Einsatz von Biochip mikrofluidischen Technologie zur Erkennung Serum Allergen-spezifische Immunglobulin E (sIgE)

Zusammenfassung

Dieser Beitrag stellt ein Protokoll zum Nachweis von Serum-spezifische Immunglobulin E mit einem mikrofluidischen Patrone-basierte Chemilumineszenz-System und die Bewertung der Nützlichkeit Allergie Diagnosen.

Zusammenfassung

Allergische Erkrankungen ist häufig bei Erwachsenen und Kindern. Identifikation der auslösenden Allergene ist bedeutsam in Disease-Management und Prävention. Jedoch fehlt einem spezifischen Immunglobulin E (IgE)-Mess-System mit einem hohen Preis-Leistungs-Verhältnis in der Volksrepublik China, vor allem in den Krankenhäusern der Grundversorgung. Dieses Whitepaper beschreibt Verfahren der Grundsatz und Betrieb mit einem mikrofluidischen Chemilumineszenz Patrone-basierten System, um Allergen-spezifischen IgE im Serum zu erkennen. Die Ergebnisse wurden verglichen mit denen von ImmunoCAP (System 1), der Industrie-Standard und die Reproduzierbarkeit des Systems zu erkennen, Patienten zu häufigen Allergenen sensibilisiert wird ausgewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass im Vergleich mit ImmunoCAP (System 1), das BioIC System (System 2) gute Präzision und Feingefühl bei der Aufdeckung von Serum-spezifischen IgE gegen verschiedene Inhalat und Lebensmittel-Allergene, aber mit deutlich niedrigeren Kosten hat. Es dient als eine gute Alternative zum System 1 in Krankenhäusern der Grundversorgung in der Volksrepublik China, die geringere finanzielle Erschwinglichkeit haben.

Einleitung

Die Prävalenz von Allergien hat in den letzten Jahrzehnten stetig zugenommen und 20-30 % der Weltbevölkerung¹betrifft. Identifikation der auslösenden Allergene hat wichtige Bedeutung bei der Bewältigung von Krankheiten. In China da registrierte in-vivo Hauttests Prick nicht in dem Land stehen, in-vitro-Bestimmung des Serum-spezifischen IgE das wichtigste ist und häufig verwendetes Werkzeug für Typ-I-Allergie diagnostiziert². Dies ist vergleichbar mit Praktiken in der westlichen Welt, aber obwohl ImmunoCAP System (System 1), ein Fluoreszenz-Enzym-linked Immunosorbentprobe Grundsystem, als der Goldstandard für in-vitro-Allergie Diagnose³wahrgenommen wird, ist seine Verwendung in China sehr begrenzt aufgrund zu seiner Ausrüstung und Reagenz Höchstkurs. Ein neues alternative Allergie-Diagnose-System mit einem hohen Preis-Leistungs-Verhältnis ist daher dringend erforderlich.

Das BioIC System (System 2) ist ein mikrofluidischen Patrone-basiertes System basiert auf dem Prinzip der Chemilumineszenz für Multiplex-Assays der Serum-spezifischen IgE. Mit einer Größe von 7 cm x 4 cm, besteht die mikrofluidischen Patrone aus drei Schichten aus Spritzguss-Kunststoff. Der obere Teil ist 3 mm starkem transparentem Polycarbonat, das guten Stabilität während der thermischen Montageprozesse trägt. Zusammen mit der 3 mm dicken Bodenschicht besteht aus einem Copolymer aus Acrylnitril, Butadien und Styrol (ABS) sandwiches es 0,5 mm starken Mittelschicht aus Silikon-Kautschuk. In der Farbe Schwarz bietet, die mittlere Schicht niedriger Hintergrund während der Chemilumineszenz-Detektion. Auf der Oberseite der Silica-Gel wird eine dünne Schicht aus Nitrozellulose-Membran (NC-Membran) gesprüht, an der Position entsprechend der Reaktionszone, wodurch das Auffinden verschiedener Allergene Proteine. Der Zweck dieser Studie ist es, die klinische Leistung des mikrofluidischen Systems zur gemultiplexten Bestimmung der Allergen-spezifischen IgE im Serum zu bewerten.

