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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Detaillierte Protokolle für beide in vitro und in-Cell selektive 2'-Hydroxyl-Acylation von Primer Extension (Form) Experimente zur Bestimmung der sekundären Struktur der Pre-mRNA-Sequenzen von Interesse im Beisein einer RNA-targeting niedermolekularer analysiert werden in diesem Artikel vorgestellt.

Zusammenfassung

In den Prozess der Arzneimittelentwicklung kleiner Moleküle RNA-targeting wird Aufklärung der strukturellen Veränderungen auf ihre Interaktionen mit der Ziel-RNA-Sequenzen gewünscht. Wir bieten hier eine detaillierte in-vitro- und in der Zelle selektiv 2'-Hydroxyl Acylation von Grundierung Erweiterung (Form)-Protokoll, um die RNA Strukturwandel in der Gegenwart ein experimentelles Medikament für spinale Muskelatrophie (SMA), Überleben der Studie analysiert Motoneuron (SMN)-C2, und im Exon 7 des Pre-mRNA des SMN2 Gens. In in-vitro-Form eine RNA-Sequenz von 140 Nukleotide mit SMN2 Exon 7 von T7-RNA-Polymerase transkribiert, gefaltet in Anwesenheit von SMN-C2 und anschließend durch ein mildes 2'-OH Acylation Reagenz, 2-Methylnicotinic Säure Lithiumimidazolid (NAI) geändert. Diese 2'-OH-NAI-Addukt weiter sondiert durch einen 32P-Label Grundierung Erweiterung und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) behoben. Im Gegensatz dazu erfolgt 2'-OH Acylation in der Zelle Form an Ort und Stelle mit SMN-C2 gebunden zelluläre RNA in lebenden Zellen. Die Pre-mRNA-Sequenz von Exon 7 im SMN2-gen, zusammen mit Form-induzierte Mutationen in der Primer-Extension wurde dann mittels PCR und Sequenzierung der nächsten Generation verstärkt. Vergleicht man die beiden Methoden, in-vitro-Form ist eine kostengünstigere Methode und erfordert keine Rechenleistung, Ergebnisse zu visualisieren. Jedoch weicht die in vitro Modell der Form abgeleitet RNA manchmal von der Sekundärstruktur in einem zellulären Kontext, wahrscheinlich durch den Verlust aller Interaktionen mit RNA-bindende Proteine. In ZELLFORM braucht keinen radioaktiven Material Arbeitsplatz und ergibt eine genauere RNA Sekundärstruktur im Zusammenhang mit zellulären. Darüber hinaus in der ZELLFORM ist in der Regel für eine größere Palette von RNA-Sequenzen (~ 1.000 Nukleotide) durch die Verwendung von Next Generation Sequencing, im Vergleich zu in-vitro-(~ 200 Nukleotide), die in der Regel zu gestalten setzt auf Seitenanalyse. Für den Fall, dass der Exon 7 in SMN2 Pre-mRNA, die in-vitro- und in der Zelle Form abgeleitet sind RNA-Modelle einander ähnlich.

Einleitung

Selektive 2'-Hydroxyl Acylation analysiert durch Primer Extension (Form) ist eine Methode zur Messung der Kinetics von jedem Nukleotid in einer RNA-Sequenz des Interesses und Aufklärung der Sekundärstruktur bei Einzel-Nukleotid-Auflösung1. Form-Methoden, sowohl im in-vitro-Bedingungen2,3,4 (gereinigte RNA in einem definierten Puffersystem) und im lebenden Säugetier-Zellen5,6, wurden entwickelt, um die sekundäre untersuchen Struktur von mittlerer Länge RNA-Sequenzen (in der Regel < 1.000 Nukleotide in der Zelle Form und < 200 Nukleotide für in-vitro-Form). Es ist besonders nützlich, um Strukturveränderungen im Rezeptor RNA nach Bindung an RNA-Interaktion niedermolekularer Metaboliten2,4,7,8 bewertet und mechanistische Aktionen studieren RNA-targeting Moleküle während Drug Development9,10.

RNA-targeting Arzneimittelforschung hat vor kurzem Aufmerksamkeit in wissenschaftlichen Labors und der pharmazeutischen Industrie11,12 über unterschiedliche Ansätze und Strategien13,14,15 gezogen ,16. Jüngste Beispiele für RNA-targeting kleine Moleküle für den klinischen Gebrauch zwei strukturell verschiedene experimentelle Medikamente, LMI-07017 und RG-791618,19, für spinale Muskelatrophie (SMA), der viel versprechende zeigte Ergebnisse in Phase II Studien20. Beide Moleküle wurden gezeigt, die Ziel-Überleben der Motoneuron (SMN) 2 Pre-mRNA und regulieren das Spleißen Verfahren des SMN2 gen6,17,21. Die Anwendung von in-vitro- und in der Zelle Form in einer Untersuchung der Ziel-RNA strukturellen Veränderungen in der Gegenwart ein Analogon der RG-7916 bekannt als SMN-C26zuvor gezeigt.

Im Prinzip misst Form die 2'-OH Acylation bei jedem Nukleotid eine RNA-Sequenz im Beisein von überschüssigen Mengen an ein selbst abschrecken Acylation Reagenz unvoreingenommen. Das Acylation Reagenz ist nicht stabil im Wasser, mit einer kurzen Halbwertszeit von (z. B. T1/2 = 17 s 1-Methyl-7-Nitroisatoic-Anhydrid; oder 1 M 7, ~ 20 min für 2-Methylnicotinic Säure Lithiumimidazolid, NAI)22 und Unempfindlichkeit gegen die Identität des die Basen-23. Dies führt zu einer günstigeren Acylation von 2'-OH-Gruppen der flexiblen Basen, die eine genaue Einschätzung der Dynamik der einzelnen Nukleotid umgewandelt werden können. Insbesondere ist ein Nukleotid in einem Base-paar in der Regel weniger reaktiv als eine ungepaarte man ein 2'-OH modifizierenden Reagenz, wie NAI und 1 M 7.

