Intrakardialer Side-Firing Light Katheter zur Überwachung des Zellstoffwechsels mit transmuraaler Absorptionsspektroskopie von perfundierten Säugetierherzen

Zusammenfassung

Hier führen wir eine Methode zur Verwendung eines optischen Intraventrikelkatheters in durchlässigen Herzen ein, um eine Absorptionsspektroskopie über die Herzwand durchzuführen. Die gewonnenen Daten liefern robuste Informationen über die Gewebesauerstoffspannung sowie substratiennutzung und Membranpotenzial gleichzeitig mit kardialen Leistungsmessungen in dieser allgegenwärtigen Zubereitung.

Zusammenfassung

Die Absorptionsspektroskopie des Herzmuskels ermöglicht eine zerstörungsfreie Beurteilung der zytosolischen und mitochondrialen Sauerstoffversorgung über Myoglobin bzw. Cytochrom-Absorption. Darüber hinaus können auch zahlreiche Aspekte des mitochondrialen Stoffwechselzustands wie Membranpotenzial und Substrateintritt geschätzt werden. Zur Durchführung der optischen Spektroskopie der Herzwandübertragung wird ein handelsüblicher seitlich feuernder Optischerkatheter in den linken Ventrikel des isolierten perfundierten Herzens als Lichtquelle gelegt. Licht, das durch die Herzwand geht, wird mit einer externen Optischen Faser gesammelt, um eine optische Spektroskopie des Herzens in nahezu Echtzeit durchzuführen. Der Übertragungsansatz vermeidet zahlreiche Oberflächenstreustörungen bei weit verbreiteten Reflexionsansätzen. Veränderungen der transmuraalen Absorptionsspektren wurden mithilfe einer Bibliothek von Chromophor-Referenzspektren dekonvolved, die quantitative Messungen aller bekannten Herzchromophore gleichzeitig bereitstellte. Dieser spektrale Dekonvolution-Ansatz eliminierte intrinsische Fehler, die sich aus der Verwendung gängiger Dual-Wellenlängen-Methoden ergeben können, die auf überlappende Absorptionsspektren angewendet werden, und lieferte eine quantitative Bewertung der Güte der Anpassung. Für die Datenerfassung und -analyse wurde ein benutzerdefiniertes Programm entwickelt, das es dem Prüfer ermöglichte, den Stoffwechselzustand der Vorbereitung während des Experiments zu überwachen. Diese relativ einfachen Ergänzungen des Standard-Herzperfusionssystems bieten einen einzigartigen Einblick in den Stoffwechselzustand der Herzwand zusätzlich zu herkömmlichen Maßen der Kontraktion, Perfusion und Substrat-/Sauerstoffextraktion.

Einleitung

Optische Absorptionsspektroskopie zur Überwachung intakter Organbiochemie ist aufgrund ihrer intrinsischen, zerstörungsfreien Natur ein weit verbreiteter Ansatz^{1,2,3,4,5, 6,7,8,9}. Die Myoglobin-Absorption sättigiert die durchschnittliche zytosolische Sauerstoffspannung^10,11,12. Mitochondriale Cytochrome liefern Informationen über den Substrateintritt auf der Ebene von Flavinen, das Membranpotenzial aus Cytochrom b_L:b_H¹³und die Sauerstoffzufuhr in die Mitochondrien in der Zelle aus Zytochromoxidase (COX ) Redox-Zustand¹⁴. Glancy et al. zeigten, dass die Aktivitäten der einzelnen Komplexe durch Messung des mitochondrialen Membranpotentials und der Stoffwechselrate¹⁵bestimmt werden können. Mit Hilfe der optischen Spektroskopie kann daher eine Fülle von Informationen erhalten werden, ohne dass exogene Sonden oder größere Modifikationen aktueller Untersuchungssysteme erforderlich sind. Ziel dieses Papiers ist es, eine robuste Methode zur Erfassung optischer Transmissionsspektren in herkömmlichen perfundierten Herzpräparaten zu präsentieren, wobei die einzige größere Modifikation die Durchführung von Studien in einer abgedunkelten Umgebung ist.

Die Reflexionsabsorptionsspektroskopie wurde erfolgreich zur optischen Spektroskopie des perfundierten Herzens^{3,6,16,17,18,19} sowie wie das Herz in vivo¹. Die Reflexionsspektroskopie besteht darin, Licht auf die Herzoberfläche einzustechen und das durch das Herz gestreute Licht sowie diffuses und glänzend reflektiertes Licht zu sammeln. Somit ist das gesammelte Licht in diesem Ansatz ein Verbund aus mehreren Streumechanismen sowie den Gewebechromophorabsorptionen von Interesse. Aufgrund der Bewegung und der komplexen Oberfläche des Herzens ist die Lichtreflexion von der Oberfläche des Herzens besonders problematisch, was die Tiefe der Penetration und die Menge des rein reflektierten Lichts verändert.

