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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Pathophysiologie der proliferativen diabetischen Retinopathie mit Patienten abgeleitet, chirurgisch herausgeschnitten, fibrovaskulärem Gewebe für dreidimensionale nativen Gewebe Charakterisierung und Ex-Vivo-Kultur zu studieren. Diese ex-Vivo-Kultur-Modell ist auch für Tests oder Entwicklung neuer Behandlungsmethoden.

Zusammenfassung

Diabetischer Retinopathie (DR) ist die häufigste mikrovaskuläre Komplikation des Diabetes und eines der führenden Ursachen für Erblindung im erwerbsfähigen Alter Erwachsene. Keine aktuellen Tiermodellen für Diabetes und Sauerstoff-induzierte Retinopathie entwickeln die Fullrange-progressive Veränderungen in menschlichen proliferative diabetische Retinopathie (PDR) manifestiert. Daher hat Verständnis für die Krankheit Pathogenese und Pathophysiologie stützte sich weitgehend auf den Einsatz von histologischen Abschnitte und Glaskörper Proben in den Ansätzen, die nur stationäre Informationen über die beteiligten pathogenen Faktoren. Erhöhung der Beweis zeigt an, dass dynamische Zell-Zell und Zelle-extrazelluläre Matrix (ECM) Interaktionen im Zusammenhang mit der dreidimensionalen (3D) Mikroumgebungen essentiell für die mechanistischen und funktionellen Studien zur Entwicklung der neu Behandlungsstrategien. Daher vermutet wir, dass die pathologische fibrovaskulärem Gewebe chirurgisch herausgeschnitten aus Augen mit PDR genutzt werden könnte, um zuverlässig die zellulären und molekularen Mechanismen dieser verheerenden Krankheit zu entwirren und das Potenzial für Roman klinischen testen Interventionen. Zu diesem Zweck entwickelten wir eine neuartige Methode für 3D ex-Vivo-Kultur der chirurgisch herausgeschnitten Patienten abgeleitet fibrovaskulärem Gewebe (FT), die als ein Modell der menschlichen PDR Pathophysiologie dienen wird. Die FTs in Explantaten zerlegt und eingebettet in Fibrin-Matrix für ex-Vivo-Kultur und 3D Charakterisierung. Vollständig-hängen Immunfluoreszenz der native FTs und Endpunkt Kulturen ermöglicht gründlichen Untersuchung der Zusammensetzung und mehrzelligen Prozesse, Hervorhebung der Bedeutung des 3D Gewebe-Ebene Charakterisierung für die Aufdeckung relevanten Merkmale der PDR Pathophysiologie. Dieses Modell ermöglicht die gleichzeitige Bewertung der molekularen, zellulären/Gewebe Prozesse und Behandlung Antworten im Zusammenhang mit komplexen dynamischen biochemischen und physikalischen Wechselwirkungen innerhalb der PDR Gewebearchitektur und Mikroumgebung. Da dieses Modell PDR Pathophysiologie rekapituliert, wird es auch zum Testen oder Entwicklung neuer Behandlungsmethoden zugänglich sein.

Einleitung

DR ist eine schweren okulären Komplikation bei Diabetes, eine Krankheit, die in den letzten drei Jahrzehnten1enorme Ausmaße angenommen hat. Zwanzig Jahre nach Diagnose, praktisch jeder Patient mit Diabetes Typ 1 und 60 % der Patienten mit Typ 2 Diabetes vorliegenden Anzeichen von Retinopathie, machen Diabetes per se eine der führenden von Blindheit im Alter Erwachsene2arbeiten Ursachen. Nach dem Stand der mikrovaskuläre Degeneration und ischämischen Schäden ist DR in nicht-proliferative DR (PDR) und proliferative DR (PDR) eingeteilt. Die Ende-Stadium der Erkrankung, PDR, zeichnet sich durch Ischämie und Entzündung-induzierte Neovaskularisation und fibrotische Reaktionen an der vitreoretinalen Grenzfläche. In unbehandeltem Zustand werden diese Prozesse zur Erblindung aufgrund neovaskulären Glaukoms3,4, Glaskörperhämorrhagie, Netzhaut Fibrose und Verwindungskräfte Netzhautablösung führen. Trotz der jüngsten Fortschritte gezielt aktuelle Behandlungsmöglichkeiten nur DR Bühnen, darunter diabetischen Makulaödems und PDR, wenn Netzhaut Schaden bereits folgte hat. Darüber hinaus profitiert ein großer Teil der DR-Patienten nicht von aktuellen Behandlung Rüstzeug, zeigt einen dringenden Bedarf an verbesserten Therapien4,5,6.