Mit Blick auf die Quelle der RNA-Vorlage und dem 2'-OH Acylation stattfindet, kann Form in der Regel in Form von in-vitro- und in-Cell kategorisiert werden. In Vitro Form verwendet gereinigtes T7 RNA transkribiert und es fehlt einen zellulären Kontext in experimentellen Designs. In ZELLFORM auftreten die RNA-Vorlage-Transkription und 2'-OH Acylation innerhalb lebender Zellen; Daher können die Ergebnisse der RNA Strukturmodell in einem zellulären Kontext rekapitulieren. In ZELLFORM wird für die Form, die in lebenden Zellen in der Literatur24durchgeführt wie in Vivo Form bezeichnet. Da dieses Experiment nicht in ein Tier durchgeführt wird, können wir dieses Experiment als ZELLFORM für Genauigkeit bezeichnet.

Auch unterscheiden sich die Strategien für die Grundierung Ausbaustufe von in-vitro- und in der Zelle Form. In in-vitro-Form hält reversen Transkription an die 2'-OH Acylation Position im Beisein von Mg2 +. Eine 32P-beschriftet-Grundierung-Erweiterung erscheint daher als eine Band in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und die Intensität der Band ist proportional zu der Acylation Satz1. In ZELLFORM, reversen Transkription generiert zufällige Mutationen bei der 2'-OH Addukt Position im Beisein von Mn2 +. Die Mutationszucht bei jedem Nukleotid durch in Tiefe Next Generation Sequencing erfasst werden kann, und die Form Reaktivität bei Einzel-Nukleotid-Auflösung kann dann berechnet werden.

Ein mögliches Problem für ZELLFORM ist die geringe Signal-Rausch-Verhältnis (d. h. ein Großteil der 2'-OH-Gruppen ist unverändert, während die unveränderten Sequenzen die meisten der Read in Next Generation Sequencing besetzen). Vor kurzem, eine Methode, um die 2'-OH anreichern RNA geändert, klicken Sie wie in Vivo Form (IcSHAPE) bezeichnet, entwickelte sich Chang Labor25. Diese Anreicherung-Methode kann bei der Untersuchung schwach kleine Moleküle wie RNA Interaktionen, vor allem in einem Verhör Transkriptom-weite vorteilhaft sein.

Protokoll

(1) in-vitro-Form

Hinweis: Das Protokoll ist von dem veröffentlichten Protokoll Nr.1geändert.

