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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um tragbare zellulären Aerosol Belichtungen durchführen und zelluläre Reaktion zu messen. Die Methode verwendet Zellen, an der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle, imitiert in Vivo Physiologie gewachsen. Zelluläre Reaktion auf Kupfer Nanopartikel Aerosole wurde als oxidativer Stress durch reaktiven Sauerstoff-Spezies-Generation und Zytotoxizität als Laktat-Dehydrogenase Freisetzung beobachtet.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein neues in-vitro- Belichtung System, getragen wird, einschließlich seiner Charakterisierung und Leistung. Air-Liquid-Schnittstelle (ALI) in-vitro- Belichtung Systeme sind oft groß und sperrig, Transport zum Feld und Betrieb an der Quelle der Emission oder innerhalb der Atemzone erschwert. Durch Miniaturisierung dieser Systeme kann im Labor gebracht werden, zum Feld, Beschleunigung Verarbeitungszeit und Bereitstellung einer angebrachter Belichtungsmethode, die nicht das Aerosol vor der Kontaktaufnahme mit den Zellen verändert wird. Die Portable In-vitro- Exposition Kassette (PIVEC) passt eine 37-mm-Filterkassette für in-vitro- Toxizitätstests außerhalb der traditionellen Labor ermöglichen. Die PIVEC war geprägt mit drei Größen der Kupfernanopartikel Ablagerung Effizienz basierend auf gravimetrische bestimmen und Partikelanalyse Nummer Konzentration. Anfängliche Zytotoxizität Experimente wurden mit exponierten Lungenzellen zu bestimmen, die Fähigkeit des Systems, Partikel zu hinterlegen, unter Beibehaltung der Zellviabilität durchgeführt. Die PIVEC bietet eine ähnliche oder höhere Ablagerung Effizienz im Vergleich zur verfügbaren senkrecht fließen in-vitro- Belichtungsgeräte. Trotz der geringeren Probendurchsatz verleiht der Kleinheit einige Vorteile der aktuellen in-vitro- ALI Belichtung Systeme. Dazu gehören die Fähigkeit, persönliche Überwachung getragen werden, Mobilität aus dem Labor, um die Quelle der Emissionen und die Option zum Einrichten mehrerer Systeme für räumliche Auflösung und gleichzeitig einen niedrigeren Benutzer Kosten. Die PIVEC ist ein System, das Sammeln von Aerosolen im Feld und in die Atemzone auf einem Luft-Schnittstelle, in-vitro- Modell.

Einleitung

Persönlichen Probenahme mittels in-vitro- Techniken könnten umfassende Informationen über die biologischen Wirkungen der Aerosole am Arbeitsplatz. 1 Forderungen an Verunreinigungen in der Luft enthalten Forderungen gegenüber dem chemischen Stoff selbst, um die gesammelten Luftproben getauchten Bedingungen wo das Gas die Zellsuspension intermittierende Exposition mit einem Gerät wie ein Rocker oder direkte eingeführt ist Forderungen an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit (ALI). 2 viele dieser Techniken erfolgt mit Zellen in Suspension oder die Entnahme von Proben vor der Belichtung, von die jede die toxikologische Studie aufgrund von möglichen Änderungen in das Aerosol beeinflussen kann. 3 um diese Änderungen zu vermeiden, kann das Labor zum Feld mit mehreren in-vitro- ALI Kultur Belichtung Systeme gebracht werden, die in der Literatur,4,5,6,7verwendet werden, 8,9,10,11,12,13 aber nur wenige sind im Handel erhältlich. 8 , 9 , 12 dieser Systeme sind oft sperrig, vor allem wenn Sie Instrumente zur Regulierung der Temperatur und Luftfeuchtigkeit von der zellulären Umgebung und der Durchflussmenge des Aerosols Probe. Mithilfe der PIVEC können Aerosol Belichtungen außerhalb einer traditionellen Testumgebung oder innerhalb der Atemzone durchgeführt werden, während der Inhalation Bedingungen imitiert.

Die Bestimmung des Aerosol Deposition in Vitro ist wichtig, die Untersuchung der Auswirkungen auf die Gesundheit durch Inhalation. Der Atemzone ist der Bereich innerhalb 30 cm vom Mund und Nase,14 entscheidend für das Verständnis der Exposition mit Nanopartikeln und für die Anbindung an die biologischen Effekte in der Lunge. 2 oft die Ablagerung auf Zellen einen Wirkungsgrad von Ablagerung, die Partikel abgeschieden auf und von den Zellen geteilt durch die Partikel in die System-6,-15 oder Masse anhand der gleichen Mengen verabreicht aufgenommen bezeichnet. 4 , 16 die aktuellen Methoden zur Messung von Aerosolen in die Atemzone sind Filter basieren, Erfassung von Teilchen innerhalb einer bestimmten Abtastzeitabschnitts und Filter verwenden, um weitere Tests durchzuführen. 17 persönliche Überwachung erfordert ein kleines System, das mit dem Kompromiss von weniger Proben kommt.