Mehrere andere ichn Vivo Krankheit/Entwicklungsstörungen Modelle und diabetischen Tiermodell bisher entwickelt worden, aber keiner von ihnen rekapituliert das gesamte Spektrum der pathologischen Funktionen im menschlichen PDR7,8beobachtet. Darüber hinaus deutet auf zunehmende Beweise Behandlung Antworten der ECM Zusammensetzung als auch die räumliche Anordnung und Interaktion zwischen der zellulären und azellulärer Mikroumgebung9eng verbunden sind. Wir wollten daher um eine klinisch relevante Modell der menschlichen Laos zu entwickeln, durch die Nutzung der FT pathologischen Materials, das häufig aus einer Vitrektomie im Rahmen des chirurgischen Managements von PDR10Augen herausgeschnitten wird.

Dieses Manuskript beschreibt das Protokoll für die 3D ex-Vivo-Kultur und Charakterisierung der chirurgisch herausgeschnitten, PDR Patienten gewonnenen pathologischen FT. Die hier beschriebene Methode hat in einer kürzlich erschienenen Publikation verwendet wurden, die erfolgreiche Dekonstruktion der native 3D PDR Gewebe Landschaft und Zusammenfassung der Merkmale des PDR Pathophysiologie einschließlich angiogenen und fibrotische Reaktionen die abnorme nachgewiesen vaskulären Strukturen11. Dieses Modell zeigte auch, dass neue Features, die leicht von histologischen Dünnschliffe, wie räumlich geschätzt werden können nicht Apoptose und Proliferation sowie vaskuläre Inselchen Bildung11beschränkt. Glasigen Flüssigkeit wurde erfolgreich von anderen 3D endotheliale Sphäroid Kulturen, seine angiogenen Potenzial zu bewerten und die Wirksamkeit von Angiostatic Moleküle12eingesetzt. In Kombination mit einer in-vitro- 3D lymphatische Endothelzellen (LEC)-Sphäroid sprießen Assay mit PDR Glaskörper als Stimulans deckte unser Modell der Beitrag der beiden lösliche Glaskörperblutung sowie lokale Hinweise innerhalb des neovaskulären Gewebes zur Faktoren noch schlecht verstandenen LEC-Beteiligung an PDR Pathophysiologie3,11. Bei der Verwaltung der PDR ist vitreoretinalen Chirurgie routinemäßig durchgeführt und zugleich anspruchsvolle Verfahren. Wie chirurgische Instrumentierungen und Techniken kontinuierliche Weiterentwicklung und Raffinesse erleben, rechtzeitig und konservativen Entfernung von fibrovaskulärem proliferative Muster verbessert nicht nur die Vision Ergebnis, sondern auch von unschätzbarem Wert Gewebematerial für die Untersuchung der PDR Pathophysiologie und Behandlung Reaktionen in komplexen translationale Aspekte des lebender menschlicher Gewebe Mikroumgebung.

Protokoll

Diese Forschung wurde von der Institutional Review Board und Ethik-Ausschuß der Helsinki University Hospital genehmigt. Jeder Patient wurde unterschriebene Einverständniserklärung eingeholt.

1. Vorbereitung der Lösungen, Medien und Geräte

  1. Bereiten Sie die folgende Ausrüstung vor der Entnahme des fibrovaskulärem Gewebes (FT), schnelle Bearbeitung zu gewährleisten.
    1. Steril-Autoklav zwei Mikrodissektion Pinzette.
    2. Bereiten Sie 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch auflösen 1 vorgewogene PBS Tablette (0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO4-3) in 900 mL entionisiertem Wasser und unter Rühren auflösen. Passen Sie das Volumen des Wassers bis zu 1 L und steril-Autoklaven die fertige Lösung. Shop bei RT
    3. Die oben genannten Lösung und Ausrüstung in einem Korb, zusammen mit einem Einweg-steriles Skalpell, einer Kulturschale steril 6-cm-Zelle und fünf steril 12-Well Kultur Zellplatten zu sammeln.
  2. Bereiten Sie eine 6 mg/mL Fibrinogen Lösung in Hanks ausgewogen Salz Lösung (HBSS) durch Auflösen von 30 mg von Plasminogen-abgereicherte menschlichen Fibrinogen in 5 mL HBSS, mit einem 50 mL Schlauch eingetaucht in ein Wasserbad bei 37 ° C für mindestens 1 h.
    Hinweis: Diese Lösung kann vor Gebrauch im Wasserbad (37 ° C) für 7 h (maximal 10 h) gehalten werden.
  3. Vorbereiten die Ex Vivo Kulturmedium durch Zugabe von 5 % fetalen Kälberserum (FCS) oder 5 % Humanserum, Endothelzellen Wachstum Zuschlag von 0,4 % 10 ng/mL rekombinanten menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor, 1 μg/mL Hydrocortison und 50 μg/mL Gentamycin, im Handel erhältlich Endothelzellen Wachstumsmedium und halten Sie im Wasserbad bei 37 ° C bis zur Verwendung. Lagerung bei 4 ° C für bis zu einem Monat.