  1. Vorbereitung der RNA-Vorlage
    Hinweis: Die Vorlage für T7 Transkription wurde bestellt, wie ein synthetisches doppelsträngige DNA (DsDNA) und verstärkt durch entweder Einschieben in einem E. Coli -Vektor, der trägt ein einzigartiges Paar EcoRI/BamHI Einschränkung Endonuklease Websites, wie pET28a oder durch PCR. Das Protokoll für PCR-Amplifikation ist nachfolgend dargestellt.
    1. Mischen Sie das folgende Material: 50 μL der PCR Master mix (siehe Tabelle der Materialien), 2 μL für jede Grundierung in 10 μM (siehe Tabelle 1 für Sequenzen), 200 ng DsDNA-Vorlage 2 μL 3 μL der Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und 41 μL H2O. Aliquot in zwei PCR Rohre (jedes Röhrchen enthält 50 μL Reaktionsgemisch).
    2. Richten Sie den Thermocycler folgendermaßen: Stufe 1) 95 ° C für 30 s; Stufe 2) 95 ° C für 20 s; Stufe 3) 56 ° C für 20 s; Stufe 4) 72 ° C für 20 s; Etappe 5) Schleife zurück zum Schritt 2 für 30 Zyklen; 6. Etappe) 72 ° C für 3 min; und Stufe 7) unendlich bei 4 ° C bis zum folgenden Schritt halten.
    3. Der PCR-Amplifikate durch Extraktion von Gel Scheiben zu reinigen (siehe Tabelle der Materialien und verwenden die Hersteller-Protokoll). Eluieren Produkt DNA mit 35 μl Tris-EDTA (TE) Puffer, mit 10 mM Tris (pH 8,0) und 1 mM EDTA, liefern eine 0,1-0,5 µg/μl Vorlage. Normalisieren Sie die gereinigte DNA Schablone in 0,10 µg/μl.
      Hinweis: Optional kann die Qualität der Vorlage auf einem 1,8 % Agarose-Gelelektrophorese mit 0,10 µg DNA analysiert werden. Ein einzelnes Band der gewünschten Vorlage DNA wird auf dem Gel erwartet.
    4. Richten Sie die T7 Transkription Reaktion (Gesamtvolumen 40 μl) durch das Hinzufügen der folgenden Materialien in ein PCR-Röhrchen: 4 μl 10 x Reaktion Puffer, 4 μL von ATP, 4 μL der CTP-Version 4 μL der GTP, 4 μL der UTP, 4 μL T7 Enzyms (siehe Tabelle der Materialien) , 4 μL der gereinigten PCR Amplifikate aus Schritt 1.1.3 (0,4 μg) und 12 μL Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC)-behandeltem Wasser. Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 4 X pipettieren. Bei 37 ° C für 4 – 16 h in einem Thermocycler oder in einem Inkubator 37 ° C inkubieren.
      Hinweis: Beginnen Sie mit Schritt 1.1.6 eingerichtet, während die Reaktion im Schritt 1.1.4 ist im Gange.
    5. 2 μL der DNase hinzufügen, mischen, indem Sie nach oben und unten 4 X pipettieren und Inkubation bei 37 ° C für 15 min. Mix in gleicher Lautstärke 2 x Tris-Borat-EDTA (FSME)-Harnstoff Probenpuffer (siehe Tabelle der Materialien). Erhitzen Sie auf 70 ° C für 3 min, zu inaktivieren.
    6. Mischen Sie in einer RNase-freie Flasche 75 mL 40 % Acrylamid/Bisacrylamide Lösung (29,1, siehe Tabelle der Materialien), 180,2 g Harnstoff, und 50 mL 10 X TBE-Puffer (RNase-frei, siehe Tabelle of Materials). Setzen Sie die Flasche auf einem Orbitalschüttler (250 u/min), bis sich alle Kristalle von Harnstoff aufgelöst haben (kann bis zu 2 Stunden dauern). Stellen Sie die Lautstärke bis 500 mL mit DEPC-behandeltem Wasser. Filtern Sie die Lösung mit einer 0,2 μm-Membran (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: In diesem Prozess zu vermeiden mit spiegelnden und rühren-Bar um RNase-Kontamination zu verhindern. Die Lösung kann bis zu 1 Jahr bei 4 ° C aufbewahrt werden.
    7. Reinigen Sie zwei Elektrophorese Glasplatten eine richtige Größe (16,5 x 24 cm) mit entionisiertem Wasser und 70 % EtOH mit einem Stück Papier abwischen. Richten Sie die Platten mit einem Paar von 2,0 mm Spacer (die Platte mit einer silikonisierte Oberfläche steht nach innen) und verschließen Sie der Rand der Platten mit Klebeband. Doppel-Klebeband am Rand der Platte um auslaufen zu verhindern.
    8. Mischen Sie in einem Becherglas 200 mL Acrylamid-Lösung von Schritt 1.1.6, 2,0 mL der 10 % Ammonium Bleichen Lösung und 100 μL der Tetramethylethylenediamine (TEMED) mit einer Pipettenspitze RNase-freie durch Rühren rasch für 30 S. Tilt die Platten auf einem Stück Benchtop-Abdeckung und die Lösung von den Abstand der Platten. Tippen Sie auf die Platte zu heben alle Bläschen und legen Sie die Platte flach auf die Benchtop-Abdeckung. Sofort setzen Sie den Kamm und lassen Sie das Gel mindestens 1 h polymerisieren.
      Hinweis: Wenn das Gel innerhalb des nächsten Tages verwendet werden soll, vertuschen Sie die Spitze des Gels mit einem feuchten Papiertuch und Wrap mit einem größeren Stück Plastikfolie. Legen Sie es flach bei 4 ° c liegen
    9. Entfernen Sie das Klebeband und Klemmen Sie die Platte in eine Elektrophorese-Stand. Entfernen Sie den Kamm zu und fügen Sie angemessene 1 X TBE-Puffer an der Ober- und Unterseite des Stausees. Bereits laufen Sie das Gel für 30 min bei 20 w.
      Hinweis: Optional kann der Inhalt der gewünschten RNA ca. 90 % oder mehr beträgt, eine Mini-Gel als Ersatz eine präparative Gel verwendet werden.
    10. Waschen Sie aller be-Brunnen von oben und unten zweimal mit der Flüssigkeit in das Reservoir pipettieren. Fügen Sie grobe RNA aus Schritt 1.1.5 in die Vertiefungen. Führen Sie das Gel bei 20 W bis Xylol Cyanol FF Farbstoff (hellblau) etwa zwei Drittel des Gels Länge (~ 60 min) geht.
      Hinweis: Sorgen um nicht mehr als ein Drittel der Höhe des Brunnens zu laden (verwenden Sie ggf. mehrere Brunnen).
    11. Tauchen Sie das Gel in 1 X TBE-Puffer mit 1: 10.000 Verdünnung des Safes in einem Behälter groß genug für das Gel färben (siehe Tabelle der Materialien). Stellen Sie die Behälter auf einem Orbitalschüttler für 5 min bei 80 u/min.
