ein Sphäroid Modell des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (HER2) Krebszellen überexprimiert ähnliche Signalisierung Profile zur in-vivo Modelle9demonstriert. Dies unterstützt weiter die Sphäroide relevant und Nähe zu in Vivo Beurteilung der Auto-T-Zellen bieten. Darüber hinaus Auto T-Zell-Validierung gegen Sphäroide könnte helfen, ihre Wirksamkeit mehr kritisch zu beurteilen und verhindern, dass einige der Designs bewegt, in vivo Studien vorzeitig10; so, zur ethisch betreffenden Forschung durch weniger Tiere zu opfern. Darüber hinaus sind Protokolle mit Sphäroide nicht teurer als klassische 2D Systeme und viel schneller im Vergleich zu klassischen in Vivo Studien. Zusammen genommen, kann man voraussagen, dass die Einbeziehung der Sphäroid Studien gängige Praxis bald, in vitro und in vivo Studien zu verknüpfen.
Hier präsentieren wir Ihnen die Vorbereitung der Sphäroide aus der Dickdarm-Krebs-Zell-Linie HCT-116. Diese Zelllinie wurde geändert, um das menschliche CD19-Molekül empfindlich gegen CD19 Auto T-Zellen zu rendern und eine klare Einschätzung der Tötung mit einer klinisch validierte Auto-Konstrukt zum Ausdruck bringen.
1. Generation der Sphäroide von Colorectal Krebs-Zell-Linie
2. Generation von CD19 Auto T-Zellen
3. 3D Tumor Sphäroid Tötung Assay
4. automatische Bildanalyse
Wie in Abbildung 1ersichtlich ist, ist es durch Durchflusszytometrie Ausdruck von CD19 Auto auf T-Zellen (Abbildung 1A) und das Niveau der CD19 auf Tumorzelllinien HCT116 (Abbildung 1 b) zu überprüfen, das entscheidend. Abbildung 2 veranschaulicht das Ergebnis einer typischen Sphäroid-Experiments. Das automatisierte bildgebenden Gerät nimmt Bilder in vier verschieden...
Die Verwendung von Sphäroide als ein innovatives Tool, um zukünftige Krebsbehandlung zu überprüfen ist ein Feld des wachsenden Interesses in den letzten Jahren geworden. Sphäroide stellen eine Zwischenstufe zwischen klassischen 2D in-vitro-Analyse und in-vivo Bewertung dar. Die Methode weiter hält eine Menge Versprechen bezüglich ihrer Wirksamkeit in Bezug auf Tumor imitiert Mikro-Umgebung sowie Profilierung7gen. Das Protokoll in dieser Publikation vorgestellt wurde von Saheen Et A...
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Diese Arbeit wurde von der Norwegischen Forschungsrat unter Stipendien #244388, #254817 und #284983 unterstützt; der norwegische Krebsgesellschaft (#6829007); Der norwegische Gesundheitsregion Süd-Ost unter Grant #17/00264-6 und #2016006.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | - |
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
15 mL tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | - |
Incucyte S3 | Essen Bioscience |
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