2. fibrovaskulärem Gewebe Dissektion

  1. Sammle das fibrovaskulärem Gewebe (FT), das herausgeschnitten worden von menschlichen Themen in der Trans-konjunktivale Microincision vitreoretinalen Chirurgie, von 23 oder 20 Gauge drei Anschlüssen Pars Plana Vitrektomie als Bestandteil der vitreoretinalen chirurgische Behandlung der PDR.
    Hinweis: Die FT ist mit Segmentierung und Delamination, schneiden, wenn nötig mit Microscissors und aus dem Glaskörper Hohlraum mit intraokularen Ende packenden Mikrozangen entfernt von erfahrenen vitreoretinalen Chirurgen herausgeschnitten. Äußerste Sorgfalt muss, intakt, unbeschädigte FT zu entfernen, ohne dass Schäden an okulären Strukturen einschließlich der Sehnerv oder zeitliche vaskulären Arcade-wo das pathologische neovaskulären Gewebe am häufigsten befindet werden. Die Größe der ausgeschnittenen Gewebe ist variabel, in der Regel zwischen 3 und 50 mm2.
  2. Halten Sie die FT in einem 6 cm Zelle Kulturschale oder 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL sterile PBS auf nassem Eis platziert, und übertragen Sie es sofort zum Labor für die Verarbeitung zu recherchieren.
    Hinweis: Es ist wichtig, dass die Forschergruppe (Laboreinrichtungen) physisch in der Nähe von Krankenhaus-OP-Saal (OR) sind die Transferzeiten von der kleinen ausgeschnittenen FT zu minimieren. In diesem Fall die Übertragung dauert weniger als 5 Minuten und der Explantate sind eingebettet in Fibrin in der Regel in 1-1,5 h (maximal 2 h) nach operativer Entfernung. Die Auswirkungen der längere Übertragungszeiten auf die 3D Kultur hätte geprüft werden müssen.
  3. Legen Sie die FT in der 6-cm-Zelle Kulturschale mit 1 mL PBS bei Raumtemperatur (RT, 25 ° C) und Abrufen von Bildern des Gewebes mit einem invertierten Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem Objektiv 5 X.
    Hinweis: Bilder sind für die qualitative Bewertung und Dokumentation erworben. Es werden die Gewebe Größe, Dichte und allgemeine Zusammensetzung (z. B. vaskulären Strukturen) zu beobachten.
  4. Schneiden Sie die FT in ~ 1 mm2 Stück unter eine aufrechte Dissektion Stereomikroskop, ein steriles Skalpell und Mikrodissektion Pinzette. Halten Sie das Gewebe gut getaucht in PBS mit einer Pinzette Mikrodissektion und führen Sie klare Schnitten mit einem sterilen Skalpell. Vermeiden Sie reißen FT, die native fibrovaskulärem Strukturen verändern würde.
  5. Platzieren Sie jedes einzelne Stück in einen Brunnen von einer 12-Well Kultur Zellplatte, enthält 1 mL sterile PBS.
    Hinweis: Bei Bedarf sanft verteilt die FT auf den Teller, einer Pinzette Mikrodissektion, vor der Durchführung von Schnitten.