    12. Unter UV-Licht das gewünschte RNA-Band zu identifizieren und rasch ein dünnes Band des Gels mit einer sauberen Rasierklinge geschnitten. Legen Sie 1 – 2 Gel Scheiben in eine 1,7 mL-Tube.
    13. Wiederherstellen Sie die RNA von der Gel-Scheibe durch passive Elution. Jedes Rohr ausreichend Elution/Niederschlag Mischung (~0.3 mL pro Scheibe) hinzufügen: 0,3 M NaOAc (pH 5,2), 2,5 M LiCI, 1 mM EDTA 0,1 % Natrium Dodecyl Sulfat (SDS) in DEPC-behandeltem Wasser. Drehen Sie die Röhre, die das Gel Spleißstelle(n) bei 4 ° C für 16 h enthält.
      Hinweis: Eine typische Wiederfindungsrate beträgt ~ 75 % in diesem Schritt. Um den Ertrag zu steigern, zu entfernen Sie und sammeln Sie der Eluent und fügen Sie die gleiche Menge an Elution Puffer, dann wiederholen Sie diesen Schritt.
    14. Der Eluent in einem neuen 1,7 mL Röhrchen zu kombinieren. Fügen Sie 2.5 x eiskalten EtOH hinzu, invertieren Sie die Rohre sechsmal um die Flüssigkeit zu mischen und legen Sie die Rohre bei-80 ° C für mindestens 1 h.
    15. Zentrifuge für 10 min bei 10.000 x g und 4 ° C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch pipettieren. Waschen der RNA-Pellet durch Zugabe von 80 % EtOH (1 mL pro Röhrchen), Wirbel für 15 s und Zentrifuge für 10 min bei 10.000 x g und 4 ° C.
    16. Entfernen Sie den Überstand zu und trocknen Sie das RNA-Pellet für 5 min. hinzufügen 50 μL der RNase-freies Wasser und mischen durch Pipettieren nach oben und unten 10 Mal. Die RNA-Konzentration, um 0,10 µg/μl zu normalisieren. Speichern Sie die gereinigte RNA bei-80 ° C.
      Hinweis: Trocken Sie die RNA-Pellet nicht übermäßig.
    17. Optional, um die Qualität der RNA zu analysieren, verdünnen 1 μl (100 ng) RNA aus Schritt 1.1.16 in 5 μL des Wasser zugeben und mit 5 μl 2 X TBE-Harnstoff Probenpuffer. Dann Hitze bei 70 ° C für 3 min und Last auf einem 6 % FSME-Harnstoff Mini-Gel.
      1. Führen Sie dem Gel bei 180 V für 1 h Perform die Färbung wie in Schritt 1.1.11 getan. Visualisieren Sie das Gel mit UV-auf ein bildgebendes System. Ein einzelnes Band dürfte in der gewünschten Länge.
  2. Vorbereitung der 32P-Label Grundierung
    1. Richten Sie die Reaktion durch Mischen der folgenden Materialien: 10 μL der γ -32P-ATP (~1.5 mCi, ~ 25 μM, siehe Tabelle der Materialien), 2 μL der reversen Transkription (RT) Grundierung (100 μM, Reihenfolge siehe Tabelle 1), 2 μL der 10 x T4 Polynukleotid Kinase (PNK) Reaktion-Puffer, 1 μl T4 PNK (siehe Tabelle der Materialien), und 5 μl RNase-freies Wasser. Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
      Vorsicht: Angemessenen Schutz braucht Schritte 1.2-1.5 eine autorisierte Arbeitsplatz für radioaktive Stoffe.
    2. Für 20 min bei 65 ° c Hitze inaktivieren Fügen Sie die Proben auf einer Entsalzung Spalte und Zentrifuge bei 1.000 x g für 1 min. Mischen der Eluent mit 25 μl Probenpuffer 2 X TBE-Harnstoff. .
      Hinweis: Speichern Sie das beschriftete Rohprodukt bei-20 ° C, wenn es nicht sofort gereinigt werden.
    3. Laufen Sie eine 10 % Acrylamid Gel bei 20 W 1 h.
      Vorsicht: Laden Sie 32P-Label Grundierung von 1.2.1 betreten das Gel und Vermeidung von Blutungen die Radioaktivität in den oberen Behälter. Legen Sie nicht mehr als ein Drittel der Höhe des Brunnens um ein dünnes Band auf dem Gel zu gewährleisten (verwenden Sie ggf. mehrere Brunnen). Die Flüssigkeit in den unteren Behälter kann hoch radioaktiv sein.
    4. Die Glasplatten der Gel-Kassette zu entfernen und das Gel auf ein Stück Frischhaltefolie legen. Falten Sie die Plastikfolie um das Gel zu einem luftdichten Sandwich bedecken. Das Gel-Sandwich ein Kalzium Wolframat Phosphor Bildschirm und ein bildgebendes Instrument aussetzen. Bild das Gel wieder mit normalem Licht zu wissen, wo die Ränder des Gels.
    5. Verwenden Sie ein Bildbearbeitungsprogramm, um die beiden Bilder zu überlagern. Richten Sie das Gel auf dem gedruckten Bild. Verwenden Sie einer frischen Rasierklinge, um die gewünschten Bands aus dem Gel geschnitten. Legen Sie 1 bis 2 Gel Scheiben in eine 1,7 mL-Tube.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass das gedruckte Bild hat die gleiche Größe wie das eigentliche Gel. Überprüfen Sie die Ausrichtung von imaging das übrig gebliebene Gel wieder nach dem Ausschneiden des Gel-Slices.
    6. Wiederherstellen Sie die 32P-Label Grundierung durch folgende Schritte 1.1.13, 1.1.16. Eine 0,4 mL-Tube berücksichtigen Sie 1,0 μl Lösung und verdünnen Sie die Grundierung mit 1 X TE-Puffer, die Radioaktivität von 1,0 μL auf ~ 100.000 cpm zu erhalten. Speichern Sie die gereinigten 32P-Label Grundierung bei-80 ° C bis RNA 2'-OH Modifikation Reaktion aber nicht länger als 4 Wochen.
  3. Kleines Molekül binden und RNA-2'-OH-Änderung
    1. Um vier Proben vorzubereiten, Hinzufügen einer 1,7 mL-Tube, Hitze bei 80 ° C für 2 min und Snap-Cool für mindestens 1 min auf Eis 8 Pmol RNA in 32 μL von 0,5 X TE-Puffer.
      Hinweis: Die folgende Gleichung verwenden, um die ungefähre Molekulargewicht von RNA zu berechnen: MW = (Anzahl der Basen) x 340 Da.
    2. Fügen Sie 8 μl 5 x Faltung Mischung mit 500 mM HEPES (pH 8,0), 20 mM MgCl2und 500 mM NaCl. Aliquoten 9 μl RNA-Mischung in jeder der vier PCR-Röhren und beschriften Sie sie #1-#4. Fügen Sie 1 μl 10 % DMSO in der #1 Röhre 1 μL konzentrierte kleines Molekül-Lösung (10 % DMSO) in #2, 1 μL verdünnt kleines Molekül-Lösung (10 % DMSO) in #3 und 1 μl Wasser in #4.
    3. Inkubieren Sie die PCR-Röhrchen bei 37 ° C in einem Thermocycler für 30 min.