Es gibt viele Ansätze, die die gesundheitlichen Auswirkungen von Aussetzung zu ein Aerosol zu bestimmen. Das ALI-Modell ermöglicht das Aerosol direkt auf die Zellen durch die Luft wie ein echter Expositionsszenario verabreicht werden aber es ist kostengünstiger und weniger zeitintensiv als in Vivo Studien während imitiert die Luft-Flüssigkeit Barrieren wie die Augen, Haut und Lunge. Gewachsen auf der ALI Lungenzellen haben die Fähigkeit, erzeugen eine polarisierte Sperrschicht,18,19 die physiologischen Eigenschaften, die das in Vivo Lunge Epithel produziert, einschließlich Schleim und Tensid Produktion in bestimmten ähneln bronchiale oder alveoläre Zelllinien, Zilien schlagen,19 tight Junctions,19,20 und Zelle Polarisation. 18 Änderungen wie diese die zelluläre Reaktion gemessen in Toxizitätsstudien beeinflussen können. 21 darüber hinaus ergibt sich ALI in-vitro- Modell sind oft empfindlicher als Zellen über Aussetzung Modelle22 verfügbar gemacht und sind in der Lage zum Modell akuten in Vivo Inhalation Toxizität. 23 , 24 daher ist ein ALI Belichtungssystem, die Durchführung von Messungen innerhalb der Atemzone kann ein logischer nächster Schritt.

Indem man die Zellen Aerosol direkt an der Quelle der Emission, tritt Untersuchung der Auswirkungen aller Gase, semi-flüchtige Verbindungen und Partikel in die Mischung beteiligt. Wenn die Mischung auf einem Filter gesammelt, die Gase und flüchtige Verbindungen werden nicht erfasst und die ganze Mischung kann nicht untersucht werden. Darüber hinaus kann die Rekonstitution der Partikel in ein Pulver oder eine flüssige Suspension zu Aggregation oder Partikel-Fluid Interaktionen, wie Auflösung, in der liquid Suspension führen. 25 , 26 wenn Aerosol-Partikel in der Flüssigkeit hinzugefügt werden, gibt es ein höheres Potenzial für die Agglomeration,25,27 Bildung eines Proteins Corona,28 oder Interaktion mit Verbindungen in die Flüssigkeit, die Ablagerung beeinflussen können und beeinflussen Sie die biologische Reaktion. 29 , 30

Exposition in der ALI basiert auf drei wesentlichen Aerosol Profile, Wolke Beilegung, parallel Fluss und senkrecht Fluss. Cloud, Abrechnung, verwendet durch Air-Liquid Interface Zelle Exposition (ALICE),4 ist ein Batchsystem einzahlen wo Partikel durch Schwerkraft und Diffusionsprozess absetzen, da das Aerosol als eine Einheit behandelt wird. Parallele Strömung, verwendet durch die elektrostatische Aerosol in-vitro- Belichtung System (Traufe)5 und Multikultur Exposition Kammer (MEC) II,6 ermöglicht die Abscheidung durch die Zugabe von Brownsche Bewegung durch das Strömungsprofil. Senkrecht-Flow, verwendet durch eine Mikrosprayer,7 Nano Nebelkammer für In-vitro-Toxizität (NACIVT),11 und kommerziellen ALI Systeme8,9,10,12, fügt die Impaktion von Partikel in der Ablagerung-Region. Viele dieser Belichtung Systeme sind groß und sperrig, dass überschüssige Systeme für Aerosol Vorklimatisierung, Pumpen für die Strömung, oder sogar Heizung Kammern für die Inkubation der Zellen. Dieser große Größe verringert die Portabilität des Systems. Anstelle von Probenahme direkt an der Quelle der Emission haben diese Systeme oft Proben ins Labor oder Modell Aerosole erzeugt für die Analyse. Die Komplexität des emittierten Aerosols kann in der Übersetzung aus dem Bereich ins Labor verloren. Die PIVEC ist kleiner als die aktuelle Systeme mit einer Außenfläche von ca. 460 cm2 und wiegt nur 60 Gramm, mit thermischen und Feuchtigkeitskontrolle in das System ermöglicht ein sehr portables Gerät integriert. Die geringere Größe und Gewicht lassen das System getroffen, um die Quelle der Exposition, direkte Probenahme bei schönem oder getragen werden.