3. Casting aufrecht Fibrin Gel Tröpfchen für die Charakterisierung von Native FT und Ex-Vivo-Kultur

  1. Steril-Filter die bereit Fibrinogen-Lösung in Schritt 1.2 mit einem 0,22-μm-Filter montiert in einer 10 mL Spritze vorbereitet.
  2. Prepare Aliquote der Fibrinogen-Lösung (25 μL pro 1,5 mL-Tube) und halten Sie bei RT. Prepare ein Aliquot für Fibrin gel / jedes FT Stück erhalten, nachdem das sezieren, und ein paar zusätzliche Aliquote zum Testen des Fibrins gel-Bildung.
  3. Bereiten Sie eine Lösung mit 4 Einheiten/mL Thrombin und 400 μg/mL Aprotinin, HBSS jenseits TA Lösung genannt, und halten Sie bei RT. Prepare so viel TA-Lösung je nach Bedarf, abhängig von der Anzahl der Stücke nach Dissektion erhalten (25 μL der TA-Lösung wird verwendet für jede FT/fibrin-Gel), und einen zusätzlichen Betrag (z. B. 250 μl) zum Testen der Fibrin-Gelbildung und um sicherzustellen, dass genügend Lösung in Gießen von Fibrin Gel Tröpfchen verfügbar ist.
    Hinweis: Thrombin ist erforderlich für Fibrin Polymerisation, während Aprotinin, um Abbau von Fibrin Gels zu verhindern durch zelluläre Proteasen, ausgedrückt durch das FTs13,14hinzugefügt wird.
  4. Testen Sie das Timing der Gelbildung Fibrin: 25 μL der TA-Lösung für die regelmÄÑig 25 μL Fibrinogen Lösung vorbereitet im Schritt 3.2 hinzufügen und mischen in der Röhre durch pipettieren und verzichten in der Kulturschale 6 cm Zelle mit einem anderen Pipette legen Sie auf 50 μL, , eine aufrechte Tröpfchen bilden.
    Hinweis: Das Fibrin Gelbildung in ~ 1 min erfolgen. Wenn dies mehr als 1,5 min dauert, kann die Konzentration von Thrombin in der TA-Lösung im Schritt 3.3 vorbereitet durch Zugabe von mehr Thrombin-Stammlösung erhöht werden. Ein Zehntel der ursprünglich verwendeten Volumen von Thrombin-Stammlösung können hinzugefügt werden, wiederholt, bis das Fibrin Gelbildung innerhalb 1,5 min auftritt. Die Gelbildung Fibrin ist entscheidend für die Dreidimensionalität der Kultur, verhindert schnelle Gel (innerhalb 1,5 Minuten) FT Stück sinken auf den Boden des Fibrin Gels, und kommen so in Kontakt mit der 2D Kunststoffoberfläche der Zelle Kultur-Platte, die 2D Zelladhäsion und Auswuchs führen kann.
  5. Legen Sie ein FT-Stück in der Mitte des einen Brunnen von einer 24-Well-Platte mit einer sterilen Pinzette und entfernen Sie alle überschüssigen PBS Pipettieren mit einer 0,5-10 μl Pipette Saugkraft auf die FT zu vermeiden. Im Fall des Gewebes klebt an der Pinzette, eine zusätzliche Pinzette verwenden, um die Platzierung des Stückes Gewebe auf der Platte zu unterstützen.
    Hinweis: FT/Fibrin Gele können auch auf 48-Well-Platte zu verringern die Verwendung von Reagenzien gewirkt werden. Dies ist jedoch schwieriger, wenn der Raum begrenzt ist und Fibrin wird bei Kontakt mit der Wand gut verteilt.
  6. Die 25 μL Fibrinogen Lösung regelmÄÑig im Schritt 3.2 25 μL der TA-Lösung hinzu, und 50 μL Mix in der Röhre festgelegten mit einem anderen Pipette pipettieren. Verzichten auf das FT-Stück auf der Platte gut aufgestellt und Pipette nach oben und unten 2 - 3 Mal um die FT-Stück in das aufrecht Tröpfchen, der FT eine 3D umgebende Matrix bereitzustellen sind.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die FT nicht beim Pipettieren abgesaugt wird und dass sich keine Luftblasen bilden. Achten Sie auch mischen, Befreiung und Pipettieren schnell ausgeführt werden wie das Fibrin innerhalb 1,5 Minuten Gelbildung, wie in Schritt 3.4 getestet. Wenn Fibrin Gels auf 48-Well-Platte gießen, verwenden Sie stattdessen 20 μL der Fibrinogen-Lösung und 20 μL der TA-Lösung.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 für die FT-Stücke.
  8. Ermöglichen Sie die Fibrin-Gele durch Inkubation der Platten in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2zu festigen.
  9. Nach 0,5-1 kippen h, Check, die das Fibrin Gel sorgfältig komplett durch entsteht der Plattenrandes. Fahren Sie mit Schritt 3.10, wenn das Gel nicht bewegt, wenn die Platte gekippt wird, darauf hinweist, dass das Fibrin Gelbildung abgeschlossen ist.
  10. Überlagern der FT/Fibrin Gels mit ex-Vivo-Nährmedium (600 μl/Well in 24-Well-Platte) oder 300 μl/Well in 48-Well-Platte mit 100 μg/mL Aprotinin ergänzt. Pipette das Medium leicht durch drop-wise Dispens.
    Hinweis: Hier, Aprotinin dient zum Abbau von Fibrin Gels zu verhindern durch zelluläre Proteasen, ausgedrückt durch das FTs13,14. Der ex-Vivo Nährmedium kann zusätzlich mit rekombinanten Wachstumsfaktoren wie VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ ergänzt werden (siehe Tabelle der Materialien)11.
  11. Setzen Sie die FT ex Vivo Kultur Platte wieder in 37 ° C, 5 % CO2 Zelle Kultur Inkubator und Kultur für den gewünschten Zeitraum (z.B.2 - 18 Tage, mehr Kultur, die Perioden geprüft werden müssen). Ersetzen Sie alle drei Tage 50 % des Mediums mit frischen ex Vivo Kulturmedium.