Die oben dargestellten Grenzen der Reflexionsabsorptionsspektroskopie wurden durch die Einführung eines optischen Katheters in die linke Ventrikelhöhle gelöst, der die Sammlung von durchsetzem Licht über die linke ventrikelfreie Wand²⁰ermöglicht. Die Vorteile der Transmissionsspektroskopie für diese Art von Studie wurden in frühinvasiven Studien von Tamura et al. in Bezug auf zytosolische Sauerstoffversorgung und Mitochondrien Redox Zustand unter einer Vielzahl von Bedingungen²¹. Diese ersten Studien verwendeten einen speziell gefertigten Katheter mit einer angetriebenen LED an der Spitze, die darauf ausgerichtet war, ein seitliches Feuermuster von weißem Licht durch das Myokard zu erzeugen. Der relativ große LED-Kippkatheter ist jedoch nur für den Einsatz an mittelgroßen Herzen (Kaninchen, Meerschweinchen, etc.) geeignet und erfordert eine kundenspezifische Fertigung. In der aktuellen Studie wird eine Methode zur Verwendung einer handelsüblichen 200-Mikron-Kern-Seitenfeuerungs-Glasfaser als Lichtleiter vorgestellt. Anstelle einer verdrahteten LED an der Spitze leitet der Katheter mit der 500-Mikro-Spitze Licht von einer externen Quelle um, was die Vielseitigkeit des Systems erhöht. Dieser Ansatz ermöglicht die Verwendung einer Vielzahl von externen Lichtquellen, einschließlich Lasern für Anwendungen wie die Raman-Streuspektroskopie. Um diese Daten zu quantifizieren, wird eine Online-Vollmultikomponenten-Spektralanalyse mit bekannten Referenzspektren zur Verbesserung der Genauigkeit der spektroskopischen Bestimmung von Herzchromophoren wie zuvor beschrieben^20,22dargestellt. Der Quellcode für diese Analyse wird von den Autoren auf Anfrage zur Verfügung gestellt. Mit diesem Ansatz können Informationen über die Herzbiochemie und die mitochondriale Funktion gleichzeitig mit den herkömmlichen kardialen Funktionsparametern mit geringen oder gar keinen Auswirkungen auf die Herzpräparation gewonnen werden. Da das Herz entscheidend von der mitochondrialen Funktion und der Sauerstoffzufuhr abhängig ist, wird diese technische Ergänzung des klassischen perfundierten Herzsystems die Interpretation und den Nutzen dieses wichtigen Modells der Herzleistung erheblich verbessern.

Protokoll

Alle Tierprotokolle wurden vom National Heart, Lung, and Blood Institute Animal Care and Use Committee genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Care and Welfare Act (7 USC 2142 Nr. 13) durchgeführt.

1. Isoliertes Perfused Heart System und Perfusate

HINWEIS: Diese Vorbereitung ist sehr ähnlich zu früheren Veröffentlichungen²³.

1. Machen Sie 4 Liter modifizierte Krebs-Henseleit perfusate bestehend aus (in mmol/L) 137.0 NaCl, 5.4 KCl, 1.8 CaCl₂, 0.5 MgCl₂, 1.0 Na₂HPO₄, 10.0 Glucose, 1.0 Laktat und 10.0 HEPES.
2. pH-Wert perfusate bis 7,4 bei 37 °C mit NaOH und HCl.
3. Filtern Sie die Perfusate durch eine 1 m Porenmembran.
4. Spülen Sie alle Rohre und Kammern des durchlässigen Herzsystems, indem Sie gereinigtes Wasser durch das System leiten und ableiten.
5. Übertragen Sie die Perfusate in den Tank und Sauerstoffat mit 100% O2 mit der Blase unter Beibehaltung der Temperatur bei 37 °C mit einem beheizten zirkulierenden Wasserbad.
6. Fügen Sie 2 von 12 'm Porenmembranfiltern hinzu und grundieren Sie das System mit dem Perfusate, während Sie im Langendorff-Modus umkreisen.
7. Befestigen Sie eine Schlauchklemme am Rohr direkt über der Aortenkanüle und stellen Sie die Schraube so ein, dass der Aortenstrom auf ca. 10 ml/min sinkt.

2. Kaninchen Herz Exzision und Perfusion

1. Herzexzision
   1. Anästhetisieren männliche neuseeländische weiße Kaninchen (ca. 3 kg) durch eine 1,5 ml intramuskuläre Injektion von Ketamin/Acepromazin-Mischung (10:1).
   2. Ca. 10–15 Minuten später 3% Isofluran mittels Inhalation für eine vollständige anästhetische Wirkung verabreichen.
   3. Bestätigen Sie die richtige Tiefe der Anästhesie durch Zehenkneifen und legen Sie dann eine Linie in die randale Ohrvene für die Verabreichung von nachfolgenden Medikamenten.
   4. 1.500 Einheiten (oder 1,5 ml 1.000 Einheiten/ml) von Heparin injizieren und 3 Minuten zirkulieren lassen.
   5. Überprüfen Sie die richtige Tiefe der Anästhesie und einschläfern Sie dann mit 6 mEq (oder 3 ml von 2 mEq/ml) KCl.
   6. Öffnen Sie schnell die Brust, lokalisieren Sie die Herzspitze und die Aorta. Entfernen Sie das Herz, indem Sie die Aorta so weit wie möglich vom Herzen schneiden und die Lungenvenen so nah wie möglich an der Lunge schneiden.
      HINWEIS: Die Entfernung der Lunge in diesem frühen Stadium unterscheidet sich von der vorherigen Veröffentlichung^23, hat jedoch keine Auswirkungen auf die Zubereitung.
   7. Legen Sie das Herz in einen kleinen Becher perfusate (gleiche perfusate wie Schritt 1.3) sitzen in einem Eimer Eis für den Transport von der Operation zu Perfusion.
2. Herz-Kanulation
   1. Die Aorta sicher anbinden und binden, um sicherzustellen, dass keine Blasen in die Aortenlinie aufgenommen werden.
   2. Initiieren Sie den Durchfluss bei 70 mmHg Perfusionsdruck, indem Sie die Schlauchklemme an der Aortenleitung entfernen und diesen Druck während der restlichen Operation und Gefäßkanonulation beibehalten.
   3. Trennen Sie die Lungenarterie von der Aorta und anderen Gefäßen und ligaten Sie die Venenhöhlen und Lungenvenen. Entfernen Sie das Fett und Bindegewebe noch vorhanden.
   4. Kanülieren Sie die Lungenarterie, um ein Maß für die koronare Sinusdurchflussrate und Sauerstoffspannung zu liefern.
   5. Entsorgen Sie den anfänglichen Fluss aus dem Herzen (für ca. 10 Minuten) während der Vorbereitung, um Blut und chirurgische Nusphysen zu beseitigen. Nach dieser Zeit, rezirkulieren Sie die Perfusate.