Die Größe der aktuellen Belichtung Systeme verringert auch die Fähigkeit, Probenahme zur Untersuchung der räumlichen Gradienten in Konzentrationen führen. Diese Auflösung ist Schlüssel bei der Bestimmung von toxikologischer Wirkungen vieler Potenzial Umwelt-und betriebliche Unfallgefährdungen wie Feinstaub Angelegenheit oder am Arbeitsplatz Tätigkeiten Fahrzeugverkehr Auspuff bei Aerosolization auftritt. Sofort nach Emission, dort wird eine räumliche Abweichung in Partikelkonzentration. Dies wächst mit der Zeit wie die Partikel in der Atmosphäre zu verteilen und diese Effekte können je nach den Umgebungsbedingungen wie Temperatur, Druck, Wind und Sonne. Partikel können beginnen zu altern und oxidieren auch einmal abgegebene31,32 und Zerstreuung Preise von der Topographie betroffen sind; höhere Konzentrationen finden Sie in den Schluchten und Tunnel, wo Dispersionseffekte werden verlangsamt, und niedrigere Konzentrationen finden wo gibt es eine große Fläche für Dispersion. 33 diese Steuersatzänderungen Streuung können erhebliche Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit haben und können gesehen werden, wenn die Zahl der Asthmatiker Erwachsenen Leben in städtischen und in ländlichen Gebieten zu vergleichen. 34 während viele Belichtung Systeme mehrere Proben gleichzeitig zur Verfügung stellen, sind mehrere Systeme erforderlich mit einer Fülle von Großgeräten räumlichen Auflösung durchführen.

Indem das Labor auf das Feld, kann die Zeit der Analyse mithilfe der ganzen Zelle als Sensor verringert werden. Nach bekannten biologischen Mechanismen und Endpunkte kann bei der Ermittlung der Aerosol-Zusammensetzung und Größe helfen. Aufgrund der langsamen Clearance-Methoden, einschließlich Mucociliary Clearance, Phagozytose und Translokation sind diese Partikel oft Interaktion mit Zellen ca. Tage bis Wochen3 Erzeugung von oxidativen Stress, Entzündungen und sogar Zelltod. Diese biologische Endpunkte können Ausgangspunkte für negativen Ausgang Wege zur kardiovaskulären Erkrankungen oder chronisch obstruktiver Lungenerkrankung sein. Wiemenn Et Al. durchgeführt darüber hinaus eine Reihe von in-vitro- Tests mit Literatur Werte für kurzfristige in Vivo Inhalation Toxizität zu vergleichen. 35 In Vivo Antwort wurde mit zwei der vier positive Ergebnisse aus Tests Zytotoxizität über Laktat-Dehydrogenase Release, oxidativen Stress von Glutathion Reduktion und Wasserstoffperoxid Bildung und Freisetzung und Entzündung von potenziellen vorhergesagt. Das Tumor-Nekrose-Faktor alpha gen. Aus zehn Schichtmaterialien Metalloxide getestet, sechs getestet als aktiv (Titandioxid, Zinkoxid und vier verschiedenen Cerium-Oxid) mit Aufnahmen in Vitro mit Bestätigung in Vivo. 

Zur Untersuchung der Auswirkungen von Aerosolen in einem beruflichen Umfeld entwickelt unser Labor PIVEC für Aufnahmen im Bereich. Darüber hinaus die PIVEC kann für persönliche Probenahme zu überwachen und untersuchen Inhalationsexposition wie die 37-mm-Filter Kassette36 getragen werden oder mehrere Systeme können verwendet werden, um räumliche Auflösung in einem bestimmten Gebiet zu erreichen. In diesem Protokoll wird die Charakterisierung und Einsatz von der PIVEC diskutiert. Nach der Belichtung werden die biologischen Effekte durch Zytotoxizität Assays beobachtet.

Protokoll

Betreiber tragen persönlichen Schutzausrüstung (z.B. Kittel, Handschuhe, Schutzbrille) beim Ausführen der Schritte 1, 2, 3, 5 und 6.