4. "in Matrix" Imaging

  1. Abrufen von Bildern von der FT ex Vivo Kulturen am selben Tag (Tag 0) und in festgelegten Intervallen (z. B. jeden zweiten Tag), mit einem invertierten Epifluoreszenz-Mikroskop, um die 3D Wachstum folgen.
    Hinweis: Die Bilder können für die Quantifizierung von FT Auswuchs als die Gesamtlänge der beiden senkrechten Durchmesser über die modellabhängigen11verwendet werden.

(5) native FT und Ex-Vivo-Kultur-Endpunkt

Hinweis: Die FT/Fibrin-Gele können ex Vivo für den gewünschten Zeitraum (FT ex Vivo Kulturen) kultiviert oder am selben Tag (native FT) für native FT Charakterisierung11behoben.

  1. Befestigen Sie die native FT oder FT ex Vivo Kulturen durch den Austausch des Kulturmediums mit 1 mL/gut 4 % Paraformaldehyd in PBS-Lösung für 1 h bei RT Fix für die native FT/Fibrin Gels, 0,5-1 h nach Zugabe der Ex Vivo Kultur Medium (wenn die Fibrin-Gele nicht im Medium getränkt worden, Fixierung wird beschädigt werden).
    Hinweis: Führen Sie diesen Schritt unter Abzug wie Paraformaldehyd ätzend, giftig und karzinogen ist.
  2. Spülen Sie die FT/Fibrin Gele mit dreimaligem 5 min waschen in PBS (2 mL/Na).
  3. Ersetzen der PBS mit 2 mL/auch von PBS mit 0,02 % Natriumazid und die feste Fibrin Gels bei 4 ° C bis zur Weiterverarbeitung zu lagern. Versiegeln Sie die Platten mit Paraffin Film um sicherzustellen, dass die FT/Fibrin-Gele nicht eingelagert trocken.
    Hinweis: Führen Sie diesen Schritt unter Abzug als Natriumazid giftig ist.

6. vollständig-hängen Immunfluoreszenz-Färbung

Hinweis: Dieses Protokoll dauert 5 Tage und kann unterbrochen werden, mit Übernachtung Inkubationen wo nicht anders vermerkt. Lassen Sie sich nicht das Fibrin Gels jederzeit trocken. Alle Schritte werden bei RT ausgeführt, sofern nicht anders angegeben.