3. Side-Firing Fiber Optic Platzierung

1. Schließen Sie den Glasfaserkatheter an eine hochleistungsgebundene, glasfasergekoppelte LED-Weißlichtquelle an, um die Visualisierung zu unterstützen und das Licht für die Spektroskopie einmal im Herzen bereitzustellen.
2. Schneiden Sie ein kleines Anhängseln des linken Atriums, legen Sie den Katheter über die Mitralklappe in den linken Ventrikel ein, und drehen Sie ihn dann, um eine beleuchtete linke ventrikelfreie Wand zu erreichen.
3. Positionieren Sie die Pickup-Glasfaser direkt gegenüber dem Bereich der maximalen Ausleuchtung des linken Ventrikels ca. 1 cm vom Herzen entfernt.
4. Schließen Sie das andere Ende der Pickup-Faser an ein schnelles Scanspektrometer an.

4. Optische Spektroskopie

1. Schalten Sie die Lichter im Versuchsbereich aus, um vollständige Dunkelheit zu erhalten.
2. Starten Sie das benutzerdefinierte Programm, indem Sie Spektrometertreiber einbinden, um Datenerfassung und Echtzeitanalyse des übertragenen Lichts durchzuführen.
   HINWEIS: Eine ausführbare Version der konsolidierten Version des Spektralerfassungs- und Analyseprogramms wird als Ergänzende Codierungsdatei bereitgestellt. Der Quellcode ist auf Anfrage für die Autoren verfügbar.
3. Navigieren Sie durch alle Eingabeaufforderungen und wählen Sie Optionen für den perfundierten Erfassungsmodus für Herzspektroskopie aus. Geben Sie auf der nächsten Seite an, ob eine zusätzliche Datenerfassung stattfindet. Geben Sie schließlich Erfassungsparameter ein, einschließlich der Position der beiden Chromophoren-Referenzspektren und der zu speichernden Daten.
4. Geben Sie eine Bandbreite von 490–630 nm ein.
5. Geben Sie eine Abtastrate von 2 Hz (d. h. 2 Proben/Sek.) ein.
6. Sammeln Sie ein dunkles Strom- oder Nulllichtspektrum, um die Hintergrundsignalpegel zu korrigieren, indem Sie die Lichtquelle ausschalten.
7. Klicken Sie hier, um die Chromophorreferenzen auszuwählen, die in der Fitting-Routine verwendet werden sollen.
8. Passen Sie auf der Seite Daten erfassen die Position des Katheters und der Pickup-Faser an, um das auf der Software angezeigte durchsichtige Licht zu maximieren, wobei die Signalamplitude im 500 nm-Bereich, in dem das sauerstoffreiche Myoglobin Absorptionen zu beachten.
9. Stellen Sie sicher, dass das Durchlicht den Detektor im 600 nm-Bereich nicht sättiert.
10. Stellen Sie sicher, dass keine externen Lichtquellen zum gesammelten Spektrum beitragen, indem Sie die Katheterbeleuchtung ausschalten und bestätigen, dass jetzt kein Licht erkannt wird.
11. Initiieren Sie die Datensammlung, indem Sie auf die Schaltfläche Spectra speichern klicken.
12. Klicken Sie auf Als Steuerung festlegen, um das Differenzabsorptionsspektrum von zukünftigen Spektren bis zum aktuellen "Kontroll"-Spektrum anzuzeigen.
13. Führen Sie jede physiologische Störung nach Belieben durch.
    1. Protokoll 1: Wirkung von Zyanid auf die Herzleistung und Chromophorabsorption
       1. Stoppen Sie die Umwälzflüssigkeit aus der Herzperfusion.
       2. Mit einer Spritzenpumpe Cyanid (2,5 bis 75 mM bei pH 7) mit unterschiedlichen Raten in Perfusate injizieren, um die gewünschten Cyanidkonzentrationen (0,025 bis 1 mM, berechnet aus der Aortendurchflussrate) in das fließende Perfusate in das Herz zu Überwachung der Herzfunktion und der optischen Eigenschaften.
       3. Stoppen Sie die Zyanidspritzenpumpe, wenn sich die Auswirkungen auf den Koronarfluss und die Herzfrequenz zusammen mit der optischen Übertragung durch die Herzwand im stabilen Zustand befinden.
    2. Protokoll 2: Ischämie/Hypoxie
       1. Beenden Sie die Zyanidinfusion.
       2. Nach 5 Minuten das sprudelnde Gas von 100% Sauerstoff auf 100% Stickstoff schalten, um Sauerstoff aus dem System zu entfernen.
       3. Nach etwa 10 Minuten, stoppen Sie den Fluss, um einen totalen ischämischen/hypoxischen Zustand zu simulieren.