1. Vorbereitung der Materialien

  1. Bereiten Sie Materialien für System-Montage und Belichtung Wiederholbarkeit zu gewährleisten.
    1. Stellen Sie sicher, Einsatz neuer oder 70 % igem Ethanol gereinigt ¼" Innendurchmesser leitfähigen Schlauch und ¼" Außendurchmesser Anschlüsse für den Systemaufbau.
    2. Shop Testmaterialien inklusive Filter, PIVEC Komponenten, Pinzette und Partikel-Pulver in einer kontrollierten Umgebung in Bezug auf Temperatur und Feuchtigkeit für mindestens 24 h vor dem Experiment.
      Hinweis: Die Temperatur sollte bei Raumtemperatur ca. 20 ° C, mit weniger als 35 % Relative Luftfeuchtigkeit. Dies ist sehr wichtig, Wiederholbarkeit von Experimenten zu erreichen.
    3. Bereiten Sie Partikelzähler mit Isopropanol Teile reinigen und ermöglichen dem System Warm-up entsprechend den Empfehlungen des Herstellers, einschließlich der scanning Mobility Particle Sizer (SMPS) und optische Particle Sizer (OPS) für die Messung vor.

2. Generation von trockenem Aerosol

Hinweis: Operatoren sollten in einer Dampfhaube Aerosolerzeugung führen.

  1. Montage eines Systems zur trockene Aerosole generieren
    Hinweis: Die Aussetzung der Partikel im Gas oder Flüssigkeit sollte für die modellierten Anwendung und Zelle Kultur geeignet. Die folgende Methode kann mit einer Flüssigkeit-basierte Aerosol durchgeführt werden. Das Design der das trockene Aerosol-System stammt von Tiwari Et Al. 37 eine schematische Darstellung des trockenen Zerstreuung-System ist in Abbildung 1dargestellt.
    1. Schließen Sie das Kugelventil an beiden Enden des Rohres 4" 1/8 Gewinde Größe, dies wird als die Partikel Trichter dienen. 2" 1/8 Größe Leitung an einem Ventil anschließen.
    2. Kupfernanopartikel wiegen, in dieser Studie die Massenkonzentration für jede Partikelgröße war konstant gehalten während der Bestimmung der Effizienz der Ablagerung. Verwenden Sie ca. 7,5 mg 40 nm Kupfer Nanopartikel, 7 mg von 100 nm Kupfer-Nanopartikeln und 13 mg 800 nm Kupfer Nanopartikel pro Exposition. Legen Sie Kupfernanopartikel in den Trichter der Partikel durch das offene Ende.
      Hinweis: Die Höhe der Kupfernanopartikel wog dienen als die Masse verabreichte Konzentration basiert.
    3. Legen Sie eine 3" Stück Außendurchmesser (OD) Schlauch ½" rund um die 2" Rohr und Ort ein HEPA filter innerhalb dieser kurzen Schlauch so, dass die Durchflussrichtung durch den Kugelhahn.
    4. Verbinden Sie den Vakuum-Erzeuger mit anderen Kugelhahn mit Gewinde. Verbinden Sie Vakuum-Erzeuger mit Lufttank indem man ein OD Schlauch 5/16" in der Push-Lock-Anschluss. Verwenden Sie ¼" OD Schläuche zum Austritt des Vakuum-Erzeuger der Versuchsaufbau herstellen, indem man den Schlauch über den Ausgang der Vakuum-Erzeuger.
  2. Verwendung von trockenem Aerosol System, trockene Aerosol zu generieren
    1. Öffnen Sie den Lufttank durch Drehen des Hauptventils und ermöglichen Sie den Luftstrom um das System zu. Öffnen Sie das Ventil an den Durchflussregler auf den Lufttank und so eingestellt, dass der Durchfluss durch das System die gewünschten Einstellungen auf die Vakuumpumpe entspricht.
    2. Öffnen Sie das Kugelventil, HEPA-Filter am nächsten, dann öffnen Sie das Kugelventil, Vakuum-Erzeuger am nächsten. Bewahren Sie diese für ca. 3 s, um Partikel in den Luftstrom gezogen werden können.
    3. Schließen Sie das Kugelventil, Vakuum-Generator dann Kugelhahn am nächsten an HEPA-Filter schließen am nächsten. Lassen Sie Luft aus dem Tank für die Dauer des Experiments nach Bedarf fließen.
    4. Schließen Sie Haupt- und Regler Ventile Lufttank zu unterbrechen. Saubere Kugelhähne und Vakuum-Erzeuger mit 70 % Ethanol. Metallrohre Autoklav für die Sterilisation.

3. Abscheidung Effizienz-Messung mit PIVEC

Hinweis: Operatoren sollten in einer Dampfhaube Aerosol-Exposition führen.