    4. Direkt vor der 2'-OH-Änderung-Reaktion verdünnen Sie 1 μl der Stammlösung NAI (2 M) mit 3 μl DEPC-behandeltem Wasser um eine 0,5 M funktionierende Lösung zu erzielen. Ohne Verzögerung fügen Sie 1 μL des NAI arbeiten Lösung in Röhren #1, #2 und #3 und 1 μl 25 % DMSO in #4 hinzu. Inkubation bei 37 ° C in einem Thermocycler für 15 Minuten.
    5. Fügen Sie 100 μL der Elution/Niederschlag mischen (siehe Schritt 1.1.13 für Rezept), 2 μL von Glykogen (15 mg/mL), und übertragen Sie die Flüssigkeit in jedem PCR-Röhrchen in eine 1,7 mL-Tube. 0,34 mL eiskaltes 200-Nachweis EtOH hinzugeben (3 X Volumen) in jedes Rohr. Mix von vortexen für 5 s und Ort der Rohre in einem-80 ° C Gefrierschrank für mindestens 1 h.
      Hinweis: Beginnen Sie in diesem Zeitraum Einrichten der Sequenzierung Gel in Schritt 1.5.1 verwendet werden.
    6. Zentrifuge für 15 min bei 14.000 x g und 4 ° C. Den Überstand ohne zu stören das RNA-Pellet zu entfernen. Waschen der RNA-Pellet durch Zugabe von 80 % EtOH (0,5 mL pro Röhrchen), Wirbel für 15 s und Zentrifuge für 15 min bei 20.000 x g und 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand wieder.
      Hinweis: Optional, verwenden Sie einen Geigerzähler um das radioaktive Pellet Beibehaltung in der Röhre zu gewährleisten.
    7. Trocknen Sie die RNA-Pellet für 5 min. hinzufügen 9 μl RNase-freies Wasser an der Luft und mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 10 Mal pipettieren.
      Hinweis: Trocken Sie die RNA-Pellet nicht übermäßig. Alle Niederschlag wird voraussichtlich am Ende dieses Schrittes aufgelöst werden.
  4. Marker-Vorbereitung und Primer-Erweiterung
    1. Übertragen Sie die modifizierte RNA in 4 neue PCR-Rohre und beschriften Sie sie #1-#4 als zuvor. 4 zusätzliche PCR-Rohre fügen Sie 2 Pmol Steuerelement RNA in 7 μl DEPC-behandeltem Wasser hinzu und beschriften Sie #5 bis #8. Fügen Sie 2 μL radioaktiven Grundierung (Schritt 1.2.6) in alle acht Rohre. Erhitzen Sie zum Tempern bei 65 ° C für 5 min, dann sofort auf 4 ° C in den Thermocycler kühlen.
    2. Fügen Sie 4 μl 5 x RT Puffer (siehe Tabelle der Materialien), 1 μL Dithiothreitol (DTT, 0,1 M) und 1 μl dNTP-Mix (10 mM) für jedes der acht PCR-Rohre.
    3. #1-#4 Röhren 2 μl DEPC-behandeltem H2O hinzufügen. Fügen Sie 4 μL der DdATP (5 mM), 4 μL der DdTTP (5 mM) und 4 μL der DdCTP (5 mM) in Röhren #5 – #7, beziehungsweise. Rohr #8 1 μL der DdGTP (5 mM) und 3 μl DEPC-behandeltem Wasser hinzufügen. Pipette viermal um zu mischen.
    4. Bei 52 ° C für 1 min in den Thermocycler erhitzen. Fügen Sie 1 μl Reverse Transkriptase (siehe Tabelle der Materialien), dann mischen, indem Sie nach oben und unten viermal pipettieren. Inkubieren Sie die Reaktion bei 52 ° C für 20 min.
    5. Fügen Sie 1 μl 5 M NaOH in jedes der Rohre, die RNA Hydrolyseneigung. Erhitzen Sie die Röhrchen bei 95 ° C für 5 min.
    6. 5 μL 1 M HCl hinzufügen und wiederholen Sie die Ethanol-Niederschlag (Schritte 1.3.5 und 1.3.6), außer die Glykogen und flüssige Übertragung weglassen.
      Hinweis: 1.4.6 Ergebnissen in einer Unschärfe Region in der Mitte des Gels, bekannt als der "Salz Front" weglassen.
    7. An der Luft trocknen des DNA-Pellets für 5 min. Fügen Sie 10 μL von H2O und 10 μL von 2 X TBE-Harnstoff probieren Sie laden Puffer und Pipette nach oben und unten 10 Mal zu redissolve. Wärme bei 70 ° C für 5 min. legen die Rohre auf dem Eis vor der Verladung auf das Gel.
  5. Seitenanalyse
    1. Um eine 8 % Polyacrylamid-Gel Sequenzierung vorzubereiten, führen Sie die Schritte 1.1.6, 1.1.10 mit folgenden Änderungen: 100 mL 40 % Acrylamid/Bisacrylamide Lösung (29,1) verwenden, um eine 8 % Acrylamid-Lösung vorzubereiten, und verwenden Sie Sequenzierung Gel Glasplatten (z.B.46 x 57 cm) mit einem 0,4 mm Abstandshalter.
    2. Laden Sie 10 μl der Probe aus Schritt 1.4.7. Führen Sie das Gel mit 65 W für 2 h oder bis der unteren Farbstoff 3/4 des Gels erreicht hat.
      Hinweis: Speichern Sie den Rest der Proben bei-80 ° C für die Wiederholung bei Bedarf.
    3. Entfernen Sie die obere silikonisierte Glasplatte durch Entfernen des Abstandhalters und einen Spatel vorsichtig einfügen. Legen Sie ein Stück der großen Filterpapier um das Gel zu decken, und drücken Sie vorsichtig, um das Gel zur Einhaltung des Filterpapiers zu ermöglichen. Am unteren Ende ab, heben Sie das Filterpapier und entfernen Sie das Gel von der Glasplatte zusammen.
    4. Legen Sie das Gel zusammen mit dem Filterpapier auf ein Stück Plastikfolie, die groß genug ist um das ganze Gel (Filterpapier nach oben) zu decken. Übertragen Sie das Filterpapier/Gel/Plastic Wrap-Sandwich mit Filterpapier-Seite nach unten auf ein Gel trockener.
      Vorsicht: Um Material Kontaminationen zu vermeiden, verwenden Sie 3 bis 4 weitere Stücke von großen Filterpapier zwischen dem Gel-Sandwich und gel trockener.
    5. Trocknen Sie das Gel bei 70 ° C für 1 h mit einem Vakuum. Übertragen Sie das Gel-Sandwich auf einer Foto-gebleicht Phosphor Lagerung Bildschirm Kassette. Setzen Sie die Radioaktivität des Gels auf dem Bildschirm für 4 – 16 h.
    6. Legen Sie die Phosphor-Lagerung-Bildschirm auf ein bildgebendes Gerät und Scan mit mittlerer Auflösung (~ 30 min).
      Hinweis: Wenn eine Lächeln-wie Artefakt auf Gelbild vorhanden ist, verwenden Sie Korrektur Software (z.B.SAFA), um das Bild, um eine veröffentlichbare Qualität zu verarbeiten. Denken Sie daran, dass die standard-Marker-Spur 1 Nukleotid länger als die 2'-OH-Änderung-Bahnen ist.