5. Spektrale Datenanalyse

1. Führen Sie das Programm im perfundierten Herzanalysemodus aus.
2. Wählen Sie das entsprechende Spektrometer aus.
3. Geben Sie den Datendateipfad und die Referenzspektrendatei ein und wählen Sie die Katheterlichtquelle aus, die das vorgespeicherte Spektrum der Katheterlichtquelle lädt.
4. Wählen Sie Leseplatzdatenaus.
5. Wählen Sie Min und Max Wavelength.
6. Geben Sie die Bandbreite für die Datenanalyse als 490–630 nm ein.
7. Wählen Sie Zurück zum Hauptmenü.
8. Wählen Sie Lesereferenzenaus.
9. Bestätigen Sie die Referenzspektren, die in der Analyse verwendet werden sollen.
10. Wählen Sie Zurück zum Hauptmenü.
11. Wählen Sie im Hauptmenü Zeitpunkte aus.
12. Wählen Sie einen T0-Zeitpunkt als Steuerelement aus, und legen Sie den Bereich auf 100 Punkte fest.
13. Wählen Sie einen T1-Zeitpunkt als Versuchszeitraum in einem Bereich von 100 Punkten aus.
14. Beobachten Sie das rohe Differenzspektrum in der Registerkarte "Gemittelte Abs. Spektrum".
15. Wählen Sie Anpassungskoeffizienten berechnen aus, und klicken Sie dann auf die Registerkarte Koeffizienten anpassen, um den Zeitverlauf der Referenzspektrenanpassung zu beobachten.
16. Kehren Sie zum Hauptmenü zurück und wählen Sie Differenzabs berechnenaus.
17. Wählen Sie T0 und T1 an allen Positionen aus. Beobachten Sie das angepasste Spektrum im Differenzspektrumfenster und die Anpassungselemente im Fenster Referenzgewicht.
18. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um andere Zeitpunkte im Experiment zu vergleichen.
19. Zurück zum Hauptmenü.
20. Speichern Sie Daten und Analysen in einem Tabellenkalkulationsbericht, indem Sie einen gewünschten Namen eingeben und Daten speichern für die weitere Analyse mit anderen Programmen auswählen.
    HINWEIS: Wenn kein Name eingegeben wird, wird der Bericht mit demselben Namen wie die Eingabedatei gespeichert. Der Bericht wird in einem Ordner mit dem Namen Excel Analysis Filesgespeichert, der sich im selben Ordner wie die ursprüngliche Eingabedatei befindet.

Ergebnisse

Das verwendete System ist ein aus dem Regal erhältliches Kleintier-Perfusionsherzsystem, wurde aber stark für die Verwendung mit einem Kaninchenherz modifiziert. Die Modifikationen sollten in erster Linie die Bohrungsgröße aller Schläuche erhöhen, um eine angemessene Durchflussabgabe an das Kaninchenherz zu gewährleisten. Bei den verwendeten Perfusionsdrücken wurde sehr darauf geachtet, dass die Durchflussrate des nativen Perfusionssystems den Durchfluss mit dem Herz um mindestens das 5-fache überstieg. Zwischen der Fluidpumpe und der aortenförmigen Vorspannung-Blasenfallekammer wurden parallel 2–12 m Porenmembranfilter platziert, um Schmutz aus dem Herzen zu entfernen.

Übertragenes Licht aus dem Kaninchenherz
Abbildung 1 zeigt das Spektrum des Katheters (Abbildung 1A) und das rohe Spektrum des übertragenen Lichts von der herzfreien Wand des Kaninchens (Abbildung 1B). Diese Daten zeigen eine sehr große Dämpfung des Lichts im blauen Bereich des Spektrums, jedoch können die Absorptionsbänder von Myoglobin und den mitochondrialen Cytochromen direkt zwischen 490 und 580 nm im Einsatz beobachtet werden. In diesen Studien ist es wichtig sicherzustellen, dass in der Region genügend durchlässiges Licht von 490 bis 630 nm nachgewiesen wird, um Informationen über die metabolisch reagierenden Herzchromophoren zu erhalten. Die Positionierung der außen- und innenfaserigen Fasern wird vor dem Speichern von Daten angepasst, um die Lichtintensität zu maximieren, aber den Detektor im 625 nm-Bereich nicht zu sättigen.

Referenz Reduziert minus Oxidierte Spektren von Referenzchromophoren im Herzen.
Abbildung 2 zeigt die Referenzspektren, die verwendet werden, um die in diesen Studien gesammelten Differenzspektren anzupassen. Diese Referenzen umfassen Myoglobin, Cytochrom aa₃ (alternativ Cytochrom a₆₀₅ und Cytochrom a₆₀₇, je nach Art der Störung²²), Cytochrom a₅₈₀, Cytochrom b_L, Cytochrom b_H , Cytochrom c, Cytochrom c₁, FAD, eine Absorptionsdarstellung des einfallenden Lichts (bezeichnet I₀, das verwendet wird, um gesiebtes Licht zu berücksichtigen, d. h. Photonen, die durch das Gewebe gingen, ohne absorbiert zu werden), und eine Linie (mit Neigung und Abfangen, um die Streuung zu berücksichtigen, nicht in Abbildung 2dargestellt. Einige Spektren sind laut, da die Konzentration des reinen Referenzmaterials sehr niedrig war²².