  1. Die Abscheidung durch das Sammeln der Kupfer Nanopartikel Aerosols erzeugt im Schritt 2.2 auf einem vorgewogene Filter zu messen. Verwenden Sie die hinterlegten Dosis, anhand der gesammelten Mass auf dem Filter und der verabreichten Dosis, gemessen mit dem gewogenen Kupfer-Partikel, die Ablagerung Effizienz zu bestimmen.
    1. Behalten Sie 1,00 µm Pore Glasfaser Filter Bedingungen niedriger Luftfeuchtigkeit, beschrieben in 1.1.2 für mindestens 24 h vor Vorbelichtung Messungen bei. Weigh einen unbenutzten Filter dreimal und nimmt die Filter-Gewichte. Fügen Sie ein Ort der nicht verwendeten Filter in einer Zellkultur.
    2. Wählen Sie die entsprechende Zelle Kultur einfügen Adapter (6 Brunnen oder 24 gut) für PIVEC, die Zelle Kultur einfügen mit dem Filter zu unterstützen. Ort der Zellkultur einfügen Adapterstück oben auf der Basis von PIVEC, rastet so einzustellen, dass die Basis des das Adapterstück breiter als oben ist.
    3. Verwendung einer Pinzette Filter geladen Zellkultur platzieren einfügen innerhalb Adapterstück. Legen Sie das obere Stück auf Adapterstück in Ort absetzen, so dass die Grundlage für den oberen Teil breiter als oben ist. Wickeln Sie PIVEC mit einer einzigen Schicht von Klebeband.
    4. Verbinden Sie 37 mm Kassette Stücke auf Ober- und Unterseite des PIVEC durch Drücken einrastet. Legen Sie Adapter ¼" Stacheldraht in Kassette Einlass und Auslass.
    5. Wickeln Sie die Ohmsche Heizung um PIVEC, derart, dass die Drähte an der Basis sind. Klebeband zu sichern.
    6. Wickeln Sie PIVEC mit ~ 8 runden Alu-Folie für Isolierung. Mit Klebeband sichern.
    7. Connect 2" langes Stück 1/2" Außendurchmesser Schlauch an den Adapter auf PIVEC. Entfernen Sie poröse Schläuche aus sterilem Wasser und Platz im Schlauch auf PIVEC.
    8. Ort PIVEC in Klammer auf dem Ring stehen und zu sichern. Komplette Einrichtung mit der Vakuumpumpe, Partikelzähler und Aerosol-Set-up.
      Hinweis: Die zahlenbasierte hinterlegte Dosis kann bestimmt werden, nur wenn Partikelzähler vor der PIVEC und nach PIVEC auf separaten läuft platziert werden.
    9. Setzen Sie Filter mit Schritt 2.2 Protokoll und gewünschte Belichtung Zeit und Strom Tarife, in dieser Studie wurde eine Belichtungszeit von 10 min bei 0,5 l/min verwendet. Das Set-up entnehmen Sie PIVEC. Nehmen Sie Zelle Kultur einfügen und platzieren Sie den exponierten Filter im Siebträger unter niedrigen Luftfeuchtigkeit mindestens 24 h vor der Messung.
    10. Reinigen Sie PIVEC mit 70 % Ethanol. Sterilisation mit UV-Licht für mindestens 30 min vor der nächste Versuch.
    11. Wiegen des exponierten Filters dreimal und notieren Sie die Filter-Gewichte. Exponierten Filter in einer beschrifteten Filterhalter für Lagerung einsetzen.

4. Berechnung der hinterlegten Dosis und Ablagerung Effizienz

Hinweis: Kenntnisse der Ablagerung ist wichtig für Aerosol-Verwaltung und Interpretation der zellulären Antwort.

  1. Ablagerung von Masse-basierten Messungen zu berechnen
    1. Berechnen Sie die abgeschiedene Masse auf Filter als die Differenz zwischen dem Vorbelichtung Durchschnittsgewicht und Post-Exposition Durchschnittsgewicht. Dieser Wert ist die Masse-basierte hinterlegten Dosis für das Experiment.
    2. Verwendung verwaltete Masse, m-Admin, und Masse-basierte Dosis bestimmt in 4.1.1, mDep, zur Berechnung des Masse-basierte Abscheidung Wirkungsgrad ηm, für das Experiment hinterlegt.
      figure-protocol-7880
    3. Mittelwerte aus 4.1.1 und 4.1.2 für mindestens 3 Versuche festzustellen, Abscheidung und Ablagerung Effizienz für PIVEC Partikelgröße.
  2. Ablagerung von zahlenbasierte Messungen zu berechnen
    1. Sicherstellen Sie, dass die Messungen mit Partikelzähler mit Zähler nach der PIVEC und bestimmen die Partikelkonzentration vor der PIVEC durchgeführt wurden. Die Partikelkonzentration im Laufe der Zeit für den Partikelzähler zu integrieren dann integrieren über Partikeldurchmesser zu bestimmen, die insgesamt gemessenen Partikel.
    2. Berechnen Sie die hinterlegten Partikelanzahl als Differenz zwischen den Partikeln verabreicht und der gemessenen Partikel Post-PIVEC. Dieser Wert ist die zahlenbasierte hinterlegten Dosis für das Experiment.
    3. Verwendung verwaltete Partikel, nAdmin, zahlenbasierte hinterlegt Dosis, nDep, Volumenstrom, V, und die Zeit t, um das zahlenbasierte Ablagerung Effizienz, ηn, für das Experiment zu berechnen.
      figure-protocol-8986
    4. Durchschnittliche Werte von 4.2.2 und 4.2.3 für mindestens 3 Versuche festzustellen, Abscheidung und Ablagerung Effizienz für PIVEC Partikelgröße.