(2) in der Zelle Form

  1. Besser gekleideteres design
    Hinweis: Im Gegensatz zu in-vitro-Form muss in Zelle Form keine Expressionskassette entwerfen. Jedoch Fahrgast-/optimale Grundierung sollte verwendet werden und müssen ausgewertet werden, bevor die Form experimentieren.
    1. Erzeugen Sie mindestens drei einzigartige Grundierung Paare durch eine Explosion-based Zündkapsel-Design-Tool (z.B., Primer-BLAST). Um Pre-mRNA in menschlichen Zellen zu studieren, wählen Sie das menschliche Genom (nicht Transkriptom aus) als eine Referenzdatenbank Primer Paar Spezifität überprüft Parameter. Wählen Sie die Größe der Amplifikate im Bereich von 200 – 1.000 Basenpaare (bp).
    2. Extrahieren Sie die genomische DNA aus ~ 106 Zellen mit einem Spin Spalte basierende Methode bei der Behandlung von RNase A und Protease K (siehe Tabelle der Materialien und verwenden die Hersteller-Protokoll). Normalisieren Sie die gereinigten genomischen DNA in 0,1 μg/μl TE-Puffer.
    3. PCR-Test mit dem Protokoll durchgeführt in den Schritten 1.1.1 und 1.1.2.
      Hinweis: Das gewünschte Grundierung Set sollte ein einzelnes Band auf einem 1,8 % Agarosegel ergeben.
  2. Handy-Vorbereitung und 2'-OH-Modifikation
    Hinweis: Um die Fülle der Pre-mRNA von Interesse zu erhöhen, ist eine Minigene mit der richtigen Reihenfolge unter Cytomegalovirus (CMV) Projektträger für die konstitutive Expression in die Wirtszellen transfiziert.
    1. Vorwärmen des Kulturmediums mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 X Antibiotika Mischung in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) bei 37 ° C. 293T Samenzellen bei 50 % Konfluenz 24 h vor der Transfektion in Kulturmedium. Wechseln Sie das Medium in 2 % FBS in DMEM ohne Antibiotika ~ 1 h vor der Transfektion.
    2. Fügen Sie 10 μg Minigene Plasmid in 100 μl reduzierte Serum-Medien (siehe Tabelle der Materialien) in 1 auch von einer 96-Well-Platte. Pipette die Lösung nach oben und unten vier Mal zu mischen.
    3. 40 μl Transfection Reagens hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien) in 100 μl reduzierte Serum-Medien in eine weitere Vertiefung der Platte. Pipette oben und unten viermal um zu mischen. In 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Die Transfektion Reagenz Aussetzung die gesamte Plasmid-Lösung hinzufügen. Pipette oben und unten viermal um zu mischen. Bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren.
    5. Fügen Sie die gesamte DNA / Transfection Reagens Mischung tropfenweise auf der Oberfläche des Mediums in die Schüssel. Inkubation bei 37 ° C für 6 – 12 h.
    6. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie vorsichtig einmal mit 5 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4, ohne CaCl2 und MgCl2, siehe Tabelle of Materials). Trypsinize der Zellen mit 3 mL Trypsin-Lösung. In 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    7. Klopfen Sie die Schale vorsichtig, um die Zellen von der Unterseite der Schale zu trennen. Trypsin mit 6 mL Kulturmedium zu neutralisieren. 300 X g für 4 min Zentrifugieren Sie und entfernen Sie das Medium.
    8. ~ 106 Zellen für jede Probe in 199 μL des Reaktionsmediums Aufschwemmen (1 % FBS in DMEM) und die Zellsuspension in eine 96-Well-Platte übertragen. Inkubieren Sie die Zellen mit 1 μl des zusammengesetzten funktionierende Lösung oder 1 μL von DMSO in alle drei Steuerelemente für 30 min bei 37 ° c
      Hinweis: Drei Kontrollproben sollten enthalten sein: DMSO-Steuerung mit NAI, denaturierte RNA mit NAI und NAI negative Kontrolle.
    9. Jede Probe, mit Ausnahme der denaturierenden Control (DC) RNA und NAI Negativkontrollen 10 μL von 2 M NAI hinzufügen. Pipette oben und unten viermal um zu mischen. Inkubation bei 37 ° C für 15 min. schütteln die Platten, die Zellen alle 5 min wieder auszusetzen.
    10. Übertragen Sie die Zellen in 1,7 mL Tuben und Zentrifuge bei 400 X g für 2 min ohne Verzögerung. Entfernen des Überstands ohne zu stören die Zelle Pellet.
    11. 0,4 mL Guanidinium-Thiocyanat zugeben (siehe Tabelle der Materialien). Wirbel für 15 s zu homogenisieren. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 5 min.
      Hinweis: Die Proben können bei-20 ° C gelagert werden, bis Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  3. RNA-Extraktion
    1. 0,2 mL Chloroform zu jeder der Guanidinium-Thiocyanat homogenisiert Proben hinzufügen. Vortex für 15 S. Inkubation bei Raumtemperatur 2 min. lang.