Zeitverlauf der Referenzspektren passt während des Gesamtexperiments
Abbildung 3 stellt den Zeitverlauf eines typischen Experiments dar, das in Schritt 5.15 des Protokolls berechnet wurde. Diese besteht aus einer Kontrollphase, gefolgt von einer Zyanid-Injektionsphase, gefolgt von einem Zyanid-Auswaschen, gefolgt von einer Desoxygenierungsphase und schließlich Ischämie. Die Veränderungen in den einzelnen Chromophoren (Myoglobin, Cytochrom aa₃und Cytochrom c) im Laufe der Zeit werden im Laufe der Zeit zusammen mit der koronaren Durchflussrate dargestellt. Die optische Dichteänderung jedes Chromophors wird geschätzt, indem der Anpassungskoeffizient, der aus der linearen Minimal Squares-Routine und dem repräsentativen Peak des Chromophors (oder der maximalen Absorption dieses Chromophors) gewonnen wird, multipliziert wird. Bei Myoglobin wird beispielsweise der Anpassungskoeffizient der Myoglobinreferenz mit dem Wert des Myoglobin-Referenzspektrums bei 580 nm multipliziert. Beachten Sie, dass die schnelle Sauerstoffversorgung von Myoglobin zur Zugabe von Zyanid durch die Erhöhung des Durchflusses, aber vor der signifikanten Reduktion von Cytochromen begleitet wird. Dieser Effekt wird teilweise mit dem Auswaschen von Zyanid wiederhergestellt. Schließlich wird die vollständige Reduktion von Cytochromen und die Deoxygenierung von Myoglobin mit Ischämie erhalten. Diese Daten zeigen, dass dynamische Daten über den Stoffwechselzustand des Herzens mit dieser Methode leicht gewonnen werden können. Die Position der Spektren, die für die Differenzspektren verwendet werden, sind auf diesem Zeitverlauf wie folgende Gekennzeichnet: C-Baseline, CN-Zyanid-Injektion, CNW-Zyanid-Waschmittel, H N2-Hypoxie (Stickstoff wird im Perfusaten anstelle von Sauerstoff sprudeln) und HI No Flow Ischmia (keine Perfusate fließt durch das Herz).

Differenzspektrum der Zyanidbehandlung versus Kontrolle und Passung des Zyanid-Differenzspektrums von Kaninchenherz.
Um ein Differenzspektrum zu erhalten, werden zwei absolute Spektren subtrahiert. Jedes absolute Spektrum wird durch die Einnahme eines Durchschnitts von vielen (typischerweise 100) Spektren erhalten, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren. Abbildung 4 A stellt das Differenzspektrum des behandelten Kontroll- (C) und Zyanids (CN) dar. Anhand der in Abbildung 2beschriebenen Referenzspektren wird das Anpassungsspektrum berechnet. Das Restspektrum ist die Subtraktion der Passung von den Rohdaten. Das gleiche Schema wird für alle nachfolgenden Spektralpräsentationen verwendet. Abbildung 4 B zeigt die Spektrenamplituden der Referenzspektren (siehe Abbildung 2), die für Abbildung 4Averwendet werden. Starke Absorptionszunahmen der meisten Cytochromes werden beobachtet, da der Elektronenstrom in der Cytochromkette durch Zyanid im stationären Zustand blockiert wurde. Darüber hinaus nahm die Aufnahme von sauerstoffhaltigem Myoglobin zu, da der Sauerstoffverbrauch durch Zyanid eliminiert wurde. Abbildung 4 C stellt die Differenzspektren und die Passform des Differenzspektrums von CNW und CN dar und zeigt die teilweise Umkehrung des Zyanideffekts. Dies wurde erreicht, indem Zeitpunkte in Protokollschritt 5.18 ausgewählt und T0 in den CNW- und T1-In-CN-Bereich des Zeitverlaufs bewegt wurde. Abbildung 4 D stellt das Differenzspektrum von HI und C dar, das den vollständig desoxygenierten und reduzierten Zustand des Zytosols und der Mitochondrien im Vergleich zur Kontrollbedingung darstellt. Auch hier wurde dies bei Protokollschritt 5.18 durchgeführt, wodurch T0 nach C und T1 nach HI bewegt wurden.

Anfänglicher Verlauf der Zyanideffekte auf den Koronarfluss und die Chromophore
Abbildung 5 A zeigt ein Beispiel für die Einleitung der Zyanidwirkung auf das Gewebe. Die Passformen für Myoglobin, Cytochrom a₆₀₅ und Cytochrom c sowie der Koronarfluss werden für ein einzelnes Herz präsentiert. Diese Zeitkurse wurden in Protokollschritt 5.15 für das Zyanidexperiment erstellt. Die individuelle Differenz zur Basislinie (Position 1) ist in Abbildung 5Bdargestellt. Die Spektren wurden aus der entsprechenden Positionsnummer (1-4) auf dem Zeitkurs generiert. Dies wurde bei Protokollschritt 5.18 erreicht, wo T0 immer an Position 1 war, und anschließend wurden verschiedene Spektren (2–4) erstellt, indem T1 auf Position 2, 3 bzw. 4 bewegt wurde. Etwas überraschend war die Beobachtung, dass die Durchfluss- und Myoglobin-Sauerstoffversorgung vor signifikanten Veränderungen des Cytochrom-Redoxzustands zunahm. Die Einleitung der Veränderungen der Durchfluss- und Chromophorabsorption wurde durch lineare Extrapolation der anfänglichen Veränderungsrate von der Ausgangsbasis geschätzt. Mit diesem Ansatz und der Einstellung der Veränderung des koronaren Flusses als Zeitnull, leitete die Zunahme der Myoglobin-Sauerstoffversorgung 1,71 min bei 0,39 min nach der Änderung des Durchflusses ein, während Cytochrom a605 und Cytochrom c Absorption fast identisch, aber viel langsamer bei 4,24 min waren. 0,76 min bzw. 4,34 min bei 0,77 min (n = 8). Diese Daten deuten darauf hin, dass Zyanid den Gefäßton²⁴ entspannt, bevor eine wesentliche Veränderung des Stoffwechselzustands des Herzmuskels eintritt. Dieser Effekt wird wahrscheinlich durch Zyanid verursacht, das auf den vaskulären glatten Muskel trifft, bevor die effektive Dosis um die Herzmyozyten erreicht wird.