  1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor Beginn der Färbung Protokolls.
    1. Post-Fixierung Lösung: bereiten Sie 50: 50-Aceton: Methanol-Lösung durch gleiche Mengen von Aceton und Methanol mischen (z. B. 50 mL). Shop bei-20 ° C. Bereiten Sie diese Lösung, spätestens am Tag vor der Färbung. Diese Lösung kann wieder bei-20 ° C gelagert werden und für spätere Färbungen verwendet werden.
      Hinweis: Bereiten Sie diese Lösung in Abzug wie Aceton und Methanol entzündlich und gesundheitsschädlich sind.
    2. Blockieren Lösung: bereiten Sie eine 15 % fetalen bovine Serum (FBS), 0,3 % Octyl Phenol Nonylphenolethoxylat Lösung mit PBS-Puffer von ersten Hinzufügen von 15 % FBS PBS. Fügen Sie Octyl Phenol Nonylphenolethoxylat hinzu und unter Rühren Sie auflösen. Shop bei 4 ° C.
      Hinweis: Diese Lösung kann in großen Mengen im Voraus vorbereitet werden in 15 mL Aliquote bei-20 ° C gelagert und vor dem Gebrauch am Tag wenn die Färbung Protokoll gestartet wird aufgetaut. Verwenden Sie ein frisch zubereitetes oder frisch aufgetauten Aliquote für jede Färbung Protokoll.
    3. Waschlösung: bereiten Sie 1 L des PBS mit 0,45 % Octyl Phenol wurde durch Zugabe von 4,5 mL Octyl Phenol Nonylphenolethoxylat auf 995,5 mL PBS ergänzt. Unter Rühren auflösen. Shop bei RT
  2. Heben Sie die Tropfen vorsichtig von der Platte mit einem Edelstahl kantig Spatel. Trennen Sie das Droplet zuerst die Kanten vor dem Anheben der Mittelpunktes, und übertragen auf einen Brunnen 12-Well-Platte mit 1 mL PBS.
    Hinweis: Führen Sie Post-Fixierung, Waschungen und blockierende Schritte in dieser Plattenformat.
  3. Nach dem Beheben der Tröpfchen mit 1 mL eiskaltes 50: 50 Aceton: Methanol-Lösung für ~ 1 min (die Grenze der Tropfen leuchtet weiß).
    Hinweis: Führen Sie diesen Schritt unter Abzug wie Aceton und Methanol gesundheitsschädlich sind.
  4. Spülen Sie mit 3-5 Wäschen in 2 mL PBS (die Tröpfchen in der PBS-Lösung sinkt wenn Rehydratation abgeschlossen ist).
    Hinweis: Berühren Sie die Tropfen mit der Pipettenspitze wie nach Post-Fixierung, klebrigen Kunststoff sind. Im gesamten Protokoll vermeiden Sie Absaugnadeln nach dem Update, Antikörper, blockieren und Waschlösungen durch Absaugen, wie dies kann beschädigen oder die Tröpfchen zerstören. Stattdessen die Platte kippen und Lösungen mit einer 500-5.000 μl Pipette vorsichtig entfernen.
  5. Zentrifugieren Sie die blockierende Lösung für 15 min bei 21.000 x g und 4 ° C, um Ablagerungen zu entfernen.
    Hinweis: Die Lösung kann in 1,5 mL Röhrchen für Zentrifugation regelmÄÑig sein. Nicht verwendete Lösung kann bei 4 ° C gelagert und für alle relevanten Schritte verwendet werden.
  6. Inkubieren Sie die Tropfen in 500 μl blockiert Lösung für 2 h bei RT
    Hinweis: Um das Volumen der Blockierung eingesetzte Lösung zu reduzieren, die Platte kann gekippt werden auf einem Träger und weniger als 300 μl der Lösung/Droplet eingesetzt werden.
  7. Bereiten Sie die Primärantikörper Mischung (mindestens 30 μL/Tropfen) bei entsprechenden Verdünnung in blocking-Lösung und Zentrifuge für 15 min bei 21.000 x g und 4 ° C.
  8. Übertragen Sie die Tropfen in Runde (U)-96-Well-Platte mit einem Spatel Runde Kanten unten, und mit mindestens 30 μL/Tröpfchen der Primärantikörper Mischung über Nacht bei 4 ° c inkubieren
  9. Am folgenden Tag, Übertragung der Tröpfchen in 12-Well Platte mit 2 mL Lösung/gut waschen wäscht mit drei 5 min spülen und dann mit neun 30 min wäscht. Lassen Sie die letzten Waschen (2 mL) über Nacht bei 4 ° C.