(5) Aerosol-Exposition von Zellen

Hinweis: Für die Zelle wird Kultur an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit der Leser Blank Et al.bezeichnet. 38 Operatoren sollten Zelle Kultur einfügen (Schritte 5.1.2-5.1.4) innerhalb eines Biosafety Kabinett laden führen. Operatoren sollten in einer Dampfhaube Aerosol-Exposition führen.

  1. Zellkulturen an Air-Liquid-Schnittstelle
    1. Heben Sie A549 Zellen vom Kultur-Kolben durch Zugabe von Trypsin-EDTA, 3 mL für ein T75-Fläschchen oder 1 mL für ein T25-Fläschchen und 5 min bei 37 ° c inkubieren Fügen Sie 7 mL komplette Medien für ein T75-Fläschchen oder 4 mL komplette Medien für ein T25 Kolben, Kolben und spülen Kolben Wand mit Zellsuspension der wiederhergestellten Handynummer zu maximieren. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine sterile 15 mL konische Rohr dann Zentrifuge Zellen bei 800 X g für 3 min.
    2. Entfernen Sie die überstand mit Trypsin-EDTA und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL komplette Medien. Entfernen Sie 10 µL Zellsuspension und fügen Sie der Hemocytometer hinzu. Zählen von Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer, um die Konzentration und die Gesamtzahl der Zellen zu bestimmen.
    3. 0,5 mL der komplette Medien in jede Vertiefung innerhalb einer 24-well-Platte zu platzieren. Legen Sie ungenutzte Zelle Kultur Einsätze in Brunnen. Samen Zellkultur Einsätze an der apikalen Seite bei einer Zelle Dichte in der Nähe von 1 x 105 Zellen/cm2 für Zelltypen, die in der Nähe von Verdoppelung pro Tag wachsen. Samen A549 Zellen innerhalb eines 24 gut einfügen, einfügen Samenzellen in einer Dichte von 1 x 105 Zellen/cm2 durch Zugabe von 35.000 Zellen in der Zellkultur.
      Hinweis: Zellen mit einem langsameren Wachstum können in eine höhere Zelldichte ausgesät werden.
    4. Die apikale Seite der Zelle Kultur einfügen, um das Endvolumen erreicht (für 24 well-Platte Endvolumen 0,25 mL ist) fügen Sie komplette Medien hinzu.
    5. Kultur für 7 Tage im getauchten Bedingungen ersetzen Medien alle 1-2 Tage. Entfernen Sie nach 7 Tagen die apikale Medien und Kultur für mindestens 1 Tag im ALI Bedingungen, nur die basolateralen Medien ersetzen.
  2. PIVEC montieren
    1. Zellen, um die Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle für mindestens 24 h vor der Belichtung equilibrate zu ermöglichen.
    2. Wählen Sie die entsprechende Zelle Kultur einfügen Adapter für PIVEC, die Zelle Kultur einfügen mit dem Filter zu unterstützen. Zellkultur Ort einfügen Adapterstück auf PIVEC Basis, rastet so einzustellen, dass die Basis des das Adapterstück breiter als oben ist. Der Brunnen von der Basis der PIVEC 4 mL Zellkulturmedien hinzufügen.
    3. Verwendung einer Pinzette die Zellkultur zu platzieren einfügen innerhalb Adapterstück in Schritt 5.2.3 gelegt. Legen Sie oben auf Adapterstück in Ort absetzen, so dass die Grundlage für den oberen Teil breiter als oben ist. Wickeln Sie sorgfältig, PIVEC mit einer einzigen Schicht von Klebeband.
    4. Verbinden Sie 37 mm Kassette Stücke auf Ober- und Unterseite des PIVEC, durch Drücken einrastet. Legen Sie Adapter ¼" Stacheldraht in Kassette Einlass und Auslass.
    5. Wickeln Sie Ohmsche Heizung um PIVEC, so dass die Drähte an der Basis sind. Klebeband zu sichern.
    6. Wickeln Sie PIVEC mit ~ 8 runden Alu-Folie für Isolierung. Mit Klebeband sichern.