Schätzungen der Myoglobin-Sauerstoffversorgung in Kontrollherzen
Unter Verwendung der Cyaniddaten als Schätzung der gesamten Myoglobin-Sauerstoffversorgung und der Ischämie-Daten für vollständig desoxygeniertes Myoglobin schätzen wir, dass Myoglobin unter Kontrollbedingungen nur 88,2 % bis 1,0 % (n = 10) sauerstoffriniert war, im Einklang mit früheren Studien^{20 , 21 , 25}.

Abbildung 1 : Spektren des seitlich feuernden optischen Katheters. (A) Dies ist ein Spektrum des emittierten Lichts aus der fernen Lichtquelle durch den Katheter, der mit der Pickup-Faser etwa 1 cm vom Katheter entfernt erkannt wird. In dieser Geometrie fehlt das Herz und die Intensität der Lichtquelle ist so abgestimmt, dass der Detektor nicht sätttigt. (B) Der Seitenfeuerkatheter wird in den linken Ventrikel eingeführt und das übertragene Licht des Herzens wird gesammelt und angezeigt. Der Einsatz zeigt die 400 bis 580 nm Region erweitert, was die komplexe Übertragung von Licht aus dieser Region zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2 : Referenzspektren von Herzchromophoren, die für die Spektralmontage verwendet werden. Spektren wurden mit einer Vielzahl von Methoden²² gesammelt und sind von reduziert – oxidiert (für die Cytochrome) und desoxygeniert – sauerstoffhaltige (für Myoglobin). Für I₀wird das Spektrum in Abbildung 1A einfach in einen Absorptionsterm konvertiert, um den Verweis zu erstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3 : Durchfluss und optische Veränderungen im Laufe der Zeit. Die optische Dichteänderung jedes Chromophors ist einfach das Spektrum des einzelnen Chromophors bei seiner maximalen Absorption. Die maximalen Absorptionsfrequenzen waren wie zuvor beschrieben^20,26. Der vorgestellte Zeitverlauf ist für ein Experiment, das eine Ausgangslinie zeigt, gefolgt von Zyanidinjektion (0,10 mM bei maximalem Perfusatenstrom), Zyanidauswaschung, Stickstoffhypoxie, die durch den Austausch von Sauerstoff durch Stickstoff durchgeführt wird, und dann vollständige Ischämie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4 : Angepasste Differenzspektren verschiedener Bedingungen. (A) Spektrum der Zyanidinjektion abzüglich der Ausgangsbasis. Das Passungsspektrum, das aus der am wenigsten quadratischen Routine gewonnen wird, wird ebenfalls geplottet. Das Restspektrum ist der Unterschied zwischen dem Roh- und dem Fit-Spektren. (B) Die Referenzspektren, die zum Erstellen der in Abbildung 4Adargestellten Passform verwendet werden. Das Programm skaliert die Referenzen in Abbildung 2 auf ihren relativen Beitrag im aktuellen Differenzspektrum. (C) Wie in A, zeigt aber das Differenzspektrum von Auswaschung im Vergleich zur Zyanidinjektion. (D) Wie in A, zeigt aber das Differenzspektrum der Ischämie versus Ausgangswert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5 : Hohe zeitliche Auflösung der Zyanidinfusionswirkung auf ausgewählte Cytochrome, Myoglobin und Herzfluss. (A) Zeitverlauf des Herzflusses, Desoxymyoglobin, reduziertes Cytochrom a₆₀₅und reduziertes Cytochrom c. Zahlen beziehen sich auf die Position der Spektren, die relativ zum Ausgangswert in Abbildung 5Bgenommen wurden. (B) Differenzspektren für die 4 in Abbildung 5A beschrifteten Positionen im Vergleich zur Steuerung (Position 1). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die isolierte retrograde oder arbeitende durchfundierte Herzpräparation ist ein Standbein in der Untersuchung der Herzphysiologie sowie der präklinischen Untersuchung von Techniken und Medikamenten am Herzen. Der Schlüssel zu seiner Verwendung war die einfache Vorbereitung, robuste funktionelle Eigenschaften und die Kontrolle der experimentellen Parameter sowie die Fähigkeit, viele funktionelle Parameter des schlagenden Herzens zu messen. Die optische Absorptionsspektroskopie gibt Einblicke in die Sauerstoffversorgung des Gewebes sowie die metabolischen Aktivitäten mitochondrien. Die optische Spektroskopie hat in erster Linie in den isolierten perfundierten Herzstudien im Reflexionsmodus durchgeführt, die aufgrund von Bewegungs- und Lichtstreuungskomplikationen schwer zu interpretieren sind.