Protokoll

Diese Studie und die Verwendung von humanem Serumproben wurden von der Ethikkommission der erste Affiliated Hospital von Guangzhou Medical University (GYYY-2016-73) genehmigt. Alle Teilnehmer haben ihr schriftliche Einverständnis gegeben, selbständig oder durch ihre Eltern (bei Kindern).

1. grundlegende Informationen der Study group

Hinweis: Die Allergie-Informations-Repository von der State Key Labor von Atemwegserkrankungen (Luft-SKLRD) ist eine große Serumbank innerhalb des Guangzhou Institut of Respiratory Krankenhauses (GIRH) gegründet. In den letzten zehn Jahren initiiert, hat die Luft-SKLRD bereits begonnen zu sammeln und speichern Serumproben von Patienten mit allergischen Erkrankungen, zusammen mit ihre klinische Informationen (Tabelle 1)^4,5. Die vorliegende Studie wurde mit Seren aus der Luft-SKLRD durchgeführt.

1. Suchen Sie in der Luft-SKLRD Datenbank für Sera von Januar 2015 bis Juni 2018 gesammelt und wählen Sie die Patienten mit allergischen Erkrankungen, die empfindlich auf die häufigen Allergenen in der Region gefunden wurden.
2. Sicherstellen Sie, dass alle ausgewählte Patienten allergisch bedingte Krankheiten wie Heuschnupfen und Asthma, allergische Dermatitis oder Urtikaria, und enthält das Serum der Patienten mehrere Serum Allergen-spezifische Immunglobulin E (sIgE) Sensibilisierungen der häufigen Allergenen in dieser Region von System 1 erkannt.
3. Patienten mit unvollständigen medizinischen Aufzeichnungen, die verlorenen zu verfolgen, wer sich weigert, Einwilligung hinsichtlich der Verwendung ihrer Serumproben für wissenschaftliche Zwecke, die mit einer festgestellten Immunschwäche, die derzeit auf Immuntherapie ausschließen oder immunmodulatorische Agenten oder diejenigen gefunden, um parasitäre Infektionen haben.
4. Stellen Sie sicher, dass keine Behandlung oder ein Medikament Rezept vor der Serum-Sammlung gegeben wurde, um Interferenzen mit der Laborbefunde zu minimieren. Alle Serumproben, die nicht die Kriterien erfüllen, wurden abgelehnt.

2. Studie fließen und Messungen von Interesse

Hinweis: Das mikrofluidischen System braucht 100 µL Serum zur Bestimmung 19 Allergene. Venöses Blut (5 mL) wurde von jedem Patienten mit einem Blut-Vakuumbehälter mit trennenden Gel gesammelt. Nach Zentrifugation für 10 min bei 1000 X g, war die obere Schicht zu Testzwecken gesammelt. Nicht verwendete Serum wurde bei-80 ° c gelagert. Vor der Prüfung, das Serum bei Raumtemperatur für 30 min gehalten wurde und wurde mit einem Vortex-Mixer erschüttert. Wiederholte Frost-Tau-Zyklen wurden vermieden.

1. In erster Linie testen die Serumproben für sIgEs auf ganze Allergene Dermatophagoides Pteronyssinus (d1), Dermatophagoides Farinae (d2), Blomia Tropicalis (d201), Katze Dander (e1), Hund Hautschuppen (e5), Bermudagras (g2), Timothy grass) G6), Schaben (i6), Aspergillus Fumigatus (m3), Candida Albicans (m5), Ambrosia (w1), Eiweiß (f1), Milch (f2), Weizen (f4), Erdnuss (f13), Sojabohne (f14), Mandel (f20), Krabben (f23) und Garnelen (f24). Folgen Sie den Anweisungen in Abschnitt 3.
   Hinweis: sIgE Bestimmung erfolgte mit der Allergen-spezifischen IgE Assay kit (siehe die Tabelle der Materialien) und gemessen durch ein Chemilumineszenz-Analyzer.
2. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip drei Proben aus den Reihen der Proben mit genügend Serum (mindestens 900 µL) für eine Reproduzierbarkeit-Studie. Halten alle Bedingungen unverändert, die drei Sera für Allergen-sIgEs an 9 aufeinander folgenden Tagen täglich messen (d. h. insgesamt 100 x 9 = 900 µL Serum).