  10. Am nächsten Tag spülen Sie dreimal mit PBS und übertragen die Tröpfchen in Runde (U)-96-Well-Platte unten.
  11. Während der Waschgänge bereiten Sie die entsprechenden Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper Mischung (verdünnt 1: 500, mindestens 30 μL/Tropfen) in blocking-Lösung und Zentrifuge für 15 min bei 21.000 x g und 4 ° C.
  12. Die Tröpfchen in einer Runde zu übertragen (U)-96-Well-Platte mit einem Spatel Runde Kanten unten und inkubieren Sie mit mindestens 30 μl der Sekundärantikörper Mischung, 4 h bei RT, vor Licht geschützt werden.
    Hinweis: Führen Sie alle nachfolgenden Inkubationen und Waschschritte vor Licht geschützt werden.
  13. Übertragen Sie die Tropfen in 12-Well-Platte mit 2 mL Lösung/Brunnen mit einem runden Kanten Spatel, Spülen mit drei 5 min wäscht zuerst waschen und dann mit vier 30 min wäscht. Lassen Sie die letzten Waschen (2 mL) über Nacht bei 4 ° C.
  14. Am nächsten Tag spülen Sie die Gele mit fünf 30 min wäscht und dann dreimal mit PBS. Lassen Sie die letzten Waschen (2 mL) über Nacht bei 4 ° C.
  15. Am Folgetag, übertragen die Tröpfchen in einer Runde (U)-unten 96-Well-Platte mit einer Runde Kanten Spachtel und Gegenfärbung Kernen durch Inkubation mit 10 μg/mL Hoechst nuklearen Fleck (mindestens 30 μL/Tropfen) für 30 Minuten bei RT
    Hinweis: Montage Medium ergänzt mit 4', kann 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Kerne Gegenfärbung alternativ verwendet werden. In diesem Fall werden diese Schritt und Schritt 6.16 übersprungen ausgehend direkt zu Schritt 6.17.
  16. Übertragen Sie die Tropfen in 12-Well-Platte mit 2 mL PBS/Brunnen mit einem Spatel Runde Kanten und waschen Sie dreimal mit PBS.
  17. Montieren Sie die Tröpfchen auf Objektträger wie folgt:
    1. Eine schmale Schicht schnell aushärtende Eindeckmedium am Rande einer quadratischen 22 x 22 mm-Deckglas und ~ 1 Minute lang trocknen lassen. Führen Sie diesen Schritt für jeden Tropfen einzeln, um übermäßige Verhärtung des Mediums Montage zu vermeiden.
      Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in Abzug, da die schnell aushärtende Eindeckmedium gesundheitsschädlich ist.
    2. Das Tröpfchen durch Eintauchen in einen Brunnen von einem 12-Well-Platte mit 2 mL entionisiertem Wasser spülen und übertragen auf einen Objektträger mit einem Spatel Runde Kanten. Entfernen Sie überschüssiges Wasser mit ein kleines Stück Küchenpapier.
    3. 15 μl nicht aushärtende antifade Eindeckmedium auf das Droplet zu verzichten.
      Hinweis: Alternativ, wenn nukleare Hoechst-Fleck nicht benutzt wurde, Montage Medium mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) einsetzbar.
    4. Sanft positionieren Sie das Deckglas mit den schnell aushärtende Eindeckmittel mit Blick auf die mikroskopische Folie über das Tröpfchen zu und lassen Sie zu begleichen.
      Hinweis: Das schnell aushärtende Medium wird zur mikroskopischen Folie kleben und bewahren Sie das Droplet.
  18. Wiederholen Sie Schritt 6.17 für alle Tröpfchen. Montieren Sie zwei Tropfen auf jedes Mikroskop-Objektträger.
  19. Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen bei RT für ~ 2 h und über Nacht bei 4 ° C lagern. Stellen Sie sicher, dass die Folien sind horizontal positioniert und vor Licht geschützt.
  20. Bild der gefärbten gebürtige oder Endpunkt FT ex Vivo Kulturen mit einem confocal Mikroskop oder eine aufrechte Epifluoreszenz-Mikroskop mit einer optischen Stationspunkte Funktion und 20 X oder 40 X Objektiv ausgestattet. Verwenden Sie Kachel-Funktion, um einen größeren Bereich des Gewebes gleichzeitig aufnehmen.