Wir haben die optische Spektroskopie der Ventrikelwandtransmission (VWTOS) eingeführt, um eine robuste Methode zur Überwachung der metabolischen Chromophore des Herzgewebes bereitzustellen. In einer früheren Publikation haben wir gezeigt, dass eine an der Spitze von Koaxialkabel²⁰ fest verdrahtete LED eine einzigartige intrakardiale Seitenfeuerlichtquelle ist, die für VWTOS-perffundierte Herzen verwendet werden kann. Das Seitenfeuer bezieht sich auf die Projektion des Lichts senkrecht zur langen Achse des Katheters, ideal für die Beleuchtung der ventrikelfreien Wand. Der LED-Katheter war klein genug, um die Herzfunktion nicht zu beeinträchtigen, sondern erforderte eine spezielle Fertigung im Labor. Die aktuelle Studie stellt die Verwendung eines 500 Mikrometer kommerziellen Seitenfeuerkatheters vor, der an jede Lichtquelle gekoppelt werden kann, die mit Glasfasern kompatibel ist. Diese seitlich feuernden optischen Katheter wurden kommerziell für die Laserablation senkrecht zur langen Achse der Faser entwickelt. Natürlich verwenden wir die Lichtleistung viel geringer als für die Photoablation erforderlich. Kleinere Fasern sind für kleinere Präparate wie das perfundierte Mausherz²⁷verfügbar. Dieses Glasfasersystem sorgte für eine ausreichende Beleuchtung durch die Herzwand im Wellenlängenbereich, in dem Herzchromophoren absorbieren (450–630 nm). Mit einer Pickup-Faseroptik an der Außenseite des Herzens kann die Absorption von Myoglobin- und Mitochondrien-Zytochromen mit ausgezeichneter zeitlicher und spektraler Auflösung überwacht werden (siehe Abbildung 5). Der seitliche Glasfaseransatz hat gegenüber dem LED-Katheter für VWTOS mehrere Vorteile, darunter ein viel kleineres Querschnittsprofil des Katheters, das die Auswirkungen des Katheters auf das Herz minimiert, flexiblere Reduzierung der Auswirkungen auf Herzklappen und Herzkammerleistung, keine elektrischen Anschlüsse, die in der saline perfusate ausblenden können, und schließlich ein Katheter, der eine externe Lichtquelle verwendet, die die Flexibilität der Lichtquellenauswahl für VWTOS erhöht.

Aufgrund der starken Absorption des Herzens unter 490 nm ist es schwierig, viele Informationen über das Soretband der Cytochrome im Bereich von 410–445 nm oder NADH bei 340 nm zu generieren. Somit ist die breite Absorption von FAD bei 450 nm die niedrigste Frequenzabsorption, die beobachtet wird, obwohl der gesamte Absorptionspeak dieser Chromophore nicht beprobt wird. Mit VWTOS ist das Signal-Rausch-Verhältnis sehr hoch, da die gesamte Wand im Gegensatz zur Oberflächenreflexionsspektroskopie, die üblicherweise²⁰verwendet wird, abgetastet wird, die nur die Oberfläche des Herzens mit zahlreichen Streuproblemen abtastet. DIE VWTOS-Probenahme der gesamten Herzwand ist eher analog zu den Messungen der Kernspinresonanzspektroskopie (NMRS) vieler Herzmetaboliten wie ³¹P nachgewiesenem Adenosintriphosphat und Kreatinphosphat²⁸, ¹³C nachgewiesen beschriftete Metaboliten^29,30 einschließlich hyperpolarisierter Etiketten^31,32und ¹H nachgewiesene Metaboliten³³. Da der VWTOS mit nichtmagnetischen Geräten durchgeführt werden kann, ist es durchaus möglich, dass NMR und VWTOS gleichzeitig durchgeführt werden können. VWTOS ist nicht auf endogene Chromophore beschränkt und könnte zur Überwachung der Absorption von optischen Sonden für pH-, Ca^2+-und Plasmamembranpotenziale verwendet werden.

Wir verwenden 2 Hz (d.h. 2 Samples/sec), die ein ausgezeichnetes Single-Spektrum-Signal zu Rauschen bietet. Obwohl höhere Abtastraten erreicht werden können, die eine Analyse des Herzzyklus ermöglichen, haben frühere Studien gezeigt, dass es keinen Schlag gibt, um Variationen in der Chromophor-Absorption zu schlagen, so dass kein Aufwand, selektiv Licht als Funktion des Herzzyklus zu sammeln, gemacht³⁴. Durch die VWTOS-Geometrie ist die Lichterkennung weniger abhängig von Gewebebewegungen als Reflexionsmethoden, da die komplexen Oberflächenstreuungsereignisse eliminiert werden. Wir stellen fest, dass schwere Bewegung diese Maßnahmen stören kann, aber die Echtzeit-Spektralanalyse zeigt schnell spektrale Übergänge, die mit Gewebechromophorübergängen unvereinbar sind. Auch dies geschieht nur, wenn sich das Herz grob von der Sammelfaser entfernt und die Menge des gesammelten durchserückenden Lichts drastisch reduziert.

Die VWTOS-Daten werden mit einer vollständigen Spektralanpassungsroutine auf Basis einer Referenzbibliothek von Spektren von Herzchromophoren und dem Spektrum der Lichtquelle wie zuvor beschrieben^{20,22,27 , 35} mit einem einfachen linearen Ansatz mit kleinsten Quadraten. Dieses spektrale Fitting-Verfahren kompensierte überlappende Absorptionsspektren und stützt sich nicht auf "isobestische" Wellenlängen. Diese Vollspektrum-Analyse eliminiert Artefakte, die mit der gemeinsamen Doppelstrahlanalyse(d.h. zwei Wellenlängen) verbunden sind 1^,3,6, die sich als problematisch erwiesen hat²⁰. Der zusätzliche Vorteil der vollständigen Spektralanalyse ist die Erzeugung einer Güte der Passung aus den Residuen, die in Zweistrahlprotokollen nicht verfügbar ist.