(3) Teilautomatisierung Testverfahren des mikrofluidischen Systems

Hinweis: Das System 2 ist die Integration der automatischen mikrofluidischen Technologie, Protein Microarray Kaltlicht-Analyse, parallele IgE Analyse und Image-Processing-Technologie. Das Prüfprotokoll gliedert sich in vier Teile: Vorbereitung der Ausrüstung, Probenbeladung, Inkubation und Messung.

1. Vorbereitung der Ausrüstung
   1. Schalten Sie den PC und die Analyzer macht.
      Hinweis: Der ein-/Ausschalter ist auf der linken Seite der Basis.
   2. Starten Sie das LabIT-Programm auf dem PC. Wenn die Dunklen Rahmen Warnungsfenster sich öffnet, klicken Sie auf "OK" , um die Dichtheitsprüfungausgeführt. Danach klicken Sie auf die Center-Logo um die Betriebsschnittstelle zu öffnen.
      Hinweis: Das System erinnert den Benutzer Dichtheitsprüfung ausgeführt, wenn im Standby-für mehr als 24 h Modus.
   3. Überprüfen Sie die Reaktion Temp und CCD (Charge – Coupled Device) Temp an der unteren rechten Ecke des Bildschirms. Die Reaktion Temp sollte 37 ° C ± 1 ° C in ca. 10 Minuten steigen, und die CCD-Temp sollte fallen-15 ° C ± 1 ° C.
   4. Die Dichtheitsprüfung ausgeführt, nachdem die CCD-Temp-15 ° C gesunken ± 1 ° C. Stellen Sie bevor Sie die Dichtheitsprüfung ausführen sicher, es gibt keine anderen Gegenstände im Inneren des Gerätes und schließen Sie die Tür. Klicken Sie auf Extras | Systemtest | Dichtheitsprüfung. Öffnen Sie die Tür nicht während der Prüfung. Wenn der Test abgeschlossen ist, wird das Berichtsfenster angezeigt.
2. Probenaufnahme
   1. Den entsprechenden Reagensbehälter auf der Patrone mikrofluidischen 620 µL Waschpuffer, 120 µL blocking-Puffer, 60 µL Konjugate A und B, 60 µL Substrat A und B und 100 µL Serum Proben hinzufügen.
3. Inkubation
   1. Klicken Sie auf Cartridge ID, verwenden Sie den Barcode-Scanner zu scannen die Seriennummer der Patrone, die Proben-ID eingeben, setzen Sie die Patrone in den Analysator und schließen Sie die Tür, und klicken Sie auf Analyzer und führen Sie , um die Analyse zu starten.
4. Messung
   1. Nach der Messung die Ergebnisse statistischer Software (z. B. Excel) exportieren.
      Hinweis: Nach 30 min Inkubation der Analyzer automatisch führt die Messung und das Ergebnis berichtet.
5. Abschaltung des Analyzers
   1. Entfernen Sie für die routinemäßige Wartung, nach Beendigung des Tests die Patrone und wischen Sie des Analyzer interne Heizung Eisen und Elektromagneten leicht mit 75 % Alkohol.
      Hinweis: Nicht drücken Sie stark oder schütteln Sie der Elektromagnet.
   2. Schließen Sie das Fenster LabIT. Die Temperatur-monitoring-Fenster öffnet sich. Es wird automatisch geschlossen, wenn der CCD auf den Schutzmodus 5 ° C erwärmt. Bis dahin wird es sicher zu schalten Sie den Analyzer und PC sein.
      Hinweis: Schließen Sie nicht manuell die Temperaturüberwachung Fenster, bevor die CCD-Temp auf 5 ° C gestiegen ist, und schalten Sie die Kraft der Analysator noch der PC nicht beim CCD Aufwärmen.