Ergebnisse

Tieferes Verständnis der PDR fibrovaskulärem Gewebeeigenschaften und Protein-Expression hat vor allem auf glasartige Proben und dünne histologischen FT Abschnitte3,15,16,17verlassen. Um eine Methode zur gründlichen Untersuchung der 3D Gewebe Organisation und mehrzelligen pathophysiologischen Prozesse der PDR, entwickeln wir uns vorgenommen, um die chirurgisc...

Diskussion

In Anbetracht der Bedeutung der entsprechenden Gewebe Mikroumgebung für zuverlässige funktionelle Zelle und molekulare mechanistischen Ergebnisse ist es unerlässlich, entsprechende experimentelle Modelle finden, die diese Gewebe-Umfeld zu schaffen. Die hierin beschriebenen ex Vivo PDR Kultur Modell für das Fibrin eingebettet FTs ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen der PDR Pathophysiologie im native, komplex und mehrzelligen Rahmen der PDR klinischen Proben.

Wichtige Schri...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren sind sehr dankbar, die medizinische und chirurgische Netzhaut Kollegen, Krankenschwestern und Belegschaft von diabetischen und vitreoretinalen Chirurgie-Einheit an der Abteilung für Augenheilkunde, Helsinki University Hospital für aktive Teilnahme an der Rekrutierung der Patienten. Wir danken Biomedicum Molecular Imaging Unit für bildgebende Einrichtungen. Wir danken Anastasiya Chernenko für hervorragende technische Unterstützung. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse von Akademie von Finnland (KL), Universität Helsinki (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), finnische Krebs-Institut (KL), Karolinska Institutet (KL), finnische Eye Foundation (SL), Auge und Gewebe-Bank-Stiftung (SL), Maria und Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) und HUCH klinische Forschung Bewilligungen (TYH2018127 nach TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) sowie das Doktoratsstudium in Biomedizin (EG).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
MicroforcepsMedicon07.60.03Used for handling the FTs
Disposable Scalpels - SterileSwann-Morton0513Used for FT dissection
Culture dish, vented, 28 ml (60mm)Greiner Bio-One391-3210Used for dissection and for testing fibrin gel formation
Cell culture plates, 12-wellGreiner Bio-One392-0049Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mLGreiner Bio-One391-3477
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mLGreiner Bio-One525-0384
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDFMilliporeSLGV033RSUsed to sterile-filter the fibrinogen solution
Syringe, 10 mLBraun4606108VUsed to sterile-filter the fibrinogen solution
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mLFisherFB74031
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-wellNunc142475Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture
Cell culture plates, 96-well, U-bottomGreiner Bio-One392-0019Used for whole-mount immunofluorescence
Round/Flat Spatulas, Stainless SteelVWR82027-528Used for whole-mount immunofluorescence
Coverslips 22x22mm #1Menzel/Fisher15727582Used for mounting
Microscope slidesFisherKindler K102Used for mounting
Absorbent paperVWR115-0202Used for mounting
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
PBS tabletsMedicago09-9400-100Used for preparing 1x PBS
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human PlasmaCalbiochem341578
Hanks Balanced Salt SolutionSigma-AldrichH9394-500MLUsed for preparing the fibrinogen and TA solution
Fetal bovine serumGibco10270106Used for preparing the blocking solution
Human SerumSigma-AldrichH4522Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media
Gentamicin Sulfate 10mg/mlBiowestL0011-100
Endothelial cell media MV KitPromocellC-22120Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,  500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL)
Sodium azideSigma-AldrichS2002Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.
AcetoneSigma-Aldrich32201-2.5L-MUsed to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
MethanolSigma-Aldrich32213Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)Sigma-AldrichT9284Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.
Hoechst 33342, 20mMLife Technologies62249For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Eukitt Quick-hardening mounting mediumSigma-Aldrich03989-100mlTOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powderSigma-AldrichT9549-500UN Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powderSigmaA3428Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
NameCompanyCatalog NumberComments
Growth factors
Recombinant human VEGFAR&D Systems293-VE-01050 ng/ mL final concentration
Recombinant human VEGFCR&D Systems752-VC-025200 ng/ mL final concentration
Recombinant human TGFβMilliporeGF3461 ng/ mL final concentration
Recombinant human bFGFMillipore01-10650 ng/ mL final concentration
NameCompanyCatalog NumberComments
Primary antibodies
CD31 (JC70A)DakoM0823Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)DakoM716501-2Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)DakoM070129-2Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68ImmunoWayRLM3161Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E)Cell Signalling9664Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)DakoM731429-2Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAPDakoZ0334Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67Leica MicrosystemsNCL-Ki67pUsed at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1R&D SystemsAF2089Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2MilliporeAB5320Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1ReliaTech102-PA32Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1R&D SystemsAF2727Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)MilliporeMAB3757Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)SigmaC6198Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated
NameCompanyCatalog NumberComments
Secondary antibodies
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgGLife TechnologiesA-21202Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgGInvitrogenA-11012Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgGThermo ScientificA-11057Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgGThermo ScientificA-11036Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgGMolecular ProbesA-21468Used at 1:500 dilution
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopes
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscopeZeissFor imaging of the fresh and fibrin-embedded FT
SZX9 upright dissection stereomicroscopeOlympusFor FT dissection
LSM 780 confocal microscopeZeissFor imaging of whole-mount immunostained FT
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with ApotomeZeissFor imaging of whole-mount immunostained FT

Referenzen

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