In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Wirkung von Zyanid auf die optischen Eigenschaften des Herzens. Da Zyanid Cytochromoxidase blockiert, hemmt es den Sauerstoffverbrauch und führt im Wesentlichen zu einer Nettoreduktion aller Cytochrome, wenn die Elektronen in der Cytochromkette wieder aufsteigen. Das Membranpotenzial bleibt jedoch offenbar hoch, da die Redoxveränderungen in b_L und b_H im Vergleich zu Cytochrom c¹³sehr klein sind. Mit der Einstellung des Sauerstoffverbrauchs sollte sich die Sauerstoffspannung im Gewebe dem Perfusaten nähern, und wir stellten einen frühen Anstieg des sauerstoffhaltigen Myoglobins mit Zyanid fest, der mit der Vorstellung übereinstimmt, dass die Saline das Herz durchdrang, selbst bei retrograder Perfusion. ist nicht vollständig sauerstoffreiches Myoglobin im Cytosol^19,20,21,36. Vergleicht man die maximale Wirkung von Zyanid auf sauerstoffhaltiges Myoglobin mit dem vollständig desoxygenierten Spektrum, das mit Ischämie gewonnen wird, ergibt sich eine Myoglobin-Sauerstoffation von nur etwa 88%, die mit früheren Studien übereinstimmt.

Es ist wichtig, in dieser Studie zu beachten, dass die Cyanid-Effekte auf Myoglobin-Sauerstoff- und Cytochrom-Reduktion zeitlich aufgelöst wurden. Es ist überraschend, dass die Auswirkungen von Zyanid zuerst auf den koronaren Fluss und Myoglobin beobachtet wurden, bevor große Veränderungen im Cytochrom-Redoxzustand des Herzens beobachtet wurden. Die frühe deutliche Zunahme des Durchflusses deutet darauf hin, dass eine Wirkung auf arterielle glatte Muskeln^24,37 auftreten kann, bevor grobe metabolische Effekte in den Herzzellen beobachtet werden. Die Zunahme des Durchflusses, möglicherweise mit einer bescheidenen Zyanid-induzierten Abnahme der Atmung, führt wahrscheinlich zu einem sofortigen Anstieg des sauerstoffhaltigen Myoglobins, der durch die Erhöhung der Sauerstoffzufuhr verursacht wird. Mit der Ausbreitung der Zyanidhemmung auf die Myozyten wird eine weitere Zunahme des koronaren Flusses beobachtet (siehe die Region, die 3 in Abbildung 5amarkiert ist), wahrscheinlich angetrieben durch zahlreiche Stoffwechselfaktoren³⁸. Die große frühe Wirkung von Zyanid auf den Fluss deutet darauf hin, dass der Stoffwechsel des vaskulären glatten Muskels bei der Veränderung des Gefäßtonus stärker sein kann als der Stoffwechsel der Myozyten. Diese Daten stützen die etablierte Vorstellung, dass Myoglobin eine viel geringere Affinität zu Sauerstoff hat als COX, selbst im intakten Herzen, da die Myoglobin-Sauerstoffversorgung lange vor Veränderungen des Mitochondrien-Redoxzustands auftrat (Abbildung 5). Dieser hohe Gehalt an desoxygeniertem Myoglobin unter Kontrollbedingungen stimmt mit früheren Studien überein, die darauf hindeuten, dass das isolierte, durchblutete Herz der Saline auch unter Kontrollbedingungen^{teilweise hypoxisch sein kann. 20,21,27,36}, unterstreicht die Bedeutung der Überwachung der Herzgewebesauerstoffversorgung bei der Verwendung dieses wichtigen Modells in der Herzphysiologie.

Wir präsentieren hier die experimentellen Details zur Durchführung der Transmissionsabsorptionsspektroskopie auf dem isolierten perfundierten Herzen. Wir haben diese Technik erfolgreich für den Einsatz an den Herzen vom Kaninchen bis zur Maus mit einer dünnen seitlich feuernden intrakardialen Optischen Faser angepasst. Unter Verwendung modernster, vollständiger spektraler Fitting-Routinen kann die komplexe optische Wechselwirkung der Herzchromophoren leicht extrahiert werden, um ein nahezu Echtzeit-Maß kritischer Elemente des Myokardstoffwechsels gleichzeitig mit konventionellen funktionale Maßnahmen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOPAC data acquisition system	BIOPAC	MP150	Analog to digitial conversion
BIOPAC general purpose transducer amplifiers	BIOPAC	DA100C	Pressure monitoring
BIOPAC System skin temperature amplifier	BIOPAC	SKT100B	temperature monitoring
Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers	Mightex	SLC-MA02-U	External light source power supply
Disposable pressure sensors	BIOPAC	RX104A	Pressure monitoring
Dual Syringe, Infusion Pump	KdScientific	KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP	drug injection
Flow-through probes	Transonic	4PXN	perusate flow monitoring
Glass Syringe	FORTUNA Optima	30 CC	Air tight fluid injection
High power fiber-coupled LED white light source	Mightex	Type-A FCS-0000	External light source
Perfused heart system	Radnoti	120101BEZ	This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript)
Phase fluorimeter	Ocean Optics	NeoFox-GT	oxygen concentration
Pickup fiber optic	Thor labs	BF20HSMA01	Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber)
PowerLab unit	AD Instruments	PowerLab 8/35	Analog to digitial conversion
Pressure transducers	BIOPAC	TSD104A	pressure monitoring
Programming environment	LABViEW	N/A	Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request
Rapid scanning spectrophotometer	Ocean Optics	QE65PRO	Rapid scanning spectrometer for spectral analysis
Side firing fiber optic	Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200	JTFLH200230500/1.5M	side firing fiber optic 200 microns core
Sodium cyanide	Sigma-Aldrich	380970	Metabolic inhibitor
Temperature probe	BIOPAC	TSD102A	temperature monitoring
Tubing flow modules	Transonic	TS410	perusate flow monitoring