4. Definition der sIgE Reaktivität

Hinweis: Für ein unverdünntes Serum-Probe ist die Reichweite des Systems 2 0,21 – 100 IU/mL.

1. Basierend auf den Schwellenwert von 0,35 IU/mL, betrachten Sie ein sIgE-Niveau mehr als 0,35 IU/mL positiv^6,7sein. Bewerten Sie die Reaktivität der sIgE-Tests als⁸: Klasse 1 (≥0.35 und < 0,70 IU/mL), Klasse 2 (≥0.70 und < 3,50 IU/mL), Klasse 3 (≥3.50 und < 17,50 IU/mL), Klasse 4 (≥17.50 und < 50,00 IU/mL), Klasse 5 (≥50.00 und < 100,00 IU/mL) , und Klasse 6 (≥100.00 IU/mL).

5. statistische Analyse

1. Verwenden Sie ein Histogramm zeigen die positive Rate der 19 Allergene (Abbildung 1) und Levey Jennings-Kurve um die Wiederholbarkeit der Detection System (Abbildung 2)⁹zeigen.
2. Wählen Sie die drei häufigsten Inhalat Allergene und Lebensmittel-Allergene (insgesamt sechs Allergene) und vergleichen Sie die Ergebnisse, die ich System 1, seine klinische diagnostische Leistung^10,11zu bewerten. Gehören Sie die Konkordanz-Rate, Empfindlichkeit, Spezifität, positiven und negativen prädiktiven Werte und die Fläche unter der Empfänger Betrieb Merkmal (ROC)-Kurve (AUC) als die Bewertungskriterien.
3. Gelten Sie Spearman Korrelation Analyse¹² um Korrelationen zwischen den beiden Systemen zu beschreiben und Kappa-Wert für Konsistenz. Kategorisieren den Kappa-Wert als fast perfekt (0,8-1,0), erhebliche (0,6-0,8), mäßig (0,4 – 0,6), Fair (0,2 – 0,4) oder Arm (< 0,2)¹³. Verwenden Sie SPSS 23,0 und MedCalc 11.0 statistische Analyse und definieren P < 0,05 als statistische Signifikanz.

Ergebnisse

Positive Sätze für 19 gemeinsame Allergene
Die Ergebnisse auf 293 Sera sind in Abbildung 3dargestellt. Unter den Schnüffelstoffen Allergene, D. Farinae hatte die höchste positive Rate (80.89 %, 273/293), gefolgt von D. Pteronyssinus (78,84 %, 231/293). Unter den Lebensmittel-Allergene, Krabbe hat die höchste positive Rate (20,48 %, 60/293), gefolgt von 13,65 % (40/293) für Garnelen. Die Gesamt-positive-Rate...

Diskussion

Ähnlich den Ergebnissen von vielen anderen Studien^15,16,17, die Ergebnisse aus dem mikrofluidischen System basierend auf Seren von 293 allergischen Patienten zeigte, dass Haus Hausstaubmilben (einschließlich D. Pteronyssinus, D. Farinae, und B. Tropicalis) sind die wichtigsten Inhalat Allergene führt zu allergischen Erkrankungen im Süden Chinas, während für Lebensmittel, Milch, Erdnuss, Garnelen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agnitio BioIC Analyzer	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	BA-G2000
BioIC Allergen specific-IgE Detection Kit	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DR17A12
BioIC Cartrideg Placement plate	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	T20SET
BioIC Reagent Dispenser	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DS-1
Image two-dimensional barcode machine	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	NLS-HR200
Software Package, LabIT	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	Version 2.4.12
VORTEX-5 Vortex Mixer	Haimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd.	VORTEX-5