    7. Kurzes Stück 1/2" Außendurchmesser Schlauch an den Adapter an der Oberseite PIVEC anschließen. Entfernen Sie poröse Schläuche aus sterilem Wasser und Platz im Schlauch auf PIVEC.
    8. Ort PIVEC in Klammer auf dem Ring stehen und zu sichern. Füllen Sie das Set-up mit der Vakuumpumpe und Aerosol-Set-up.
  3. Setzen Sie Zellen in ALI mit der PIVEC
    1. Verwenden Sie Ablagerung Effizienz in Schritt2 ermittelt, um die Masse der Teilchen zu aerosolized werden zu berechnen. Wiegen Sie entsprechenden Masse und fügen Sie dem Aerosol-System richten Sie nach Schritt 2 in der Dunstabzugshaube.
    2. Expose Zellen, indem Sie die folgenden Schritt 2.2, in dieser Studie der biologischen Endpunkte die Zellen wurden ausgesetzt, etwa 3,5 mg Kupfer Nanopartikel mit einem Volumenstrom von 0,5 l/min und eine Expositionsdauer von 10 min.-Kontroll-Studien durchgeführt befeuchtete Luft zur Bestimmung der Einfluss der Luft allein. Das Set-up entnehmen Sie PIVEC. Nehmen Sie die Zelle Kultur einfügen, legen Sie in den sterilen well-Platte und zurück zur CO2 -Inkubator (37 ° C, 5 % CO2, 90 % RH).
    3. Aspirieren Sie Medien von PIVEC. Wenn Sie zusätzliche Experimente durchführen, gepuffert spülen unten PIVEC mit Phosphat Lösung dann wiederholen Sie Schritt 5.1 und 5.2.
    4. Reinigen Sie PIVEC mit 70 % Ethanol, wenn Sie fertig sind. Sterilisation mit UV-Licht für mindestens 30 min vor der nächste Versuch.
  4. Biologische Assay-Verfahren
    Hinweis: Assays durchgeführt in dieser Studie wurden oxidativen Stress-Generierung durch die RLKV-DA-Assay und Zytotoxizität durch Laktat-Dehydrogenase (LDH) Freigabe.
    1. Auflösen von 24,4 mg RLKV-DA in 50 mL Methanol, 1 mM RLKV-DA Lösung zu machen. Diese Lösung kann für bis zu 4 Monate bei-20 ° C aufbewahrt werden. Verdünnen Sie 1 mM RLKV-DA Lösung durch Mischen von 0,1 mL 1 mM RLKV-DA Lösung mit 9,9 mL HBSS zu 10 mL von 10 µM RLKV-DA.
    2. Zelle Nährmedien und waschen Zelle Kultur einfügen mit ca. 1 mL PBS zu entfernen. Fügen Sie 0,5 mL 10 µM RLKV-DA Lösung in jede Vertiefung, Einsätze, wenn Sie fertig sind zu ersetzen. Abdeckplatte mit Alufolie zu verhindern, dass Photoaktivierungen des Farbstoffs und 37° C Inkubator für 1 h wieder.
    3. Entfernen Sie Zellen aus dem Inkubator und aspirieren Sie die RLKV-DA Arbeitslösung aus den Brunnen. Brunnen 0,5 mL HBSS hinzu und ersetzen Sie Zelle Kultur Einsätze zu.
    4. Laden Sie die well-Platte in Platte Leser und Maßnahme Grundlinie Fluoreszenz mit Erregung/Emission Wellenlängen von 485/530 nm. Entfernen Sie aus Platte Leser und Last einfügen in PIVEC für die Belichtung.
    5. Zellen für gewünschte Expositionsdauer aussetzen. Entfernen Sie Einfügen von PIVEC und wieder zu well-Platte. 50 µL der basolateralen Flüssigkeit aus well-Platte und in Weiß 96-well-Platte zu entfernen. Messen Sie die Fluoreszenz des DCF mit Erregung/Emission Wellenlängen von 485/530 nm alle 30 min. nach Belichtung für 2 h.
    6. Basolateralen Flüssigkeit equilibrate auf Raumtemperatur für 20-30 min. hinzufügen 50 µL LDH-Assay-Lösung, gemischte folgende Hersteller-Protokoll, auf basolateralen Flüssigkeit aus well-Platte und lassen Sie für 10 Minuten reagieren hinzufügen 25 µL Stopplösung gut zu lassen. Lesen Fluoreszenz Resorufin Produkt mit Erregung/Emission Wellenlängen von 560/590 nm.
    7. Entfernen Sie zusätzliche basolateralen Flüssigkeit zu, und wiederholen Sie Schritt 5.4.6 bei 4 h und 24 h nach Exposition.