    2. Zentrifuge für 5 min bei 12.000 x g und 4 ° C. Die obere farblose wässrige Schicht enthält RNS. Übertragen Sie ~ 380 μL wässrige Lösung in eine neue 1,7 mL Tube.
      Vorsicht: Stören Sie nicht die Interphase um Kontaminationen zu vermeiden.
    3. 1,5 X Volumen von EtOH (~ 570 μL). Wirbel für 15 s zu mischen.
    4. 600 μl RNA-Mischung in eine RNA Isolierung Spin-Spalte zu übertragen (siehe Tabelle der Materialien). Zentrifugieren Sie bei 12.000 X g 15 S. verwerfen der Eluent. Wiederholen Sie diesen Schritt durch alle Flüssigkeit in der gleichen Spalte Spin zustande.
    5. Waschen Sie die Spalte mit 0,35 mL RW1 Puffer (siehe Tabelle der Materialien) durch spinning für 15 S. hinzufügen 80 μL der RNase-freie DNase ich in RDD Puffer (siehe Tabelle der Materialien). Bei Raumtemperatur für 20 min inkubieren.
      Hinweis: Es ist wichtig, alle DNA-Verunreinigungen zu entfernen.
    6. Anschließend waschen Sie die Spalte mit 0,35 mL RW1 Puffer und 0,6 mL 2 X RPE-Puffer (siehe Tabelle der Materialien) durch Spinnen für 15 s bei jedem Schritt. Trocknen Sie die Spalte durch die Spin-Spalte mit einer leeren Sammelrohr bei 12.000 X g für 1 min zentrifugieren.
    7. Die Mitte der Stütze 32 μl RNase-freies Wasser hinzufügen. Inkubieren 1 min. Zentrifuge bei 12.000 X g für 30 s ~ 30 μL gereinigtes RNA-Lösung zu erhalten. Setzen Sie die Proben bei-20 ° C, während der Verarbeitung der denaturierten Probe.
  4. Denaturierten RNS-Kontrolle-Vorbereitung
    1. Platz 30 µL RNA Probe für DC in 1,7 mL Kunststoffhülse auf Eis. Fügen Sie 50 μL der Formamid und 15 μl des DC-Puffer mit 300 mM HEPES (pH 8,0) und 25 mM EDTA in die Röhre.
    2. Wärme an die RNA bei 95 ° C für 1 min. schnell denaturieren hinzufügen 5 μL der NAI-Stammlösung (2 M), dann Streifen zweimal zu mischen und legen Sie den Schlauch wieder auf den Heizblock. Bei 95 ° C für eine zusätzliche 1 min inkubieren, dann sofort das Rohr auf Eis gelegt.
    3. 0,4 mL Guanidinium-Thiocyanat hinzugeben. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1–2.3.4.
    4. Waschen Sie die Spalte mit 0,6 mL 2 X RPE-Puffer (siehe Tabelle der Materialien) durch Spinnen für 15 s bei jedem Schritt. Trocknen Sie die Spalte durch die Spin-Spalte mit einer leeren Sammelrohr bei 12.000 X g für 1 min zentrifugieren.
    5. Die Mitte der Stütze 32 μl RNase-freies Wasser hinzufügen. Inkubieren 1 min. Zentrifuge bei 12.000 X g für 30 s ~ 30 μL der wiederhergestellten DC RNA-Lösung zu erhalten.
  5. Primer-extension
    1. Normalisieren der RNA-Lösung von 2.3.7 und 2.4.5 in 0,5 μg/μL mit RNase-freies Wasser. Frisch bereiten Sie 30 mM MnCl2 Lösung aus MnCl2∙4H2O Pulver zu.
    2. Übertragen Sie 9 μl RNA-Lösung für jede Probe in ein PCR-Streifen. Fügen Sie 1 μl 10 mM dNTP und 1 μl 2 μm gen-spezifische Primer (APS) in jedem Röhrchen. Pipette oben und unten viermal um zu mischen. Bei 65 ° C für 5 min in einem Thermocycler inkubieren und setzen auf Eis für > 1 min.
      Hinweis: Alternativ kann 1 μl von einer zufälligen Nonamer Ersatz des APS verwendet werden.
    3. In jedem PCR-Röhrchen, fügen Sie eine Mischung aus 2 μl 10 x RT Puffer (siehe Tabelle der Materialien), 4 μL 30 mM MnCl2und 2 μL von 100 mM DTT. Pipette auf und ab 4 X zu mischen. Bei 42 ° C für 2 min inkubieren.
    4. Fügen Sie 1 μl Reverse Transkriptase (siehe Tabelle der Materialien). Pipette auf und ab 4 X zu mischen. Bei 42 ° C in einem Thermocycler für 3 h inkubieren.
  6. Bibliothek-Vorbereitung und Sequenzierung der nächsten generation
    1. Einrichten einer PCR-Reaktion durch Zugabe von 1 μl DNA-Polymerase, 5 μL 10 x DNA-Polymerase-Puffer (siehe Tabelle der Materialien), 2 μL von DMSO, 1,5 μL für jede der Primer (10 μM), 34 μL von H2O und 5 μl cDNA aus Schritt 2.5.4.
    2. Richten Sie den Thermocycler folgendermaßen: Stufe 1) 95 ° C für 2 min; Stufe 2) 95 ° C für 30 s; Stufe 3) 60 ° C für 30 s; Stufe 4) 68 ° C für 30 s; Etappe 5) Schleife zurück zum Schritt 2 für 30 Zyklen; 6. Etappe) 68 ° C für 3 min; und Stufe 7) unendlich bei 4 ° C bis zum folgenden Schritt halten.
    3. Reinigen Sie die Amplifikate mit 1,8 % Agarose-Gel.
      Hinweis: Die PCR-Band erscheint als ein single-Band auf dem Gel.
    4. Erstellen der Bibliothek mit standard Fragmentierung und Ligation Methoden der Literatur6,26gegründet.
    5. Reihenfolge auf eine Next Generation Sequencing-Ausrüstung mit 1 x 75 Einend-liest etwa 10 Millionen erzeugen liest pro Probe.
    6. Analysieren Sie die Ergebnisse mit ShapeMapper und SuperFold Software Pakete, die von den Wochen entwickelte Gruppe26.

Ergebnisse

Wir bewiesen vorher, dass eine RNA-Spleißen Modulator, SMN-C2, interagiert mit AGGAAG Motiv auf Exon 7 des SMN2 Gens Pre-mRNA und Form verwendet, um die RNA strukturelle Änderungen im Beisein von SMN-C26zu beurteilen. Die Bindungsstelle des SMN-C2 unterscheidet sich von der FDA zugelassene antisense Oligonucleotide (ASO) für SMA, Nusinersen, die bindet und blockiert die intronischen Spleißen Schalldämpfer (ISS) Intron 727,

Diskussion

In in-vitro-Form ist es wichtig, qualitativ hochwertige homogene RNA-Vorlage verwenden. T7-Transkription, liefert jedoch oft heterogenen Sequenzen36. Insbesondere sind Sequenzen mit ±1 Nukleotid am 3'-Terminus mit nicht zu vernachlässigenden Erträge36 in der Regel schwierig, durch Polyacrylamid-Gel Reinigung entfernt werden. Heterogene RNA-Vorlage kann dazu führen, dass mehr als ein Satz des Signals in die Sequenzierung Gel Profilierung der Grundierung Erweiterungsprodu...

Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den NIH R01-Zuschuss (NS094721, K.A.J.) möglich.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
DNA oligonucleotideIDTgBlock for >200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master MixThermo FisherF566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kitTakara740609.50
MegaScript T7 transcription kitThermo FisherAM1333Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated waterThermo Fisher750023
2x TBE-urea sample bufferThermo FisherLC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)Bio-Rad1610146
10x TBE bufferThermo Fisher15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter UnitThermo Fisher166-0045
KimwipeKimberly-Clark34133
TEMEDThermo Fisher17919
SYBR-Safe dyeThermo FisherS33102
6% TBE-urea mini-gelThermo FisherEC6865BOX
ChemiDocBio-Rad
T4 PNKNEBM0201S
γ-32P-ATPPerkin ElmerNEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying ScreenGE HealthcareRPN1669calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screenMolecular DynamicsBAS-IP MS 3543 E
Amersham TyphoonGE Healthcare
NAI (2M)EMD Millipore03-310
GlycoBlueThermo FisherAM9515
SuperScript IV Reverse TranscriptaseThermo Fisher18090010Contains 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM)Thermo FisherR0192
ddNTP set (5 mM)SigmaGE27-2045-01
large filter paperWhatman1001-917
Gel dryerHoeferGD 2000
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51104Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34Addgene72287
Heat inactivated FBSThermo Fisher10438026
Pen-StrepThermo Fisher15140122
Opti-MEM IThermo Fisher31985062
FuGene HDPromegaE2311
TrpLEThermo Fisher12605010
DPBS without Ca/MgThermo Fisher14190250
TRIzolThermo Fisher15596018
RNeasy mini columnQiagen74104Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase SetQiagen79254Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamideThermo FisherAM9342
MnCl2•4H2OSigma-AldrichM3634
random nonamerSigma-AldrichR7647
SuperScript First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher11904-018Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerseThermo Fisher12344024
NextSeq500Illumina
NucAway columnThermo FisherAM10070for desalting purpose

Referenzen

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