6 statistische Methoden

  1. Analyse der biologischen Test Daten
    1. ROS-Produktion als die Erhöhung der Intensität der Fluoreszenz der behandelten Zellen im Vergleich zu Baseline-Messungen zu melden. LDH-Aktivität als Erhöhung der Intensität der Fluoreszenz der behandelten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen zu melden.
    2. Führen Sie Einzelfaktor ANOVA zu statistischen Unterschiede zwischen Datensätzen zu bestimmen. Gegebenenfalls führen Sie Student t-Test bei einem Wert von Bedeutung von 0,05. Berichtsdaten Sie als Mittelwert ± Standardabweichung von mindestens drei Messungen.

Ergebnisse

Am Arbeitsplatz in-vitro- Toxikologie umfasst Erhaltung zelluläre Lebensfähigkeit während der Durchführung von Aerosol-Exposition. Das PIVEC-System ist in Abbildung 2, unter anderem die Temperatur und feuchte-Steuerung und abgenutzte PIVEC dargestellt. Die Temperatur wurde über eine batteriebetriebene Ohmsche Heizung gepflegt und das Aerosol befeuchtet mit erhöht natürliche Befeuchtung durch eine poröse, benetzte Rohr. In einer kontrollierten...

Diskussion

Filterkassetten bieten eine einfache, kostengünstige Methode des Sammelns Aerosole in die Atemzone; jedoch Aerosol Proben extrahiert vom Filter nicht repräsentieren das gesamte Aerosol (d.h. Gase, flüchtigen Stoffen und Partikeln) und daher die Bewertung der damit verbundenen biologischen Wirkungen zu begrenzen. Mit den ersten Entwurf der 37-mm-Filter-Kassette, die PIVEC soll Portabilität zu erhalten und die in Vivo Abscheidung von Partikeln aus Inhalation zu imitieren. Die PIVEC ist deutlich kleiner als die...

Offenlegungen

Die Zugehörigkeit der Autoren ist auf dem Deckblatt dargestellt. Die Autoren sind von Virginia Commonwealth University, finanziell unterstützt wo die Fertigstellung in Richmond, VA. Die Autoren haben die alleinige Verantwortung für das Schreiben und den Inhalt dieses Papiers. Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt gibt.

Danksagungen

Die Autoren möchten Boris Solomonov und der Virginia Commonwealth Innovation Machine Shop für Hilfe mit rapid Prototyping Gerät danken. Die Autoren möchten auch Danke Cristian Romero-Fuentes des Arbeitskreises Lewinski, Dr. Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov und die Virginia Commonwealth Nanomaterialien Kern Charakterisierung Anlage für ihre Hilfe mit Partikelcharakterisierung. Diese Arbeit wurde von Startup-Fonds Dr. Lewinski von der College of Engineering an der Virginia Commonwealth University zur Verfügung gestellten unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Scanning mobility particle sizer (SMPS)TSI, Inc.3910NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS)TSI, Inc.3330
Stainless Steel Pipe, 4" LongMcMaster-Carr4830K116Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever HandleMcMaster-Carr4112T12Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" LongMcMaster-Carr7753K121Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filterGE Healthcare09-744-12HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum GeneratorPISCO USAVCH10-018C
PIVECVCUFor design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectorsZefon International, Inc.459743
Porous tubingScientific Commodities, Inc.BB2062-1814AHydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insertFisherbrand35309524 well plate insert
Filter ForcepsFisherbrand09-753-50
Transfer PipetteThermoScientific13-711-27
Glass Fiber FiltersSKC225-7Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro BalanceA&DBM-22Housed in environmental chamber
37 mm filter cassetteSKC225-3250Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pumpSKC220-5000TCAirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper ParticlesU.S. Research Materials, Inc.US109040 nm
Copper ParticlesU.S. Research Materials, Inc.US1088100 nm
Copper ParticlesU.S. Research Materials, Inc.US1117M800 nm

Referenzen

  1. Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. , 1-9 (2018).
  2. Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A. Toxicity assessment of industrial chemicals and airborne contaminants: transition from in vivo to in vitro test methods: a review. Inhalation Toxicology. 17, 775-787 (2005).
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